Применение генной инженерии в селекции пробиотических микроорганизмов

Описание презентации Применение генной инженерии в селекции пробиотических микроорганизмов по слайдам

Применение генной инженерии в селекции пробиотических микроорганизмов  Применение генной инженерии в селекции пробиотических микроорганизмов

 ДНК  (дезоксирибонуклеиновая кислота) — молекула,  обеспечивающая хранение генетиче-ской информации обо всех ДНК (дезоксирибонуклеиновая кислота) — молекула, обеспечивающая хранение генетиче-ской информации обо всех белках живого организма. Ген — участок ДНК, несущий какую-либо целостную информацию — о строении одной молекулы белка или одной молекулы РНК (рибонуклеиновой кислоты). Генотип — совокупность генов одного организма. Общие понятия

 ГММ  — генетически модифицированные микроорганизмы — бактерии,  дрожжи и мицелиальные грибы, ГММ — генетически модифицированные микроорганизмы — бактерии, дрожжи и мицелиальные грибы, генетический материал которых изменен с использованием методов генной инженерии. Сегодня появляются пробиотики нового поколения, имеющие в своей основе генети-ески модифицированные или, как их еще называют, рекомбинантные штаммы микро-организмов, которым искусственно задаются определенные свойства.

 В основе всех достижений генетической инженерии лежит одна из особенностей строения генома бактерий В основе всех достижений генетической инженерии лежит одна из особенностей строения генома бактерий – наличие у них небольших, отличных от хромосомы, кольцевых молекул ДНК, называемых плазмидами.

 Плазмиды кодируют не основные для жизнеде-ятельности бактериальной клетки функции,  но придающие бактерии Плазмиды кодируют не основные для жизнеде-ятельности бактериальной клетки функции, но придающие бактерии преимущества при попадании в неблагоприятные условия существования. Среди фенотипических признаков, сообщаемых бактериальной клетке плазмидами, можно выделить следующие: устойчивость к антибиотикам; продукцию факторов патогенности; способность к синтезу антибиотических веществ; образование колицинов; расщепление сложных органических веществ; образование ферментов рестрикции.

 1.  Получение изолированного гена.  2.  Введение гена в вектор для 1. Получение изолированного гена. 2. Введение гена в вектор для переноса в орга- низм. 3. Перенос вектора с геном в модифицируемый организм. 4. Преобразование клеток организма. 5. Отбор генетически модифицированных организмов и устранение тех, которые не были успешно модифицированы. Основные этапы создания ГМО

 С помощью специальных ферментов – рестриктаз ,  плазмида,  несущая какой-нибудь маркерный С помощью специальных ферментов – рестриктаз , плазмида, несущая какой-нибудь маркерный ген, например, ген устойчивости к определенному антибиотику, разрезается в строго определенном месте с образованием с каждой стороны нескольких (от одного до пяти) неспаренных оснований – «липких концов» . Получение изолированного гена

 • Чтобы встроить ген в плазмидный вектор (небольшая молекула ДНК,  способная акцептировать • Чтобы встроить ген в плазмидный вектор (небольшая молекула ДНК, способная акцептировать чужеродные фрагменты ДНК и реплицироваться в чужеродном организме), используют ферменты — рестриктазы и лигазы. • С помощью рестриктаз ген и вектор можно разрезать на кусочки. С помощью лигаз такие кусочки можно «склеивать» , соединять в иной комбинации, конструируя новый ген или заключая его в плазмидный вектор. Введение гена в вектор для переноса в чужеродный организм

 Такой процесс – включение чужеродной ДНК в бактериальную клетку носит название трансформации, Такой процесс – включение чужеродной ДНК в бактериальную клетку носит название трансформации, а молекула ДНК – вектор. Это явление иногда встречается в природе, что говорит о том, что трансформация – это естественный биологический процесс. Перенос вектора с геном в модифицируемый организм

 Модифицированную плазмиду вводят в клетки микроорганизма,  дают им размножиться и выделяют из Модифицированную плазмиду вводят в клетки микроорганизма, дают им размножиться и выделяют из культуры бактерий точные копии нужной плазмиды. Теперь можно заражать ими клетки других микроорганизмов. Преобразование клеток организма

 На селективной среде ведут отбор  трансфор-мированных бактериальных клеток,  несущих какой-либо селективный На селективной среде ведут отбор трансфор-мированных бактериальных клеток, несущих какой-либо селективный маркер, который должен был появиться в процессе образования рекомбинатного микроорганизма. Если, например, вектор содержал ген устойчивости к антибиотику ампициллину, то в селективную среду добавляют этот антибиотик и все выжившие клетки будут содержать данный вектор. Отбор генетически модифицированных организмов

 Большой интерес для медицинской практики представляют данные использования генети-чески модифицированных микроорганизмов,  перспективных Большой интерес для медицинской практики представляют данные использования генети-чески модифицированных микроорганизмов, перспективных для получения препаратов-пробиотиков, обладающих максимальным спектром заданных полезных свойств. К таким свойствам относится продуцирование бактериями антибиотикоподобных и различ-ных целевых протеинов иммунокомпетентных клеток человека, гены в которых клонированы на различных векторах и переданы в определенный штамм-носитель.

