Презентация ВЭЖХ-long

Высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ) Это хроматография, в которой подвижная фаза — жидкость. Неподвижной фазой (НЖФ) является неорганический адсобент или органическое твердое вещество , ковалентно связанное с частицами сорбента в колонке. or HPLC – high performance liquid chromatography HPLC – high price liquid chromatography HPLC – high pressure liquid chromatography or

Высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ) По сути -это колоночная жидкостная хроматография, в которой применение современного оборудования позволило достичь высоких скоростей и высокой эффективности разделения. 70 -е годы — гигантский прогресс в инструментальной базе явился основой для современной высокоэффективной жидкостной хроматографии.

ЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФ

ХРОМАТОГРАФ «МИЛИХРОМ А-02» ПРОГРАММИРОВАНИЕ: Температуры Скорости потока Объема вводимой пробы Продолжительности анализа Состава элюента Режима элюирования (изократический или градиентный) Формы градиента (в градиентном режиме) Режима работы детектора

ХРОМАТОГРАФ «МИЛИХРОМ А-02»

Принцип «Подобное растворяется в подобном; а разделяется противоположным» работает и в ВЭЖХ Элюция – процесс прохождения веществ через колонку с потоком подвижной фазы Элюат – выходящий из колонки поток подвижной фазы с компонентами разделяемой смеси Элюент – растворитель (или смесь), использующийся в качестве подвижной фазы Элюирующая сила – способность подвижной фазы (смеси растворителей) десорбировать и вымывать компоненты пробы с сорбента данного типа Элюотропный ряд – ряд, в котором растворители расположены в порядке возрастания элюирующей силы

Область применения ВЭЖХ 2. Биоорганические соединения : Углеводы, сложные липиды, гормоны, органические кислоты, пептиды, витамины, пигменты, ПАВ 1. Углеводороды и их заместители : Алканы и алкены, бензолы, многоядерные ароматические, гетероциклы 4. Полимеры, их моно- и олигомеры3. Биоорганические соединения : Белки, ДНК, РНК 5. Ионы : неорганические и органические

Классификация жидкостной хроматографии По характеристикам и взаимодействиям неподвижной фазы: Нормально-фазная Обращенно-фазная Ионообменная Эксклюзионная

Неподвижные фазы Нормально-фазная жидкостная хроматография: неподвижная фаза – полярная (силикагель), подвижная фаза – неполярная. Элюенты: углеводороды, эфиры

Неподвижные фазы Обращенно-фазная жидкостная хроматография : неподвижная фаза – неполярная (модифицированный силикагель), подвижная фаза – полярная. Элюенты: спирты, нитрилы, вода

Выход веществ с разной полярностью на разных фазах Нормальная фаза Обращенная фаза Слабополярный элюент Сильнополярный элюент Среднеполярный элюент Полярность веществ: A > B >

Неподвижные фазы Элюенты: водные растворы солей, кислот, щелочей Катионит: делит катионы Анионит: делит анионы. Неподвижная фаза в ионообменной хроматографии имеет заряженные функциональные группы, которые взаимодействуют с анализируемыми ионизированными молекулами противоположного заряда. Группы привиты на полимер или силикагель. Может быть двух типов — катионной и анионной.

Эксклюзионная или гель-проникающая хроматография Неподвижные фазы Область применения: анализ полимеров по молекулярному весу молекул. Сорбенты: макропористые стекла, полистирол, имеющие выраженную поровую систему Звено полистирола (поливинилбензола)

КОЛОНКА – «СЕРДЦЕ» ХРОМАТОГРАФА Успех разделения в ВЭЖХ во многом зависит от типа сорбента и качества упаковки им колонки. «Идеальная» частица адсорбента с порами Реальные частицы адсорбента, заполняющие колонку

КОЛОНКА – «СЕРДЦЕ» ХРОМАТОГРАФА

Колонки для ВЭЖХ Длина 5 – 30 см Вн. диаметр 2 — 8 мм Размер частиц 3 – 10 ± 1 мкм Число т. т. 5000 —

• Имеют указатель направления потока, который не следует менять • Внутренняя поверхность – гладкий металл • Плавный переход от большего внутреннего диаметра к малому внешнему диаметру (под штуцер) • Фильтры с диаметром пор 2 -5 мкм на входе и выходе • Возможно использование предколонки меньшей длины Колонки для ВЭЖХ

