Прикладная иммунология Реакции прикладной иммунологии Фото Кузнецова О.

Прикладная иммунология Реакции прикладной иммунологии Фото Кузнецова О. Ю. Кафедра микробиологии и вирусологии Ив. ГМА д. б. н. Кузнецов О. Ю. 2007 ©

Лабораторные реакции в микробиологии § Обнаружение и идентификация возбудителей инфекционных заболеваний представляет собой одну из важнейших задач микробиологии. § В настоящее время практически невозможно себе представить выполнение лечебных мероприятий без проведения предварительного лабораторного исследования пациента, контроля динамики инфекционного процесса и контроля выздоровления и восстановления иммунного статуса человека.

Все иммуномикробиологические реакции можно подразделить на 3 группы: • ИР, основанные на прямом взаимодействии антигена с антителом (реакции агглютинации, преципитации, гемагглютинации, иммобилизации и др. ); • ИР, основанные на опосредованном взаимодействии антигена с антителом (реакции непрямой гемагглютинации, коагглютинации, латекс-агглютинации, угольной аггломерации, бентонит-агглютинации, связывания комплемента и др. ); • ИР с использованием меченых антител или антигенов (метод флюоресцирующих антител, иммуноферментный и радиоиммунный анализы, спиниммунологический и другие методы).

При протекании реакций в иммунологических методах характерно наличие следующих фаз: 1. специфическая (невидимая) фаза - связывание детерминантной группы (эпитопа) антигена с паратопом - активным центром иммуноглобулина; 2. неспецифическая (видимая) фаза - образующийся комплекс антиген+антитело (АГ+AT) утрачивает растворимость и выпадает в осадок в виде хлопьев. Однако, это явление возможно лишь в электролитной среде, например в 0, 85% растворе натрия хлорида (физ. раствор).

В микробиологической практике нашли широкое применение реакции взаимодействия антигенов с антителами иммунных сывороток Эти реакции получили название серологических, так как для их постановки используют сыворотку (serum), содержащую антитела. Данные антитела появляются в сыворотке в ходе иммунного ответа макроорганизма на внедрение в него микроорганизмов, несущих определенные чужеродные антигенные комплексы.

Для постановки специфической реакции взаимодействия антител и антигенов необходимо наличие следующих компонентов: ¢ исследуемой сыворотки крови, т. е. наличие антител (агглютининов); ¢ антигена (агглютиногена) – взвесь микробов определенной концентрации (антигенный диагностикум); ¢ электролит (0, 85% раствор Na. Cl).

Реакции взаимодействия между двухвалентными антителами и антигенами подразделяются на реакции агглютинации и реакции преципитации § В реакциях агглютинации антигеном является корпускула – часть клетки, целая клетка микроорганизмов § В реакциях преципитации антигенами являются молекулы белка, который находится в коллоидном состоянии или молекулы полисахаридов В реакциях взаимодействия могут участвовать двухвалентные и одновалентные антитела

Реакция агглютинации Агглютинацией называется склеивание микробов или других клеток при воздействии на них специфических антител в присутствии электролита. Реакция агглютинации бывает специфической и неспецифической. Специфическая реакция агглютинации характеризуется высокой специфичностью взаимодействия между антителами сыворотки и антигенами различных клеток. Именно данный тип реакции агглютинации представляет большой практический интерес для диагностики различных заболеваний и возбудителей. Неспецифическая реакция агглютинации бывает спонтанная и кислотная.

Взаимодействие двухвалентных антител с антигенными комплексами – образование «решетки» антиген-антитело по Поллингу. Комплексы антиген-антитело образуют решетку, которая хлопкуется и выпадает в осадок. Антитела Осадок виден невооруженным глазом Микроорганизмы На поверхности находятся антигенные комплексы

Реакцию агглютинации (РА) применяют для диагностики многих инфекционных заболеваний. Как и в других прикладных реакциях иммунитета, неизвестный компонент определяют по заведомо известному Она бывает двух типов (реакция агглютинации по типу Грубера и по типу Видаля) и ставится в целях: 1. определение вида или типа микроба – реакция агглютинации по типу Грубера; 2. обнаружение антител в сыворотке крови больного - реакция агглютинации по типу Видаля.

В получении агглютинирующих сывороток человеку помогают различные животные ¢ Для приготовления агглютинирующих сывороток животных (мышей, морских свинок, кроликов, баранов, лошадей и др. ) подвергают гипериммунизации. ¢ Им вводят 5 -7 раз подкожно, а затем внутривенно в возрастающих концентрациях взвесь убитых, а последние 3 инъекции – живых микробов. ¢ Интервалы между инъекциями колеблются от 2 до 5 -7 дней. ¢ Через неделю последнего введения микробных взвесей, т. е. после окончания иммунизации, делают пробное кровопускание и проводят реакцию агглютинации для определения титра сыворотки. Титр агглютинирующей сыворотки - максимальное разведение сыворотки, которое дает устойчивую реакцию агглютинации с соответствующим гомологичным микробом.