 Насчитываются десятки рекомбинантных штаммов микроорганизмов,  несущих гены,  ответственные за синтез интерферонов, Насчитываются десятки рекомбинантных штаммов микроорганизмов, несущих гены, ответственные за синтез интерферонов, различных типов интерлейкинов, факторов некроза опухолей. • Преимуществом лечебно-профилактических препаратов, создаваемых на основе ГММ, является простота изготовления, не требующая дорогостоящей очистки лекарственной субстанции и получения биомассы, с последующей ее сублимацией, что в свою очередь обеспечивает простоту хранения.

 • Пероральный прием является наиболее простым и безопасным способом введения таких препаратов. • Пероральный прием является наиболее простым и безопасным способом введения таких препаратов. • Однако широкое внедрение в медицинскую практику генно-модифицированных штаммов микроорганизмов ограничено возможным непредсказуемым влиянием их на организм хозяина (человека или животного), а также на экосистемы. • Активно обсуждается возможность неконтроли-руемого переноса рекомбинантных ДНК новым хозяевам.

 • К микроорганизмам, активно исследуемым на предмет возможности создания рекомбинантных пробиотиков,  относятся • К микроорганизмам, активно исследуемым на предмет возможности создания рекомбинантных пробиотиков, относятся бактерии родов Lactobacillus, Lactococcus, Bifidobacterium, Bacillus, Escherichia и многие другие. • Бактерии рода Bacillus являются одними из наиболее перспективных для создания рекомбинантных пробиотиков благодаря их высокой антагонистической активности и удобству клонирования в них чужеродных генов. • Кроме того, бактерии рода Bacillus не образуют биопленок на слизистых оболочках организма хозяина, вследствие чего лишены способности бесконтрольно постоянно находиться в его организме.

 Количество рекомбинантных представителей рода Bacillus в ЖКТ,  а также длительность их нахождения Количество рекомбинантных представителей рода Bacillus в ЖКТ, а также длительность их нахождения в нем регулируются специально отработанными дозами и курсами применения пробиотиков. Российскими и украинскими учеными создан рекомбинантный штамм Bacillus subtilis 2335/105. Введенная в клетку B. subtilis плазмидная ДНК содержит ген интерферона человека, а также гены устойчивости к канамицину. Важнейшей характеристикой рекомбинантных штаммов микроорганизмов — основы пробио-тиков — является стабильность введенной плазмидной ДНК.

 Экспериментально доказано,  что плазмида,  использованная для получения ГММ стабильно сохраняется даже Экспериментально доказано, что плазмида, использованная для получения ГММ стабильно сохраняется даже после многоразовых пересевов Bacillus subtilis. Изучение биологических свойств рекомбинант-ного штамма B. subtilis 2335/105 подтвердило синтез интерферона человека, а также высокую антагонистическую активность в отношении патогенных и условно патогенных микро-организмов.

 • При использовании оральных лекарственных форм интерферона  необходимо защищать лекарственную субстанцию от • При использовании оральных лекарственных форм интерферона необходимо защищать лекарственную субстанцию от деградирующего влияния протеолитического содержимого секретов слизистой желудочно-кишечного тракта, при этом используют таблетированные, инкапсулированные формы. • Альтернативным способом доставки интерферона к поверхности слизистой являются препараты на основе живых рекомбинантных бактерий, продуцирующих интерферон. Иммунологическая активность B. Subtilis была показана в исследованиях на добровольцах.

 Изучение возможности горизонтальной передачи плазмидной ДНК B.  subtilis 2335/105 in vitro и Изучение возможности горизонтальной передачи плазмидной ДНК B. subtilis 2335/105 in vitro и in vivo свидетельствовало о невозможности передачи плазмидной ДНК от B. subtilis 2335/105 другим микроорганизмам — как представителям нормальной микрофлоры, так и патогенам. Проведена также оценка экологической безопасности B. subtilis 2335/105, показавшая, что в случае попадания в окружающую среду штамм не способен к длительному и бесконтрольному росту и, следовательно, к конкуренции с аборигенной микрофлорой.