Выбор состава элюента: свойства разделяемых веществ, свойства неподвижной фазы У элюентов важны свойства: Вязкость Прозрачность в УФ-диапазоне Индекс рефракции Элюирующая сила Тип взаимодействия Чистота Смешиваемость ацетон 0. 31 бензол 0. 60 кровь (при 37 °C) 3– 4 касторовое масло 985 этиловый спирт 1. 07 этиленгликоль 16. 1 глицерин (при 20 °C) 1490 мазут 2022 ртуть 1. 53 метиловый спирт 0. 54 жидкий азот (при 77 K) 0. 16 пропанол 1. 95 оливковое масло 81 серная кислота 24. 2 вода 0. 89 Вязкость жидкостей при 25 °C , [м. Па·с]020406080100 1. 0 2. 0 3. 0 м. Па·с % Et. OH в водной смеси

Свойства элюентов: смешиваемость Название Уксусная кислота Ацетонитрил Бензол Бутанол Тетрахлорид углерода Хлороформ Циклогексан Циклопентан Дихлорэтан Дихлорметан Диметилформамид Диметил сульфоксид Диоксан Этил ацетат Этанол Диэтиловый эфир Гептан Гексан Метанол Метилэтил кетон Изооктан Пентан Изопропанол Тетрахлорэтан Тетрагидрофуран Толуол. Бутанол Изопропанол Дипропил эфир Трихлоэтан Уксусная Ацетонитрил Бензол Тетрахлорид Хлороформ Циклопентан Циклогексан Дихлоэтан CH Cl 2 2 DMF DMSO Диокса н. Этил ацетат Этанол Диэтил эфир Гептан Гексан Метанол. MEK Изоктан Пентан 2 2 C H Cl 4 THF Толуол Вода Ксилол Трихлороэтан Вода Ксилол Дипропиловый эфир Не смешиваются Смешиваются Изопропанол – хороший промежуточный растворитель

Свойства элюентов: элюирующая сила Элюирующая сила – способность элюента вытеснять адсобированные анализируемые вещества в поверхности адсорбента, Растворитель , для силикагеля Гексан 0. 01 Бензол 0. 10 Бутилхлорид 0. 20 Хлороформ 0. 26 Дихлорметан 0. 32 Изопропиловый эфир 0. 34 Этилацетат 0. 38 Тетрагидрофуран 0. 44 Ацетонитрил 0. 50 Метанол 0.

Компоненты ВЭЖХ прибора: Система подачи элюентов Фильтрация Дегазация Смешивание Контроль давления (50 -200 атм)

• Изготовление из материалов, инертных к растворителям • Доставка растворителей с отн. высокими скоростями до 10 мл/мин • Точность скорости потока (<0. 5% вариации ) , без пульсов • Обеспечение высокого давления ( до 200 атм ) • Низкий объем жидкости в головке • Надежность Насосы Требования:

Насосы Шприцевого типа Возвратно- поступательного типа — Содержат 1 -3 головки, чем больше, тем лучше — Малые объемы в головке, 50 — 250 мл — Инертные материалы — Непрерывное использование — Наличие гасителя пульсов- Постоянная скорость потока — Отсутствие пульсов — Низкие скорости потока 1 -100 мл/мин — Необходимость наполнения резервуара

Схема насоса возвратно-поступательного типа двигатель Возвратно- поступательный поршень Шаровые пропускные клапаныуплотни- тель растворитель колонка демпфер пульсов

Система дозирования проб Петля объемом 5 -100 мкл, 6 — ходовый кран Шприцевого типа

Соединения в ВЭЖХ Важно! Отсутствие течи дает постоянное давление и скорость потока, как следствие эффективное разделение Перетягивание также нежелательно, так как ведет к выходу из строя уплотнителей

ДЕТЕКТОР – «ГЛАЗА» ХРОМАТОГРАФА В ВЭЖХ — это преобразователь концентрации анализируемого вещества, растворенного в подвижной фазе, в электрический сигнал, по изменению физических свойств жидкости Детектор Измеряемое физическое свойство Чувствитель-н ость, г Селективность Спектрофотометрический Оптическая плотность на определенной длине волны (фильтр или монохроматор) 10 -9 Высокая Рефрактометрический Разность показателя преломления 10 -6 Низкая Флуорометрический Излучение света на определенной длине волны 10 -11 Очень высокая Амперометрический Ток окисления или восстановления 10 -9 — 10 -11 Очень высокая Кондуктометрический Электропроводность элюента 10 -10 Низкая Масс-спектрометрический Ионный поток, возникающий при различных энергетических воздействиях 10 -9 Средняя