Реакция истощения групповых антител по Кастелани (1902 г. ) А – групповые антигены, встречаются у группы микроорганизмов А В С В – видовые антигены встречаются только у определенного вида микроорганизмов А В D А В Воротка F агглютиниру ющая кроличья сухая С – типовые антигены только у одного типового Титр О 1: 3200 штамма микроорганизмов Наиболее специфичными являются типовые антигены. Супернатант, Сыворотка с нашем случае А, D, FС- антигены) (в антителами С, В, содержащий типовые антитела С титруют, т. е. определяют титр агглютинирующей Центрифугирование после добавления к сыворотке сыворотки и фасуют в Микробная клетка представляет собой сложный комплекс ампулы антигенов близкородственных в антигеном отношении штаммов по групповым и видовым антигенам Осадок - агглютинат

Реакция агглютинации по типу Грубера § Реакция агглютинации по типу Грубера ставится с целью обнаружения (идентификации) неизвестного антигена с помощью известных антител (сывороток) § Реакция агглютинации по типу Грубера бывает ориентировочная (на стекле) и развернутая для окончательной идентификации неизвестного возбудителя по его антигенной структуре § В ориентировочной реакции по типу Грубера используются агглютинирующие сыворотки разведенные предварительно физиологическим раствором 1: 10

? Культура идентична сыворотке Контроль Физиологический раствор Неизвестная вновь выделенная неидентифицированная культура, предположительно из брюшнотифозной группы т ки оро Salmonella paratyphy B с ыв ие ющ и ру Salmonella paratyphy A н ю ти гл Аг Salmonella typhy

Ампула с агглютинирующей сывороткой титр О 1: 3200 Рабочее разведение Воротка Бактериальная культура сыворотки 1: 50 агглютиниру ющая кроличья сухая Титр О 1: 3200 1 мл Физ. раствор контроль 1: 100 1: 200 1: 400 1: 800 1: 1600 1: 3200 сыворотки культуры 1 мл Дез. раствор Реакция положительна – если протекает свыше 2/3 титра и до титра, указанного на ампуле. Прореагировали типовые антитела и антигены микроорганизма

Реакция агглютинации по типу Видаля ¢ Ставится с целью определения (обнаружения) присутствия в сыворотке крови больного антител с помощью заведомо известных антигенов (диагностикумов). ¢ Диагностикум – взвесь убитых микроорганизмов, сохранивших свою антигенную структуру. ¢ Реакция ставится не ранее 10 дня с начала болезни. ¢ Реакция ставится дважды с интервалом в 5 -7 дней, т. е. в динамике (реакция с парными сыворотками). ¢ Реакция положительна при нарастании титра антител. ¢ Диагностический титр реакции 1: 200 – 1: 400 (лабораторный Видаль).

1 мл Диагностикум 1 -2 капли 1 мл Рабочее разведение Физ. раствор 1: 50 сыворотки 1: 100 1: 200 1: 400 1: 800 1 мл Затем в каждую пробирку, кроме Реакция протекает при 37°С в пробирки с контролем сыворотки, Контроль добавляют по 1 – 2 агглютинации на часов термостате 18 -20 брюшнотифозную диагностикума В классической реакции капли сыворотки группу диагностикума используются следующие диагностикумы: О – диагностикум брюшного тифа Реакция положительна, если происходит реакция агглютинации в Н – диагностикум брюшного тифа (лабораторный Видаль) разведениях 1: 200 – 1: 400 Также смотрят за динамикой процесса в реакции с. Дез. раствор ОН – диагностикум паратифа А парными сыворотками, титр агглютининов нарастает – идет дальнейшая активизация ОН – диагностикум паратифа В инфекционного процесса, титр агглютининов уменьшается – затухание инфекционного процесса На рисунке была представлена реакция только с одним диагностикумом

Реакция преципитации Титр преципитирующей сыворотки – это максимальное разведение антигена, которое дает устойчивую реакцию с антителами сыворотки В реакции участвуют мелкодисперсные антигены (преципитиногены), которые связываются с соответствующими антителами (преципитинами). Посредством реакции преципитации можно выявить антиген-белок в разведении 1: 100 000 и даже 1: 300 000, т. е. в столь малых количествах, в которых он не обнаруживается химическим путем. Это качественный метод исследования. В микробиологической практике для диагностики ряда инфекционных заболеваний бактериальной и вирусной природы (эпидемический цереброспинальный менингит, сибирская язва, туляремия, чума, натуральная оспа, полиомиелит, аденовирусные заболевания и др. ).

Реакция Асколи для обнаружения антигена возбудителя сибирской язвы (пример реакции преципитации) После некоторой временной выдержки и непродолжительного термостатирования проверяют исход реакции и После этого медленно аккуратно сверху по стенке с Если антиген соответствует антителам, помощью пипетки наслаивают содержащимся в сыворотке, то происходит исследуемый материал появление преципитата – видимого легкого кольца на месте контакта между сывороткой и антигенсодержащей жидкостью, т. е. в тестируемой Вначале преципитационную пробирку жидкости есть искомые антигены заполняют преципитирующей сывороткой

Реакции с одновалентными антителами

Реакция титрования комплемента Физиологический раствор (мл) 1, 45 1, 4 1, 35 1, 3 1, 25 1, 2 1, 15 1, 1 1, 5 Комплемент 0, 5 мл Комплемент по 0, 05 0, 15 0, 25 0, 35 0, 4 контроль Гемолитическая система по 1 мл в каждую пробирку Осадка нет – полный лизис Осадок эритроцитов Титр комплемента

Реакция связывания комплемента болен t° + + 2 2 часа Осадок эритроцитов t° + + 2 2 часа здоров

Реакция Кумбса 1 Эритроцит Э 2 Э Антиглобулин Неполные антитела Э Прямая реакция 3 2 1 Э Непрямая реакция

Воротка агглютиниру ющая кроличья сухая Титр О 1: 3200