 Из вышеизложенного следует,  что генетически модифицированные бактерии B.  Subtilis при пероральном Из вышеизложенного следует, что генетически модифицированные бактерии B. Subtilis при пероральном применении синтезируют интерферон, проявляющий иммуностиму-лирующее, антивирусное и противоопухолевое действие. Российскими учеными создан штамм B. Subtilis p. BCol. E 2 , способный продуцировать колицин , который проникает через клеточные мембраны патогенных для человека микроорганизмов родов Escherichia, Pseudomonas, Salmonella, Haemophilus, Streptococcus, вызывая деградацию бактериальной ДНК.

 • Сконструированный штамм B.  subtilis p. BCol. E 2 можно использовать для • Сконструированный штамм B. subtilis p. BCol. E 2 можно использовать для создания пробиотиков с антибактериальными и антиоксидантными свой-ствами. • Российскими учеными создан рекомбинантный штамм B. licheniformis 2336/105 с помощью трансформации клеток исходного штамма B. licheniformis 2336 специальной плазмидой. Сконструированный штамм способен проду-цировать интерферон человека и характеризуется антагонистической активностью относительно патогенной и условно патогенной микрофлоры. Экспериментально подтверждена стабильность введенной плазмиды и безопасность реком-бинантного штамма.

 Бактерии рода Escherichia  способствуют гидролизу лактозы,  участвуют в расщеплении протеинов и Бактерии рода Escherichia способствуют гидролизу лактозы, участвуют в расщеплении протеинов и углеводов, метаболизме холестерола, жирных и желчных кислот, синтезируют витамины группы В, биотин, витамин К, никотиновую и пантотеновую кислоты, а также колицины ( вещества белковой природы обладающие свойст-вомубивать микроорганизмы того же рода). Создан рекомбинантный штамм E. coli М 17/p. Colap , способный синтезировать колицин Е 1, отвечающий за его повышенную антагонистическую активность и устойчивость к ампициллину.

 Зарубежными исследователями создан рекомби-нантный штамм E.  coli CWG 308: p. LNT , Зарубежными исследователями создан рекомби-нантный штамм E. coli CWG 308: p. LNT , в который введена плазмида с генами гликозилтрансферазы. Данный штамм способен синтезировать липопо-лисахариды, которые могут связываться с энтеро-токсинами E. Coli и Vibrio cholerae. Таким образом, штамм E. coli CWG 308: p. LNT является перспективным для создания реком-бинантных токсинсвязывающих пробиотиков, эффективных при лечении и для профилактики диареи, вызванной энтеротоксигенной E. coli и Vibrio cholerae.

 • Молочнокислые бактерии,  в том числе и представители родов Lactobacillus,  Bifidobacterium, • Молочнокислые бактерии, в том числе и представители родов Lactobacillus, Bifidobacterium, Lactococcus, Streptococcus , благодаря своей безопасности для человека и широкой распространенности как в пищевой, так и в фармацевтической промышленности, давно привлекают внимание специалистов генной инженерии. • Однако использованию молочнокислых бактерий в качестве объектов для клонирования препят-ствует слабая по сравнению с другими классическими объектами ( Bacillus subtilis, Escherichia coli, Saccharomyces cerevisiae ) изученность их генетики и подходящих векторов клонирования.

 • Сама процедура трансформации до недавнего времени была трудоемкой и малоэффективной.  Применение • Сама процедура трансформации до недавнего времени была трудоемкой и малоэффективной. Применение электропорации во многом способ-ствовало развитию генной инженерии лакто-бактерий и лактококков, а соответственно, усовершенствованию методов клонирования. • Электропорация основана на том, что импульсы высокого напряженияобратимо увеличивают проницаемость биомембран.

Схема электропорации Схема электропорации

 В Японии фирмой Snow Brand Milk Products на основе двух штаммов бифидобактерий В Японии фирмой Snow Brand Milk Products на основе двух штаммов бифидобактерий — одного, выделенного из тканей человека и активно снижающего уровень холестерола в крови, и другого — из тканей животных, устойчивого к кислороду и кислотам, создан новый штамм бифидобактерий, который фирма планирует использовать для профилактики и лечения атеросклероза и связанных с ним заболеваний сердечно-сосудистой системы.

 В современной клинической практике основными методами коррекции повышенного уровня холестерола в сыворотке крови В современной клинической практике основными методами коррекции повышенного уровня холестерола в сыворотке крови (гиперхолестеринемии, ) являются препараты, угнетающие абсорбцию холестерола и стиролов в кишечнике. К сожалению, все гипохолесте-ринемические лекарственные препараты (снижающие уровень сывороточного холесте-рола) дорогостоящие и обладают рядом побочных эффектов, прежде всего гепато-токсичностью, а также вызывают расстройства пищеварительной и дыхательной, центральной и периферической нервной систем, увеличение массы тела и др.

