Презентация Титова new лекция

• высокая чувствительность крупных, вакуолизированных растительных клеток к физико-механическим воздействиям; • высокие требования к обеспечению асептических условий вследствие большой продолжительности ростового цикла и относительно низкой скорости роста (в сравнении с микробными и животными клетками); • необходимость обеспечения равномерного перемешивания вследствие высокой скорости седиментации клеточных агрегатов и возрастания вязкости суспензий при высоких концентрациях клеточной биомассы; • интенсивное пенообразование и адгезия клеточной биомассы к стенкам культивационных сосудов; • сложность механизмов регуляции роста клеток и биосинтеза целевых продуктов. Особенности выращивания суспензионных культур клеток высших растений: Высокие требования к выбору систем культивирования и систем контроля процесса выращивания

Системы выращивания культур клеток высших растений 1. Колбы на качалке 2. Роллеры 3. Аппаратное культивирование (биореакторы). Преимущества биореакторов: — возможность контролировать процесс (р. Н, р. О 2 , р. СО 2 , t o , ионы, плотность) — возможность управлять процессом

Выращивание суспензионных культур клеток в колбах на качалке и биореакторах

Особенности аппаратного глубинного выращивания растительных клеток: Культивирование в биореакторе: — дозированное поступление в аппарат определенных потоков (инокулята, воздуха или газовых смесей, питательных компонентов, пеногасителей, и т. д. ); — отвод из него тепла, отработанного воздуха, культуральной жидкости, клеточной биомассы; — измерение и стабилизация основных параметров процесса на оптимальном для развития продуцента и образования целевого продукта уровне.

Основные типы биореакторов: Главные задачи при выборе биореакторов: • стерильность процесса культивирования, • обеспечение необходимой для клеток скорости растворения кислорода, • подвод к клеткам других компонентов питания и отвод продуктов метаболизма, • равномерное распределение биомассы в рабочем объеме, • сведение к минимуму повреждающих воздействий на клетки, • регулируемость газового режима и температуры, • асептический отбор средней пробы биомассы. Без механических перемешивающих устройств: барботажные, эрлифтные с выраженным циркуляционным контуром С механическим перемешиванием

• Общий признак – аэрация и перемешивание клеточной суспензии осуществляется сжатым воздухом , подаваемым в биореактор под определенным давлением. • Характеризуются достаточно простой конструкцией (отсутствуют трущиеся, движущиеся узлы) и высокой эксплуатационной надежностью. • Обладают относительно невысокими массообменными характеристиками (коэффициент массопередачи по кислороду редко превышает 4 кг/ м 3 ч), и, следовательно, не могут быть рекомендованы для выращивания культур клеток с высокой вязкостью или повышенными конечными концентрациями клеточной биомассы Биореакторы без механического перемешивания

• Обычно-цилиндрическая емкость, снабженная механическими перемешивающими устройствами, а также барботером, который устанавливается, как правило, под нижним ярусом мешалки. • В таких ферментерах можно в очень широких пределах изменять интенсивность массообмена • Основная проблема – высокая чувствительность клеток к механическому перемешиванию. Биореакторы с механическим перемешиванием

Кривые роста культуры клеток P olyscias filicifolia в биореакторах разных типов и объема 0 0, 5 1 1, 5 2 2, 5 3 0246810121416182022 Барботажный, 2 л NBS, 7, 5 л Барботажный, 20 л Электролюкс, 75 л 1 Т, 630 л Время культивирования, сутки Ln X/Xo Выбор оптимальной конструкции биореактора зависит от индивидуальных особенностей конкретного штамма-продуцента Сравнительная характеристика роста суспензионной культуры Dioscorea deltoidea Wall (штамм ИФР ДМ-0, 5) в разных системах выращивания Вариант M max , (г/л) V , (%) P , (г/л*сут) F , (% к М) Колбы 8, 0 — 12, 5 80 — 95 0, 60 — 0, 83 3, 0 — 5, 0 Барботажный ( 20 л ) 8, 0 — 13, 5 75 — 90 0, 50 — 0, 71 3, 5 — 4, 5 Electrolux (75 л) 6, 6 — 8, 5 60 — 80 0, 45 — 0, 60 3, 0 — 3,

Изменение накопления биомассы и жизнеспособности при культивировании в различных системах 3 штаммов суспензионной культуры клеток St. Glabra : Барботажный биореактор (20 л) С механическим перемешиванием (75 л) Колбы на качалке

Прочие типы биореакторов:

