Применение генной инженерии в селекции пробиотических микроорганизмов
gennaya_ingheneriya_v_selekcii.pptx
- Размер: 990.0 Кб
- Автор:
- Количество слайдов: 42
Описание презентации Применение генной инженерии в селекции пробиотических микроорганизмов по слайдам
Применение генной инженерии в селекции пробиотических микроорганизмов
ДНК (дезоксирибонуклеиновая кислота) — молекула, обеспечивающая хранение генетиче-ской информации обо всех белках живого организма. Ген — участок ДНК, несущий какую-либо целостную информацию — о строении одной молекулы белка или одной молекулы РНК (рибонуклеиновой кислоты). Генотип — совокупность генов одного организма. Общие понятия
ГММ — генетически модифицированные микроорганизмы — бактерии, дрожжи и мицелиальные грибы, генетический материал которых изменен с использованием методов генной инженерии. Сегодня появляются пробиотики нового поколения, имеющие в своей основе генети-ески модифицированные или, как их еще называют, рекомбинантные штаммы микро-организмов, которым искусственно задаются определенные свойства.
В основе всех достижений генетической инженерии лежит одна из особенностей строения генома бактерий – наличие у них небольших, отличных от хромосомы, кольцевых молекул ДНК, называемых плазмидами.
Плазмиды кодируют не основные для жизнеде-ятельности бактериальной клетки функции, но придающие бактерии преимущества при попадании в неблагоприятные условия существования. Среди фенотипических признаков, сообщаемых бактериальной клетке плазмидами, можно выделить следующие: устойчивость к антибиотикам; продукцию факторов патогенности; способность к синтезу антибиотических веществ; образование колицинов; расщепление сложных органических веществ; образование ферментов рестрикции.
1. Получение изолированного гена. 2. Введение гена в вектор для переноса в орга- низм. 3. Перенос вектора с геном в модифицируемый организм. 4. Преобразование клеток организма. 5. Отбор генетически модифицированных организмов и устранение тех, которые не были успешно модифицированы. Основные этапы создания ГМО
С помощью специальных ферментов – рестриктаз , плазмида, несущая какой-нибудь маркерный ген, например, ген устойчивости к определенному антибиотику, разрезается в строго определенном месте с образованием с каждой стороны нескольких (от одного до пяти) неспаренных оснований – «липких концов» . Получение изолированного гена
• Чтобы встроить ген в плазмидный вектор (небольшая молекула ДНК, способная акцептировать чужеродные фрагменты ДНК и реплицироваться в чужеродном организме), используют ферменты — рестриктазы и лигазы. • С помощью рестриктаз ген и вектор можно разрезать на кусочки. С помощью лигаз такие кусочки можно «склеивать» , соединять в иной комбинации, конструируя новый ген или заключая его в плазмидный вектор. Введение гена в вектор для переноса в чужеродный организм
Такой процесс – включение чужеродной ДНК в бактериальную клетку носит название трансформации, а молекула ДНК – вектор. Это явление иногда встречается в природе, что говорит о том, что трансформация – это естественный биологический процесс. Перенос вектора с геном в модифицируемый организм
Модифицированную плазмиду вводят в клетки микроорганизма, дают им размножиться и выделяют из культуры бактерий точные копии нужной плазмиды. Теперь можно заражать ими клетки других микроорганизмов. Преобразование клеток организма
На селективной среде ведут отбор трансфор-мированных бактериальных клеток, несущих какой-либо селективный маркер, который должен был появиться в процессе образования рекомбинатного микроорганизма. Если, например, вектор содержал ген устойчивости к антибиотику ампициллину, то в селективную среду добавляют этот антибиотик и все выжившие клетки будут содержать данный вектор. Отбор генетически модифицированных организмов
Большой интерес для медицинской практики представляют данные использования генети-чески модифицированных микроорганизмов, перспективных для получения препаратов-пробиотиков, обладающих максимальным спектром заданных полезных свойств. К таким свойствам относится продуцирование бактериями антибиотикоподобных и различ-ных целевых протеинов иммунокомпетентных клеток человека, гены в которых клонированы на различных векторах и переданы в определенный штамм-носитель.
Насчитываются десятки рекомбинантных штаммов микроорганизмов, несущих гены, ответственные за синтез интерферонов, различных типов интерлейкинов, факторов некроза опухолей. • Преимуществом лечебно-профилактических препаратов, создаваемых на основе ГММ, является простота изготовления, не требующая дорогостоящей очистки лекарственной субстанции и получения биомассы, с последующей ее сублимацией, что в свою очередь обеспечивает простоту хранения.
• Пероральный прием является наиболее простым и безопасным способом введения таких препаратов. • Однако широкое внедрение в медицинскую практику генно-модифицированных штаммов микроорганизмов ограничено возможным непредсказуемым влиянием их на организм хозяина (человека или животного), а также на экосистемы. • Активно обсуждается возможность неконтроли-руемого переноса рекомбинантных ДНК новым хозяевам.