СПЕКТРОФОТОМЕТРИЯ В ВЭЖХ Достоинства Универсальный (возможен анализ практически всех групп веществ) Неразрушающий вид детектирования Прост в аппаратурном оформлении Доступен для большинства лабораторий Обладает достаточно высокой чувствительностью (до 10 -12 г в пробе )Спектрофотометрический детектор – регистрирует изменение интенсивности падающего на кювету света при прохождении через нее элюата. Из колонки На сброс Детектор. Источник света Кварцев ые окна Объем кюветы 1 -10 мкл

СПЕКТРОФОТОМЕТРИЯ В ВЭЖХ Монохроматический свет (световые колебания одной частоты) от источника L (лампа) интенсивностью I 0 падает на кювету длиной l (оптический путь). Кювета заполнена раствором вещества с концентрацией С. Вещество способно поглощать излучение. Из кюветы выходит ослабленный световой пучок интенсивностью I. — коэффициент экстинкции (мера способности поглощения данного монохроматического излучения). ε λ

СПЕКТРОФОТОМЕТРИЯ В ВЭЖХ Закон Бугера-Ламберта-Бера I – интенсивность светового потока после прохождения кюветы; I 0 – интенсивность падающего светового потока; ε — экстинкция; С – молярная концентрация вещества в кювете; l – длина кюветы.

Типы фотометрических детекторов: Фотометры с набором светофильтров на несколько длин волн; Спектрофотометры с фиксируемой для всего анализа длиной волны – любой из полного диапазона; Спектрофотометры с возможностью переключения длины волны на разных участках хроматограммы; Сканирующие спектрофотометры с циклическим переключением нескольких длин волн в процессе и с возможностью записи спектра при остановке потока. дейтериевая лампа зеркало решетка делитель луча фотодиод кювета усилительфотодиод сравнения компараторщель

СПЕКТРОФОТОМЕТРИЯ В ВЭЖХ СРАВНЕНИЕ СПЕКТРОВ ПОГЛОЩЕНИЯ

СПЕКТРОФОТОМЕТРИЯ В ВЭЖХ МНОГОВОЛНОВОЕ ДЕТЕКТИРОВАНИЕ

Исследуемые смеси: Полиароматические углеводороды (ПАУ) Нафталин Антрацен Пирен Бензапирен Фенантрен В химической структуре – от двух и более конденсированных колец. При комнатной t – твердые вещества, хорошо растворимы в орг. растворителях, малорастворимы в воде.

Полиароматические углеводороды (ПАУ) Техногенные источники: -предприятия энергетического комплекса, — автомобильный транспорт, — химическая и нефтеперерабатывающая промышленность. — термические процессы, связанные со сжиганием и переработкой нефтепродуктов, угля, древесины, мусора, пищи, табака и др. Природные источники: -репеленты некоторых растений и животных, — летучие метаболиты грибов, — процессы горения биомассы, — извержения вулканов, — обнаружены на метеоритных частицах.

Получение: из каменноугольной смолы. Полиароматические углеводороды (ПАУ)

Применение и значение ПАУ Перенос в биогеохимических циклах, накопление в тканях организмов Канцерогенное, мутагенное, тератогенное воздействие, кожные и аллергические заболевания Синтез красителей, взрывчатых веществ, инсектицидов и пр. Необходимость мониторинга в окружающей среде: воздухе, воде, почвах

Значение ПАУ Необходимость мониторинга в окружающей среде: воздухе, воде, почвах — наиболее типичный химический канцероген в окружающей среде; — опасен для человека даже при малой концентрации, поскольку обладает свойством биоаккумуляции. Бенз(а)пирен Согласно российским нормативам ГН 2. 1. 6. 695 -98 и ГН 2. 1. 6. 1338 -03 ПДК для бензапирена в воздухе ПДКсс = 0, 1 мкг/100 м 3 = 10 -9 г/м 3 Содержание бенз(а)пирена в питьевой воде составляет 0, 3 -2, 0 нг/л.