 Во многих экспериментальных исследованиях показано,  что молочнокислые бактерии способны снижать уровень холестерола Во многих экспериментальных исследованиях показано, что молочнокислые бактерии способны снижать уровень холестерола сыворотки. Экспериментально показана высокая холесте-разная активность, т. е. способность снижать уровень сывороточного холестерола, высоко-пробиотических штаммов бактерий родов Lactobacillus и Bifidobacterium в опытах in vitro (в культуральной среде) и in vivo (на модели экспериментальной гиперхолестеролемии у мышей).

 Изучение холестеразной активности молочнокис-лых бактерий позволило разместить их по  прояв-лению гипохолестеролемического действия Изучение холестеразной активности молочнокис-лых бактерий позволило разместить их по прояв-лению гипохолестеролемического действия в следующий ряд: Lactobacillus casei > Lactobacillus delbrueсkii subsp. bulgaricus > Lactobacillus acidophilus > Bifidobacterium longum > Bifidobacterium bifidum. Также экспериментально было доказано, что различные штаммы лакто- и бифидобактерий способны усиливать свои полезные свойства при их комбинации друг с другом в различных соотношениях.

 Проводятся исследования по увеличению холе-стеразной активности молочнокислых бактерий  методами генной инженерии. Проводятся исследования по увеличению холе-стеразной активности молочнокислых бактерий методами генной инженерии. Пробиотики, содержащие холестеролассимили-рующие штаммы молочнокислых бактерий, могут рационально дополнить комплексную терапию больных сердечно-сосудистыми, онкологически-ми и другими заболеваниями.

 • Бактерии рода Lactococcus  не являются типичными представителями микроорганиз-мов ЖКТ человека, тем • Бактерии рода Lactococcus не являются типичными представителями микроорганиз-мов ЖКТ человека, тем не менее пробиотики на их основе толерантны к действию желчи и способны угнетать развитие болезнетворных энтерококков. • Некоторые виды лактококков способны выживать в желудке, но не образуют колонии. Они лизируются в двенадцатиперстной кишке, освобождая при этом большое количество энзимов ( белковые молекулы, катализирующие химические реакции в живых системах ).

 Лактококки продуцируют ряд бактериоцинов,  угнетающих рост патогенных и условно патогенных микроорганизмов возбудителей Лактококки продуцируют ряд бактериоцинов, угнетающих рост патогенных и условно патогенных микроорганизмов возбудителей острых кишечных инфекций. Низин , один из бактериоцинов лактококков, эффективен против граммпозитивных бактерий, в том числе рода Clostridium , диплококцин — против золотистого стафило-кокка , а также известны лактострепцин, лактококцин и др. Доказано, что лактококки способны угнетать размножение таких микроорганизмов, как Staphylococcus aureus, Listeria monocytogenes, Clostridium perfringens, Salmonella typhimurium, E. Coli и Clostridium dificile.

 Все это свидетельствует об актуальности создания рекомбинантных лактококков  с  улучшенными биологическими Все это свидетельствует об актуальности создания рекомбинантных лактококков с улучшенными биологическими свойствами. Сегодня известен ряд пробиотиков, в состав которых входят лактококки: Апибакт, Пролам, Симбилакт, Симбиотик, Симбитер и другие. Нидерландские исследователи, используя методы генной инженерии, создали рекомбинантный штамм Lactococcus lactis MG 1363. В экспери-ментах in vitro и in vivo доказана высокая эффективность пробиотика на основе L. lactis MG 1363 при лечении болезни Крона (тяжелое хроническое воспалительное заболевание кишечника) и язвенного колита.

 Ученые США создали рекомбинантный штамм кишечной палочки,  «запрограммированный»  на синтез Ученые США создали рекомбинантный штамм кишечной палочки, «запрограммированный» на синтез глюкагоноподобного пептида. В организме здорового человека этот белок синтезируется клетками кишечника и, среди прочих эффектов, запускает продукцию инсулина в поджелудочной железе. Авторы продемонстрировали, что в лабораторных условиях в присутствии глюкозы секретирующие данный белок бактерии запускают синтез инсулина в культуре клеток кишечника человека.

  Введение новых бактерий в диету мышей с искусственно вызванным диабетом за 80 Введение новых бактерий в диету мышей с искусственно вызванным диабетом за 80 дней снизило уровень глюкозы в крови животных до нормального, в то время как у животных контрольной группы, не употреблявших бактерий, этот показатель оставался повышенным. Бактерии синтезируют определенное количество белка, соответствующее ситуации в организме хозяина, что минимизирует необходимость самостоятельного мониторинга состояния организма. Исследования продолжаются.

  Актуальны исследования по созданию  рекомбинантных штаммов микроорга-низмов с различным спектром биологи-ческих Актуальны исследования по созданию рекомбинантных штаммов микроорга-низмов с различным спектром биологи-ческих свойств. ВЫВОД