Использование биореакторов для крупномасштабного выращивания суспензионных культур растительных клеток Колбы (2 L) Лабораторный барботажный биореактор (20 L) Биореактор с механическим перемешивнием (75 L) Промышленный барботажный биореактор (630 L) Для проведения экспериментов по масштабированию выращивания- используют стратегию, типичную для микробных культур: • предварительные эксперименты в лабораторных биореакторах (объем 2 – 15 литров) по оптимизации роста культуры; • выращивание в пилотных установках (объемом до 100 литров) и проверка выбранных режимов; • масштабирование выращивания до полупромышленных и коммерческих биореакторов (объемом 500 литров и более)

Пример получения лекарственных препаратов и пищевых добавок на основе культур клеток высших растений. Совместно с НПФ «Биофармтокс» (С-Петербург) на основе биомассы культуры клеток полисциаса Polyscias filicifolia созданы нутрицевтики «Витагмал» , «Трифитол» , серия мазей «Витагмалин» .

Биореакторы промышленного объема и получаемая биомасса культуры клеток женьшеня

для каждого конкретного используемого штамма определяют: • оптимальные условия непрерывной аэрации ; • оптимальные условия непрерывного перемешивания; • оптимальный режим культивирования. Масштабирование процесса аппаратного культивирования растительных клеток При глубинном аппаратном культивировании – необходимо обеспечивать высокую интенсивность массообмена клеток со средой основные функции : • осуществление массопереноса между различными фазами клеточной суспензии (газовой, жидкой и твердой ); • поддержание гомогенных химических и физических условий в системе для равномерного распределения питательных компонентов и газов, транспорта тепла, диспергирования клеточной биомассы. непрерывное перемешивание

• размеры и сложность конфигурации используемой системы культивирования (возникновение температурных градиентов, флуктуаций концентраций субстратов, образование «застойных зон» , и т. д • реологические характеристики используемых клеточных суспензий • высокая чувствительность растительных клеток к гидродинамическому и механическому воздействию Для обеспечения непрерывного перемешивания используют: Факторы, влияющие на эффективность непрерывного перемешивания: в малых объемах (колбы) — взбалтывание клеточных суспензий на качалках при аппаратном выращивании: • механическое перемешивание • перемешивание за счет подачи диспергируемого воздуха • комбинированные системы

• Снижение жизнеспособности • Снижение содержания внутриклеточных метаболитов • Изменения метаболизма (изменение скорости поглощения О 2, дыхательной активности, содержания АТФ, состава клеточных стенок) • Морфологические изменения (изменения размеров клеточных агрегатов) Влияние гидродинамического стресса: Минимизация стрессового эффекта: • индивидуальный подбор мешалок и газораспределительных устройств • индивидуальный подбор условий перемешивания (подбор скорости вращения мешалок и скорости подачи воздуха) • подбор либо создание штаммов, устойчивых к стрессовым воздействиям (с сохранением высокой продуктивности) • индивидуальная оптимизация конструкций биореакторов

Типы мешалок :

Непрерывная аэрация: непрерывная аэрация суспензионных культур растительных клеток необходима : • для обеспечения аэробных условий выращивания • для отвода избытка тепла, образующегося в результате жизнедеятельности клеточной популяции общая скорость поглощения O 2 для растительных клеток варьирует в пределах 10 -4 г O 2/г сухой биомассы*мин и зависит от: • индивидуальных особенностей клеточных линий • условий культивирования • фаз ростового цикла и т. д.

В настоящее время для аэрации суспензионных культур растительных клеток при выращивании в биореакторах используют: • точечные газораспределяющие устройства • кольцевые газораспределяющие устройства • решетчатые и т. п. Непрерывная аэрация: Для каждого конкретного процесса подбор конструкции барботера индивидуален. Требования: • обеспечение наиболее оптимального тока воздуха • исключение возникновения слишком интенсивных турбулентных потоков • обеспечение массообмена по всему рабочему объему аппарата Для предотвращения лимитации роста клеточных суспензий кислородом, концентрацию растворенного кислорода ( d. O 2) в культуральной жидкости обычно поддерживают на уровне не ниже 10 -15 % от насыщения. Измерение общей скорости поглощения кислорода — распространенный метод контроля метаболической активности растительных клеток in vitro , адекватно отражает реакцию культур клеток на изменение условий выращивания (изменение температуры, р. Н, осмотический стресс, ингибирование, дефицит питания, взаимодействие с патогенами и т. д. )

При разработке эффективного аппаратурного культивирования — необходим подбор режима выращивания , оптимального для максимальной ростовой и биосинтетической активности суспензионной культуры клеток с учетом ее особенностей. Режимы культивирования Периодическое культивирование Комбинированные системы Проточное культивирование — открытый проток (хемостат, турбидостат )) — закрытый проток (по биомассе)- «отъемно-доливные» системы — 2 -хстадийные системы — системы с подпиткой субстратом

Вариант закрытого культивирования – содержит ограниченное первоначальное количество питательного субстрата и инокулята. Периодический метод выращивания После лаг-фазы – максимальная скорость роста, затем рост замедляется и прекращается (недостаток источников питания, накопление ингибирующих продуктов). При достижении максимума роста – наступление стационарной фазы (количество биомассы – const) с последующей деградацией.

