Прикладная иммунология Реакции прикладной иммунологии Фото Кузнецова О

Прикладная иммунология Реакции прикладной иммунологии Фото Кузнецова О. Ю. Кафедра микробиологии и вирусологии Ив. ГМА проф. , д. б. н. Кузнецов О. Ю. 2009 -2013 ©

Лабораторные реакции в микробиологии § Обнаружение и идентификация возбудителей инфекционных заболеваний представляет собой одну из важнейших задач микробиологии. § В настоящее время практически невозможно себе представить выполнение лечебных мероприятий без проведения предварительного лабораторного исследования пациента, контроля динамики инфекционного процесса и контроля выздоровления и восстановления иммунного статуса человека.

Все иммуномикробиологические реакции можно подразделить на 3 группы: • ИР, основанные на прямом взаимодействии антигена с антителом (реакции агглютинации, преципитации, гемагглютинации, иммобилизации и др. ); • ИР, основанные на опосредованном взаимодействии антигена с антителом (реакции непрямой гемагглютинации, коагглютинации, латекс-агглютинации, угольной аггломерации, бентонит-агглютинации, связывания комплемента и др. ); • ИР с использованием меченых антител или антигенов (метод флюоресцирующих антител, иммуноферментный и радиоиммунный анализы, спиниммунологический и другие методы).

При протекании реакций в иммунологических методах характерно наличие следующих фаз: 1. специфическая (невидимая) фаза - связывание детерминантной группы (эпитопа) антигена с паратопом - активным центром иммуноглобулина; 2. неспецифическая (видимая) фаза - образующийся комплекс антиген+антитело (АГ+AT) утрачивает растворимость и выпадает в осадок в виде хлопьев. Однако, это явление возможно лишь в электролитной среде, например в 0, 85% растворе натрия хлорида (физ. раствор).

В микробиологической практике нашли широкое применение реакции взаимодействия антигенов с антителами иммунных сывороток Эти реакции получили название серологических, так как для их постановки используют сыворотку (serum), содержащую антитела. Данные антитела появляются в сыворотке в ходе иммунного ответа макроорганизма на внедрение в него микроорганизмов, несущих определенные чужеродные антигенные комплексы.

Для постановки специфической реакции взаимодействия антител и антигенов необходимо наличие следующих компонентов: ¢ исследуемой сыворотки крови, т. е. наличие антител (агглютининов); ¢ антигена (агглютиногена) – взвесь микробов определенной концентрации (антигенный диагностикум); ¢ электролит (0, 85% раствор Na. Cl).

Реакции взаимодействия между двухвалентными антителами и антигенами подразделяются на реакции агглютинации и реакции преципитации § В реакциях агглютинации антигеном является корпускула – часть клетки, целая клетка микроорганизмов § В реакциях преципитации антигенами являются молекулы белка, который находится в коллоидном состоянии или молекулы полисахаридов В реакциях взаимодействия могут участвовать двухвалентные и одновалентные антитела

Реакция агглютинации Агглютинацией называется склеивание микробов или других клеток при воздействии на них специфических антител в присутствии электролита. Реакция агглютинации бывает специфической и неспецифической. Специфическая реакция агглютинации характеризуется высокой специфичностью взаимодействия между антителами сыворотки и антигенами различных клеток. Именно данный тип реакции агглютинации представляет большой практический интерес для диагностики различных заболеваний и возбудителей. Неспецифическая реакция агглютинации бывает спонтанная и кислотная.

Взаимодействие двухвалентных антител с антигенными комплексами – образование «решетки» антиген-антитело по Поллингу. Комплексы антиген-антитело образуют решетку, которая хлопкуется и выпадает в осадок. Антитела Осадок виден невооруженным глазом Микроорганизмы На поверхности находятся антигенные комплексы

Реакцию агглютинации (РА) применяют для диагностики многих инфекционных заболеваний. Как и в других прикладных реакциях иммунитета, неизвестный компонент определяют по заведомо известному Она бывает двух типов (реакция агглютинации по типу Грубера и по типу Видаля) и ставится в целях: 1. определение вида или типа микроба – реакция агглютинации по типу Грубера; 2. обнаружение антител в сыворотке крови больного - реакция агглютинации по типу Видаля.