• К микроорганизмам, активно исследуемым на предмет возможности создания рекомбинантных пробиотиков, относятся бактерии родов Lactobacillus, Lactococcus, Bifidobacterium, Bacillus, Escherichia и многие другие. • Бактерии рода Bacillus являются одними из наиболее перспективных для создания рекомбинантных пробиотиков благодаря их высокой антагонистической активности и удобству клонирования в них чужеродных генов. • Кроме того, бактерии рода Bacillus не образуют биопленок на слизистых оболочках организма хозяина, вследствие чего лишены способности бесконтрольно постоянно находиться в его организме.
Количество рекомбинантных представителей рода Bacillus в ЖКТ, а также длительность их нахождения в нем регулируются специально отработанными дозами и курсами применения пробиотиков. Российскими и украинскими учеными создан рекомбинантный штамм Bacillus subtilis 2335/105. Введенная в клетку B. subtilis плазмидная ДНК содержит ген интерферона человека, а также гены устойчивости к канамицину. Важнейшей характеристикой рекомбинантных штаммов микроорганизмов — основы пробио-тиков — является стабильность введенной плазмидной ДНК.
Экспериментально доказано, что плазмида, использованная для получения ГММ стабильно сохраняется даже после многоразовых пересевов Bacillus subtilis. Изучение биологических свойств рекомбинант-ного штамма B. subtilis 2335/105 подтвердило синтез интерферона человека, а также высокую антагонистическую активность в отношении патогенных и условно патогенных микро-организмов.
• При использовании оральных лекарственных форм интерферона необходимо защищать лекарственную субстанцию от деградирующего влияния протеолитического содержимого секретов слизистой желудочно-кишечного тракта, при этом используют таблетированные, инкапсулированные формы. • Альтернативным способом доставки интерферона к поверхности слизистой являются препараты на основе живых рекомбинантных бактерий, продуцирующих интерферон. Иммунологическая активность B. Subtilis была показана в исследованиях на добровольцах.
Изучение возможности горизонтальной передачи плазмидной ДНК B. subtilis 2335/105 in vitro и in vivo свидетельствовало о невозможности передачи плазмидной ДНК от B. subtilis 2335/105 другим микроорганизмам — как представителям нормальной микрофлоры, так и патогенам. Проведена также оценка экологической безопасности B. subtilis 2335/105, показавшая, что в случае попадания в окружающую среду штамм не способен к длительному и бесконтрольному росту и, следовательно, к конкуренции с аборигенной микрофлорой.
Из вышеизложенного следует, что генетически модифицированные бактерии B. Subtilis при пероральном применении синтезируют интерферон, проявляющий иммуностиму-лирующее, антивирусное и противоопухолевое действие. Российскими учеными создан штамм B. Subtilis p. BCol. E 2 , способный продуцировать колицин , который проникает через клеточные мембраны патогенных для человека микроорганизмов родов Escherichia, Pseudomonas, Salmonella, Haemophilus, Streptococcus, вызывая деградацию бактериальной ДНК.
• Сконструированный штамм B. subtilis p. BCol. E 2 можно использовать для создания пробиотиков с антибактериальными и антиоксидантными свой-ствами. • Российскими учеными создан рекомбинантный штамм B. licheniformis 2336/105 с помощью трансформации клеток исходного штамма B. licheniformis 2336 специальной плазмидой. Сконструированный штамм способен проду-цировать интерферон человека и характеризуется антагонистической активностью относительно патогенной и условно патогенной микрофлоры. Экспериментально подтверждена стабильность введенной плазмиды и безопасность реком-бинантного штамма.
Бактерии рода Escherichia способствуют гидролизу лактозы, участвуют в расщеплении протеинов и углеводов, метаболизме холестерола, жирных и желчных кислот, синтезируют витамины группы В, биотин, витамин К, никотиновую и пантотеновую кислоты, а также колицины ( вещества белковой природы обладающие свойст-вомубивать микроорганизмы того же рода). Создан рекомбинантный штамм E. coli М 17/p. Colap , способный синтезировать колицин Е 1, отвечающий за его повышенную антагонистическую активность и устойчивость к ампициллину.
Зарубежными исследователями создан рекомби-нантный штамм E. coli CWG 308: p. LNT , в который введена плазмида с генами гликозилтрансферазы. Данный штамм способен синтезировать липопо-лисахариды, которые могут связываться с энтеро-токсинами E. Coli и Vibrio cholerae. Таким образом, штамм E. coli CWG 308: p. LNT является перспективным для создания реком-бинантных токсинсвязывающих пробиотиков, эффективных при лечении и для профилактики диареи, вызванной энтеротоксигенной E. coli и Vibrio cholerae.
• Молочнокислые бактерии, в том числе и представители родов Lactobacillus, Bifidobacterium, Lactococcus, Streptococcus , благодаря своей безопасности для человека и широкой распространенности как в пищевой, так и в фармацевтической промышленности, давно привлекают внимание специалистов генной инженерии. • Однако использованию молочнокислых бактерий в качестве объектов для клонирования препят-ствует слабая по сравнению с другими классическими объектами ( Bacillus subtilis, Escherichia coli, Saccharomyces cerevisiae ) изученность их генетики и подходящих векторов клонирования.