Особенности: • пониженный риск контаминации и возникновения клеточных мутаций вследствие относительно короткого цикла выращивания; • высокая степень утилизации субстрата; • относительно низкая стоимость (в сравнении с затратами на обеспечение непрерывного проточного культивирования) • простота реализации Периодический метод выращивания Недостатки: • для многих объектов показано снижение уровня накопления биомассы и вторичных метаболитов (из-за выделения ингибирующих продуктов клеточного метаболизма и истощения субстрата в системе); • низкая продуктивность процесса в целом (большие временные затраты на подготовку оборудования (очистка, заполнение, стерилизация) и выращивание инокулята к каждому новому циклу); • дополнительный риск контаминации при внесении больших доз инокулята для промышленных объемов

Кривые роста суспензионной культуры клеток P. japonicus var. repens при выращивании в 20 л биореакторе на средах с разным составом ауксинов. Периодический метод выращивания Оптимальное применение — проведение предварительных экспериментов в колбах или биореакторах по выявлению факторов окружающей среды, влияющих на продуктивность различных клеточных культур (варьирование питательных компонентов, газового состава, интенсивности аэрации и скорости вращения перемешивающего устройства, проч. )0 0, 2 0, 4 0, 6 0, 8 1 1, 2 1, 4 1, 6 1, 8 2 0246810121416182022 Cутки Ln X/Xo

Проточные (непрерывные) методы выращивания. Гомогенно-проточные способы (системы полного смешения). Вариант открытого культивирования – в систему при полном перемешивании с постоянной скоростью непрерывно подают свежую среду, при этом общий объем клеточной суспензии поддерживают на постоянном уровне за счет непрерывного отлива с той же скоростью части культуры ( V = const) позволяет создавать во всем объеме аппарата одинаковые стационарные условия и стабилизировать продуцент в практически любом требуемом состоянии

Проточные (непрерывные) методы выращивания. Гомогенно-проточные способы (системы полного смешения). Особенности: • возможность получать определенное количество целевого продукта с заданными и воспроизводимыми характеристиками (условия процесса const) ; • возможность варьировать состав популяции клеток и их метаболическую активность за счет изменения концентраций поступающего кислорода и питательных компонентов; • возможность менять скорость протока среды позволяет в регулировать скорость роста культуры и концентрацию клеточной биомассы. Недостатки: • нельзя контролировать получение вторичных метаболитов, биосинтез которых не ассоциирован с ростом клеточной популяции; • трудности в обеспечении стационарных условий для культур клеток с большой степенью агрегированности и высокой вязкостью; • риск потери штамма-продуцента за счет мутации клеток (отбора клеток с высокой скоростью пролиферации); • высокая стоимость и сложность систем контроля и автоматизации; • повышенный риск контаминации за счет увеличения продолжительности цикла культивирования

• Рост клеток с глубоким лимитированием (модель сформировавшейся популяции). • Основан на измерении и регуляции входящих потоков. • Для исследований популяций растительных клеток впервые был опробован Вильсоном с соавт. (1971)Проточные (непрерывные) методы выращивания. Гомогенно-проточные способы (системы полного смешения). ХЕМОСТАТ. Концентрацию кислорода или одного из компонентов питательной среды на входе в ферментер фиксируют так, чтобы другие компоненты субстрата находились в избытке Скорость размножения клеток в культуре ограничена лимитирующей концентрацией задающегося элемента субстрата

3 возможных результата в хемостатной культуре: ( Скорость прироста биомассы (Х) ограничена концентрацией ( S) лимитирующего субстрата ) 0 – добавления среды не происходит : рост как в периодической культуре; При поступлении среды (момент времени tr) : 1 – скорость разбавления ( D) больше удельной скорости роста μ max : концентрация биомассы падает, концентрация лимитирующего субстрата стремится к Sr ; 2 – D нач. = μ max : стационарное состояние при максимальной удельной скорости роста культуры; концентрация биомассы и лимитирующего субстрата = const ( Stady state ); 3 — D нач < μ max : непрерывный прирост биомассы, пока уменьшение лимитирующего субстрата не снизит μ ; тогда μ = D , μ < μ max и будет определяться D ; наступит саморегулирующееся стационарное состояние. Проточные (непрерывные) методы выращивания. Гомогенно-проточные способы (системы полного смешения). ХЕМОСТАТ.