В получении агглютинирующих сывороток человеку помогают различные животные ¢ ¢ Для приготовления агглютинирующих сывороток животных (мышей, морских свинок, кроликов, баранов, лошадей и др. ) подвергают гипериммунизации. Им вводят 5 -7 раз подкожно, а затем внутривенно в возрастающих концентрациях взвесь убитых, а последние 3 инъекции – живых микробов. Интервалы между инъекциями колеблются от 2 до 5 -7 дней. Через неделю последнего введения микробных взвесей, т. е. после окончания иммунизации, делают пробное кровопускание и проводят реакцию агглютинации для определения титра сыворотки. Титр агглютинирующей сыворотки - максимальное разведение сыворотки, которое дает устойчивую реакцию агглютинации с соответствующим гомологичным микробом.

Реакция истощения групповых антител по Кастелани (1902 г. ) А – групповые антигены, встречаются у группы микроорганизмов В – видовые антигены встречаются только у определенного вида микроорганизмов С – типовые антигены только у одного типового штамма микроорганизмов А В С А В D А В F Воротка агглютиниру ющая кроличья сухая Титр О 1: 3200 Наиболее специфичными являются типовые антигены Супернатант, содержащий типовые (в антителами С, В, Сыворотка с нашем случае А, D, FС- антигены) Центрифугирование после добавления к сыворотке Микробная клетка представляет собой сложный близкородственных в антигеном отношении штаммов по групповым и видовым антигенам антитела С титруют, т. е. определяют титр агглютинирующей сыворотки и фасуют в комплекс ампулы антигенов Осадок агглютинат

Реакция агглютинации по типу Грубера § Реакция агглютинации по типу Грубера ставится с целью обнаружения (идентификации) неизвестного антигена с помощью известных антител (сывороток) § Реакция агглютинации по типу Грубера бывает ориентировочная (на стекле) и развернутая для окончательной идентификации неизвестного возбудителя по его антигенной структуре § В ориентировочной реакции по типу Грубера используются агглютинирующие сыворотки разведенные предварительно физиологическим раствором 1: 10

? Культура идентична сыворотке Контроль Физиологический раствор Неизвестная вновь выделенная неидентифицированная культура, предположительно из брюшнотифозной группы т ро Salmonella paratyphy B е и Salmonella paratyphy A Salmonella typhy и ющ ру гл Аг ю н ти о ыв с ки

Ампула с агглютинирующей сывороткой титр О 1: 3200 Рабочее разведение Бактериальная культура сыворотки 1: 50 Воротка агглютиниру ющая кроличья сухая Титр О 1: 3200 1 мл Физ. раствор 1 мл контроль 1: 100 1: 200 1: 400 1: 800 1: 1600 1: 3200 сыворотки культуры 1 мл Дез. раствор Реакция положительна – если протекает свыше 2/3 титра и до титра, указанного на ампуле. Прореагировали типовые антитела и антигены микроорганизма

Реакция агглютинации по типу Видаля ¢ ¢ ¢ Ставится с целью определения (обнаружения) присутствия в сыворотке крови больного антител с помощью заведомо известных антигенов (диагностикумов). Диагностикум – взвесь убитых микроорганизмов, сохранивших свою антигенную структуру. Реакция ставится не ранее 10 дня с начала болезни. Реакция ставится дважды с интервалом в 5 -7 дней, т. е. в динамике (реакция с парными сыворотками). Реакция положительна при нарастании титра антител. Диагностический титр реакции 1: 200 – 1: 400 (лабораторный Видаль).

1 мл Диагностикум 1 -2 капли 1 мл Рабочее разведение Физ. раствор 1: 50 сыворотки 1: 100 1: 200 1: 400 1: 800 1 мл Затем в каждую пробирку, кроме Контроль Реакция протекает при 37°С в пробирки с контролем сыворотки, термостате 18 -20 брюшнотифозную диагностикума добавляют по 1 – 2 агглютинации на часов В классической реакции капли группу сыворотки диагностикума используются следующие диагностикумы: О – диагностикум брюшного тифа Реакция положительна, если происходит реакция агглютинации в разведениях 1: 200 – 1: 400 Н – диагностикум брюшного тифа (лабораторный Видаль) Также смотрят за динамикой процесса в реакции с. Дез. раствор парными сыворотками, ОН – диагностикум паратифа А титр агглютининов нарастает – идет дальнейшая активизация ОН – диагностикум паратифа В инфекционного процесса, титр агглютининов уменьшается – затухание инфекционного процесса На рисунке была представлена реакция только с одним диагностикумом

Реакция преципитации Титр преципитирующей сыворотки – это максимальное разведение антигена, которое дает устойчивую реакцию с антителами сыворотки В реакции участвуют мелкодисперсные антигены (преципитиногены), которые связываются с соответствующими антителами (преципитинами). Посредством реакции преципитации можно выявить антиген-белок в разведении 1: 100 000 и даже 1: 300 000, т. е. в столь малых количествах, в которых он не обнаруживается химическим путем. Это качественный метод исследования. В микробиологической практике для диагностики ряда инфекционных заболеваний бактериальной и вирусной природы (эпидемический цереброспинальный менингит, сибирская язва, туляремия, чума, натуральная оспа, полиомиелит, аденовирусные заболевания и др. ).

