Приготовление микроскопических препаратов и окраска мазков Мультимедийная программа

Приготовление микроскопических препаратов и окраска мазков Мультимедийная программа в поддержку практического занятия Составитель: Шишкина Л. С.

Микроскопический метод исследования.

Микроскопия нативных (живых) препаратов Цель: определение подвижности микробов Методы: • препарат «раздавленной капли» • препарат «висячей капли»

Микроскопия окрашенных препаратов Цель: Изучение бактерий в окрашенных препаратах дает возможность четко рассмотреть морфологию (размер, цвет, форму, взаиморасположение) бактериальной клетки, иногда детали ее структуры.

Приготовление мазков. • Стекла для приготовления мазков должны быть обезжирены!!!! • Рядом с мазком на обратной стороне стекла ставят номер исследуемого материала!!! Техника приготовления мазков определяется характером исследуемого материала. Материал для приготовления мазков: 1. жидкая культура микроорганизмов (бульонная или инокулят) 2. плотная культура (с плотной питательной среды) 3. клинический материал (мокрота, гной, моча, кровь) Приготовление мазка включает 4 этапа: 1. Подготовка стекла 2. Формирование мазка 3. Высушивание мазка 4. Фиксация мазка

Приготовление мазков из микробных культур с жидкой питательной среды (жидкая культура)и из жидкого патологического материала (мочи, ликвора и. т. п) Маленькую каплю исследуемой жидкости наносят на предметное стекло и круговыми движениями петли рапределяют равномерным слоем в виде кружка диаметром 0, 7 -1 см. Требования к мазку: 1. Тонкий 2. Равномерный 3. Не заходит за края стекла

Приготовление мазка из культур с плотных питательных сред (плотная культура). На середину чистого хорошо обезжиренного стекла наносят каплю физиологического раствора или дистилированной воды. В нее вносят бактериальную петлю с небольшим количеством исследуемой микробной культуры. После этого формируют мазок аналогично мазку из жидкой культуры.

Высушивание мазков. Приготовленный на предметном стекле мазок высушивают на воздухе. Нельзя фиксировать не высушенный мазок

Фиксирование мазков. Цель: 1) убить микроорганизмы, т. к мертвые микробные тела окрашиваются лучше 2) закрепить мазок на поверхности предметного стекла, чтобы не микробные клетки не смывались при окраски Нельзя оставлять нефиксированные мазки !!!

Физический способ фиксации. • Метод основан на действии высокой tᴼ на микробную клетку. • Предметное стекло с препаратом берут пинцетом или большим и указательным пальцами левой руки за ребра мазком кверху и плавно проводят 2 3 раза над верхней частью спиртовки. Процесс фиксации занимает 5 6 сек. Сам мазок подвергается воздействию высокой температуры 2 сек. • Контроль: стекло свободной от мазка поверхностью прикладывают к тыльной поверхности левой кисти. При правильном фиксировании мазка стекло должно быть горячим, но не вызывать ощущения ожога.

Химический способ фиксации. • Метод основан на применении химических средств, вызывающих коагуляцию цитоплазмы микробной клетки. Предметное стекло с высушенным мазком погружают в емкость с фиксирующим веществом и затем по истечении времени экспозиции достают и высушивают на воздухе.

Вещество для Время химической фиксации/ мин Безводный 5 метиловый спирт Этиловый спирт 95 о 10 -15 Жидкость 10 -15 Никифорова (смесь спирта и эфира 1: 1)

Техника окраски мазков. Материалы и оборудование: 1. ванночка с мостиком для предметных стекол. 2. емкость с дистиллированной водой для промывания 3. набор красок и реактивов для окрашивания мазков. 4. пинцет для взятия предметных стекол. 5. кювета для стекол 6. фильтровальная бумага 7. ножницы 8. вата

Окраска по методу Грамма. Методика позволяет: • разделить бактерии (возбудителей инфекций) на грамположительные и грамотрицательные, • облегчает проведение дифференциальной диагностики инфекционных заболеваний • выбор средств антимикробной терапии. Большую часть массы (40— 90%) клеточной стенки грамположительных бактерий составляет многослойный пептидогликан (синонимы: муреиновый каркас, мукопептид), ковалентно связанный с тейхоевыми кисло тами (от греч. eichos — стенка). t Он прочно удерживает комплекс генциан фиолетового, в результате клетка окрашивается в сине фиолетовый цвет. В клеточной стенке грамотрицательных бактерий пептидогликана содержится меньше (5 10 %) – это 2 3 слоя пептидогликана, он плохо удерживает основной краситель (генциан фиолет) докрашивается фуксином в розовый цвет, т. о. грамположительные микроорганизмы окрашиваются в сине фиолетовый цвет, грамотрицательные микроорганизмы – в красно розовый цвет.

Метод окраски по Граму. • • • Метод дает возможность разделить все бактерии на 2 группы: ГРАМПОЛОЖИТЕЛЬНЫЕ и ГРАМОТРИЦАТЕЛЬНЫЕ Принцип метода: Грамположительные микроорганизмы имеют в составе клеточной стенки толстый (до 40 слоев) слой пептидогликана, который образует при воздействии на него генцианвиолета с люголем комплексы синего цвета, не вымывающиеся (не обесцвечивающиеся) при воздействии на них спиртом. Поэтому бактерии окрашиваются в фиолетовый цвет. Грамотрицательные микроорганизмы имеют 1 -2 слоя пептидогликана, поэтому комплексов фиолетового цвета мало и они легко вымываются (обесцвечиваются) спиртом, и в дальнейшем эти микроорганизмы окрашиваются при воздействии на них фуксином в красный цвет. Методика. 1. Наливают на фиксированный мазок раствор генцианвиолета (экспозиция на 1 2 мин). 2. Сливают избыток краски. 3. На поверхность предметного стекла наливают раствор Люголя (экспозиция 1 минута до почернения препарата) 4. Смывают раствор Люголя 5. Для обесцвечивания мазка предметное стекло погружают несколько раз в стаканчик со спиртом. Процесс обесцвечивания считается завершенным, пока от мазка не перестают отделятся окрашенные в фиолетовый цвет струйки жидкости. 6. Препарат тщательно промывают дистиллированной водой. 7. Наливают спирто водный раствор фуксина (экспозиция 1 мин). 8. Промывают водой, высушивают, микроскопируют. Результаты окраски: При окраске грамположительные микроорганизмы окрашиваются основной краской в темно фиолетовый цвет. Грамотрицательные микроорганизмы окрашиваются дополнительной краской в красно малиновый цвет