• Хемостат позволяет изучать популяцию клеток в фазе интенсивного роста, а также выделять фактор (чаще всего концентрацию рост-лимитирующего компонента питательной среды), определяющий физиолого-биохимическое состояние клеточной популяции • Сложности поддержания в течение продолжительного времени стационарного состояния. • Увеличение скорости протока выше μ max может приводить к вымыванию культуры растительных клеток из биореактора. • При увеличении скорости протока может происходить уменьшение гетерогенности клеточной популяции вследствие повышения доли быстрорастущих клеток – наблюдается постепенное вымывание клеток, прекративших рост или растущих с меньшей удельной скоростью, чем скорость протока Проточные (непрерывные) методы выращивания. Гомогенно-проточные способы (системы полного смешения). ХЕМОСТАТ.

Рост и содержание гинзенозидов в культуре клеток P. japonicus при выращивании в режиме протока

Выращивание культуры клеток диоскореи в проточном режиме

Изменение плоидности клеток при выращивании культуры клеток диоскореи в проточном режиме, штамм Д 1 В состоянии stady-state ( по уровню накопления биомассы ) – наблюдается изменение состава популяции (идет отбор гаплоидных клеток)

• Основан на измерении мутности выходящего потока (снабжен фотоэлектрическим элементом, чувствительным к мутности суспензии). • Изменение оптической плотности клеточной суспензии регулирует скорость поступления в ферментер свежей питательной среды: — при снижении оптической плотности до определенного выбранного значения фотоэлемент подает сигнал на насос, подающий среду. V суспензии в аппарате = const. Для выращивания растительных клеток применяется крайне редко – низкая корреляция между оптической плотностью культуры и реальной концентрацией клеток; также отмечают залипание датчиков плотности из-за высокой адгезии клеток. Проточные (непрерывные) методы выращивания. Гомогенно-проточный способы (системы полного смешения). ТУРБИДОСТАТ.

• Рост клеток с глубоким лимитированием (модель сформировавшейся популяции). Автоселекция клеток с повышенным сродством к лимитирующему субстрату, отбор более «экономичных» и жизнеспособных форм. • Фиксируется скорость разбавления, к стационарному уровню подстраивается концентрация биомассы • постоянство потоков ( F = const) Проточные (непрерывные) методы выращивания. Сравнение хемостата и турбидостата. хемостат турбидостат • Рост клеток в нелимитированных условиях. Автоселекция клеток с увеличенной μ , более «резистивные» мутанты. • С помощью турбидостатного контроля устанавливается плотность биомассы, к стационарному уровню подстраивается скорость разбавления. • постоянство организации (Х = const)V, x F, S o

• Отличительная особенность — необходимость непрерывной подачи питательной среды и отбора бесклеточной культуральной жидкости. В техническом плане это реализуют при помощи перистальтических насосов, простейших измерителей расхода протекающей жидкости и емкостей для слива бесклеточной культуральной жидкости и подачи питательной среды. • Основная сложность — разработка конструкции непрерывного отделения биомассы от культуральной жидкости. Наиболее распространены следующие варианты решения этой проблемы: путем иммобилизации, разделением с использованием мембран и путем седиментации клеточной биомассы. Проточные (непрерывные) методы выращивания. Закрытое по биомассе проточное культивирование ( «закрытый проток» ).

Позволяет изучать популяции (состоящие преимущественно из специализированных клеток) в фазах замедления роста или стационара. основные регулирующие воздействия – изменение концентрации лимитирующего субстрата, скорости протока наиболее часто используют: • для получения продуктов первичного и вторичного метаболизма, ассоциированных с ростом клеточных культур; • при выращивании клеточных суспензий, для которых характерно ингибирование роста продуктами клеточного метаболизма. Проточные (непрерывные) методы выращивания. Закрытое по биомассе проточное культивирование ( «закрытый проток» ).