• Сама процедура трансформации до недавнего времени была трудоемкой и малоэффективной. Применение электропорации во многом способ-ствовало развитию генной инженерии лакто-бактерий и лактококков, а соответственно, усовершенствованию методов клонирования. • Электропорация основана на том, что импульсы высокого напряженияобратимо увеличивают проницаемость биомембран.
Схема электропорации
В Японии фирмой Snow Brand Milk Products на основе двух штаммов бифидобактерий — одного, выделенного из тканей человека и активно снижающего уровень холестерола в крови, и другого — из тканей животных, устойчивого к кислороду и кислотам, создан новый штамм бифидобактерий, который фирма планирует использовать для профилактики и лечения атеросклероза и связанных с ним заболеваний сердечно-сосудистой системы.
В современной клинической практике основными методами коррекции повышенного уровня холестерола в сыворотке крови (гиперхолестеринемии, ) являются препараты, угнетающие абсорбцию холестерола и стиролов в кишечнике. К сожалению, все гипохолесте-ринемические лекарственные препараты (снижающие уровень сывороточного холесте-рола) дорогостоящие и обладают рядом побочных эффектов, прежде всего гепато-токсичностью, а также вызывают расстройства пищеварительной и дыхательной, центральной и периферической нервной систем, увеличение массы тела и др.
Во многих экспериментальных исследованиях показано, что молочнокислые бактерии способны снижать уровень холестерола сыворотки. Экспериментально показана высокая холесте-разная активность, т. е. способность снижать уровень сывороточного холестерола, высоко-пробиотических штаммов бактерий родов Lactobacillus и Bifidobacterium в опытах in vitro (в культуральной среде) и in vivo (на модели экспериментальной гиперхолестеролемии у мышей).
Изучение холестеразной активности молочнокис-лых бактерий позволило разместить их по прояв-лению гипохолестеролемического действия в следующий ряд: Lactobacillus casei > Lactobacillus delbrueсkii subsp. bulgaricus > Lactobacillus acidophilus > Bifidobacterium longum > Bifidobacterium bifidum. Также экспериментально было доказано, что различные штаммы лакто- и бифидобактерий способны усиливать свои полезные свойства при их комбинации друг с другом в различных соотношениях.
Проводятся исследования по увеличению холе-стеразной активности молочнокислых бактерий методами генной инженерии. Пробиотики, содержащие холестеролассимили-рующие штаммы молочнокислых бактерий, могут рационально дополнить комплексную терапию больных сердечно-сосудистыми, онкологически-ми и другими заболеваниями.
• Бактерии рода Lactococcus не являются типичными представителями микроорганиз-мов ЖКТ человека, тем не менее пробиотики на их основе толерантны к действию желчи и способны угнетать развитие болезнетворных энтерококков. • Некоторые виды лактококков способны выживать в желудке, но не образуют колонии. Они лизируются в двенадцатиперстной кишке, освобождая при этом большое количество энзимов ( белковые молекулы, катализирующие химические реакции в живых системах ).
Лактококки продуцируют ряд бактериоцинов, угнетающих рост патогенных и условно патогенных микроорганизмов возбудителей острых кишечных инфекций. Низин , один из бактериоцинов лактококков, эффективен против граммпозитивных бактерий, в том числе рода Clostridium , диплококцин — против золотистого стафило-кокка , а также известны лактострепцин, лактококцин и др. Доказано, что лактококки способны угнетать размножение таких микроорганизмов, как Staphylococcus aureus, Listeria monocytogenes, Clostridium perfringens, Salmonella typhimurium, E. Coli и Clostridium dificile.
Все это свидетельствует об актуальности создания рекомбинантных лактококков с улучшенными биологическими свойствами. Сегодня известен ряд пробиотиков, в состав которых входят лактококки: Апибакт, Пролам, Симбилакт, Симбиотик, Симбитер и другие. Нидерландские исследователи, используя методы генной инженерии, создали рекомбинантный штамм Lactococcus lactis MG 1363. В экспери-ментах in vitro и in vivo доказана высокая эффективность пробиотика на основе L. lactis MG 1363 при лечении болезни Крона (тяжелое хроническое воспалительное заболевание кишечника) и язвенного колита.
Ученые США создали рекомбинантный штамм кишечной палочки, «запрограммированный» на синтез глюкагоноподобного пептида. В организме здорового человека этот белок синтезируется клетками кишечника и, среди прочих эффектов, запускает продукцию инсулина в поджелудочной железе. Авторы продемонстрировали, что в лабораторных условиях в присутствии глюкозы секретирующие данный белок бактерии запускают синтез инсулина в культуре клеток кишечника человека.
Введение новых бактерий в диету мышей с искусственно вызванным диабетом за 80 дней снизило уровень глюкозы в крови животных до нормального, в то время как у животных контрольной группы, не употреблявших бактерий, этот показатель оставался повышенным. Бактерии синтезируют определенное количество белка, соответствующее ситуации в организме хозяина, что минимизирует необходимость самостоятельного мониторинга состояния организма. Исследования продолжаются.
Актуальны исследования по созданию рекомбинантных штаммов микроорга-низмов с различным спектром биологи-ческих свойств. ВЫВОД