Реакция Асколи для обнаружения антигена возбудителя сибирской язвы (пример реакции преципитации) После некоторой временной выдержки и непродолжительного термостатирования проверяют исход реакции и После этого медленно аккуратно сверху по стенке с Если антиген соответствует антителам, помощью пипетки наслаивают содержащимся в сыворотке, то происходит исследуемый материал появление преципитата – видимого легкого кольца на месте контакта между сывороткой и антигенсодержащей жидкостью, т. е. в тестируемой Вначале преципитационную пробирку жидкости есть искомые антигены заполняют преципитирующей сывороткой

Реакции с одновалентными антителами ¢ Реакция титрования комплемента ¢ Реакция связывания комплемента ¢ Реакция Кумбса (прямая и обратная) Это наиболее часто употребляемые в лабораторных условиях реакции

Реакция титрования комплемента Физиологический раствор (мл) 1, 45 1, 4 1, 35 1, 3 1, 25 1, 2 1, 15 1, 1 1, 5 Комплемент 0, 5 мл Комплемент по 0, 05 0, 15 0, 25 0, 35 0, 4 контроль Гемолитическая система по 1 мл в каждую пробирку Осадка нет – полный лизис Осадок эритроцитов Титр комплемента

Реакция связывания комплемента t° + АГ Болен t° + + 2 часа t° + АГ 2 часа t° + 2 часа Осадок эритроцитов + 2 часа Здоров

Реакция Кумбса 1 Эритроцит 2 Э Э Антиглобулин Неполные антитела Э Э 3 Э 2 Прямая реакция 1 Э Непрямая реакция

NASBA – Nucleic Acid Sequence-Based Amplification ¢ Сравнение чувствительности методов ПЦР и NASBA Метод NASBA как минимум в 100 раз чувствительнее чем ПЦР!

Основные характеристики метода NASBA ¢ ¢ ¢ Мишень: мультикопийная одноцепочечная р. РНК (бактерии, простейшие) – высокая аналитическая чувствительность Гибридизационная детекция – высокая специфичность Низкая контаминационная опасность

NASBA – Nucleic Acid Sequence-Based Amplification Сравнение чувствительности методов ПЦР и NASBA ПЦР NASBA Хромосомная ДНК Плазмиды, ДНК Рибосомальная РНК 1 копия на клетку 5 -20 копий на клетку 103 -104 копий на клетку

Применение NASBA- Real-Time ¢ ¢ ¢ Диагностика безусловно-патогенных ИППП Анализ экспрессии генов-предикторов прогрессирования заболевания Контроль эрадикации (устранения, удаления, элиминации) возбудителей. Контроль излечиваемости. Анализ дискордантных (несовпадаемых) результатов. Контроль эффективности применения антибактериальной терапии. Количество рибосом (р. РНК) отражает степень активности (жизнеспособности) клеток. Разрушение РНК происходит значительно быстрее ДНК.

§ метод детекции нуклеиновых кислот основан на одновременном действии трех ферментов: обратной транскриптазы вируса миобластомы птиц, РНК-азы Н и РНК-полимеразы Т 7. При помощи этих ферментов удается получить > 109 копий интересующего участка гена вируса в течение 90 минут. В отличие от ПЦР амплификация в NASBA протекает изотермически - при +41°С, что позволяет отказаться от оборудования, обеспечивающего циклическое изменение высоких температур. Метод запатентован канадской фирмой “Cangen corporation”. Фирма “Органон Текника” (“Organon Teknika”) разработала метод выявления ДНК ВГВ и РНК ВГВ на основе NASBA. Кроме того, этот принцип реакции включен в перспективные разработки фирмы “Нуклисенс” (“Nuclisens”), объединяя в единое целое: метод экстракции нуклеиновой кислоты на силикагеле; метод NASBA и регистрации амплифицированного продукта при помощи электрохемилюминесценции.

БЛАГОДАРЮ ЗА ВНИМАНИЕ!