Проточные (непрерывные) методы выращивания. Закрытое по биомассе проточное культивирование ( «закрытый проток» ). Преимущества: • возможность непрерывного действия системы без проблем вымывания клеток; • иммобилизованные клетки защищены от механического воздействия; • в системе закрытого протока повышается межклеточный контакт и клеточная дифференциация; • отсутствие вымывания клеток позволяет широко варьировать скорость протока среды и оказывать многофакторное воздействие на клеточную популяцию; • удаление протоком среды ингибирующих клеточных метаболитов Недостатки: • возможность снижения жизнеспособности клеток в результате процесса отделения от культуральной жидкости или иммобилизации (включение в гель, контакт с мембраной и т. д. ); • сложность контролирования ростовых и биосинтетических параметров клеточной популяции; • наличие значительных градиентов питательных веществ и кислорода внутри данной системы; • высокая стоимость и сложность необходимого дополнительного оборудования

«Закрытое» проточное культивирование культуры клеток диоскореи дельтовидной D=0, 15 сут -1 Проток – среда MS двойной концентрации

К ним относят: • периодические культуры с подпиткой субстратом (периодическое или непрерывное добавление питательной среды или отдельных лимитирующих питательных компонентов без удаления биомассы) • «отъемно-доливные» системы (периодическое добавление свежей среды при удалении части культуры) • двустадийные системы и т. д. Комбинированные методы выращивания. Открытые системы с элементами периодического культивирования Отличие от проточных режимов: не являются стационарными Для них характерны: периодические изменения объема суспензии и скорости, времени и степени её разбавления, а также зависящих от этих параметров характеристик (удельной скорости роста, продуктивности и т. п. )

просты в аппаратурном оформлении и сочетают преимущества проточных и периодических методов: • более широкие возможности для контроля и оптимизации условий культивирования в зависимости от фазы ростового цикла, продуктивности или возраста культуры; • снижен риск мутаций клеточной популяции; • отсутствует риск «вымывания» клеток; • гарантирована высокая степень утилизации субстрата; • возможность варьировать продолжительность субкультивирований в зависимости от изменений физиологических характеристик клеточной популяции; • отсутствуют временные затраты на подготовку оборудования и инокулята к каждому новому циклу субкультивирования Комбинированные методы выращивания. Открытые системы с элементами периодического культивирования

Ростовые кривые и содержание фуростаноловых гликозидов в культуре клеток Dioccorea deltoidea в полупроточном режиме выращивания ( «отъемно-доливной метод» ) Лабораторный биореактор (20 литров) барботажного типа Биореактор пилотного объема (75 литров) с механическим перемешиванием

Комбинированные системы широко используют при масштабировании культивирования объектов, для которых применение периодических и проточных методов менее эффективно: • при исследований роста, лимитированного субстратом, • при выращивании культур, для которых характерен синтез целевых продуктов, не ассоциированный с ростом, • высокоагрегированных культур, • культур с низкой скоростью роста и т. п. Комбинированные методы выращивания. Открытые системы с элементами периодического культивирования

Полупроточное выращивание суспензионной культуры клеток Polyscias filicifolia в биореакторе объемом 0. 63 m 3 . 3, 33 8, 23 9 3 9, 5 10, 6 1212, 5 8 12, 9 15 16 8 10, 03 12, 32 13 7 10, 81 13, 914 9, 8 15, 2 16 9, 8 11 15 9, 42 10, 81 12, 412, 87 8, 28 10, 64 11, 7511, 5511, 7512 8 8, 89 10 10, 6911 12 66, 26 9, 71 11 6, 5 7, 25 8, 178, 24 10, 73 12 6, 5 8, 51 10, 86 12, 62 14 7 10, 1 12 8 12 6, 56, 7 10, 05 11 12 7, 84 13 15 10 12, 49 8, 35 9, 77 10, 5 12 6, 61 10, 74 12, 1 13 7, 05 16, 09 15, 516 8 9, 46 12, 2412, 3612, 5 6 7, 3 8 10, 110, 5 11, 5 5, 9 1010, 4510, 2 11, 42 12 14 10, 22 11 12 13 8, 66 11, 29 13, 7 15 9, 7 10, 7 13 9, 4 10, 8 8, 1 9, 2 10 6, 116 9, 3 5, 45, 7 6, 7 8, 68, 7 9, 2 4, 54, 6 5, 4 6, 3 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 0102030405060708090100110120130140150160170 Вре мя культивирова ния, сутки Сухая масса, г/л 1 цикл 2 цикл 3 цикл 4 цикл 5 цикл 6 цикл 7 цикл 8 цикл 9 цикл 10 цикл 11 цикл 12 цикл 13 цикл 14 цикл 15 цикл 16 цикл 17 цикл 18 цикл 19 цикл 20 цикл 21 цикл 22 цикл 28 цикл 27 цикл 23 цикл 24 цикл 25 цикл 26 цикл 29 цикл 30 цикл 31 цикл 32 цикл слив