Презентация Дейнеко Генериум last

д. б. н. , проф. Дейнеко Елена Викторовна зав. лабораторией биоинженерии растений РАЗРАБОТКА СЪЕДОБНЫХ ВАКЦИН НА ОСНОВЕ ГЕНЕТИЧЕСКИ МОДИФИЦИРОВАННЫХ РАСТЕНИЙ ФГБУН Институт цитологии и генетики, Сибирское отделение РАН, Новосибирск

Производство лекарственных препаратов для фармацевтики — важнейшая и динамично развивающуюся часть мировой индустрии. 2013 г. – объём фармацевтического рынка составил около 975 млрд. дол. США, с тенденцией к росту около 1, 2 трлн. дол. США к 2015 г. 2011 г. — объём биотехнологического сектора составил более 145 млрд. дол. США, с перспективой роста до 167 млрд. дол. США к 2015 г. «IMS Health»

Системы экспрессии фармацевтически ценных рекомбинантных белков E. coli; 58 клетки млекопитающих; 74 клетки насекомых; 3 клетки растений; 8 Дрожжи; 21 молоко трансгенных животных;

низкая очень высокая средняя очень низкая растительные клетки целые растения клетки млекопитающих насекомые дрожжи бактерии. Сравнительный анализ систем экспрессии рекомбинантных белков J. Xu et al. / Biotechnology Advances 29 (2011) 278–

низкое очень высокое среднее очень низкое растительные клетки целые растения клетки млекопитающих насекомые дрожжи бактерии. Сравнительный анализ систем экспрессии рекомбинантных белков J. Xu et al. / Biotechnology Advances 29 (2011) 278–

Трансгенные растения – продуценты рекомбинантных белков для медицины: преимущества и недостатки

Генетическая конструкция. Принцип генетической модификации д ж

Агробактериальная трансформация ( A. tumefaciens )Методы генетической модификации растений:

Микрочастицы золота Образец ткани. Генная пушка. Биобаллистика Методы генетической модификации растений:

Особенности встраивания трансгенов в геном растения TT 00 ++ // — TT 11 11 ++ // ++ : : 22 ++ // — : : 11 — // — TT 22 ++ // ++ 11 ++ // ++ : : 22 ++ // — : : 11 — // — TT 33 ++ // ++ 11 ++ // ++ : : 22 ++ // — : : 11 — // —33 KK mm ++ : : 11 KK mm — 11 ++ // ++ : : 22 ++ ** // — : : 11 —** // —**11. . ++ ** // ++ 33 KK mm ++ : : 11 KK mm — 11 ++ ** // ++** : : 22 ++** // — : : 11 — // —22. . ++ ** // — KK mm —3 Km + : 1 Km -Т 0 Т 1 Т-ДНК

не содержат патогенных для человека вирусов и прионов нет необходимости в дорогостоящем оборудовании для культивирования разработанные системы агротехники гликозилирование и фолдинг белков Способы доставки – «съедобные вакцины» Преимущества и недостатки растений по сравнению с другими системами экспрессии. низкий уровень экспрессии Авидин – 1 бушель (25 кг) кукурузы = 1 т белков куриных яиц авидин из кукурузы = 0, 5% от стоимости авидина из куриных яиц α-интерферон человека – в хлоропластах табака = 20% ОРБ = 3 мг/г сырой массы

J. Xu et al. / Biotechnology Advances 29 (2011) 278– 299 Методические подходы к повышению продукции рекомбинантных белков в культуре растительных клеток целевой ген клетки-продуценты целевой белок Оптимизация экспрессии трансгенов на уровне транскрипции и трансляции Оптимизация культивирования растительных клеток in vitro Оптимизация культивирования растительных клеток в биореакторах Оптимизация условий выделения и очистки рекомбинантных белков

Сайт-специфические нуклеазы

Перспективные системы экспрессии в растительных клетках Ряска: горбатая — Lemna gibba ; малая — L. minor “ Biolex”, США Суспензионные клеточные культуры клеточная культура моркови “Protalix”, Израиль клеточная культура табака “Dow Agro. Sciences”, США Агроинфильтрация растений Nicotiana benthamiana “ Bayer”, Германия

Получение рекомбинантного апротинина (ингибитор фибринолиза) на основе ГМ растений люцерна – ядерная трансформация – 0, 1% ОРБ (5 мг/кг биомассы), “Medicago”, Канада ряска – ядерная трансформация – 1, 9 -3, 7% ОРБ (0, 67 мг/л в среде), “Lemna Gene”, Франция зёрно кукурузы – ядерная трансформация – 8, 9% ОРБ, “Prody. Gene”, Люксембург табак ( Nicotiana benthamiana ) – агроинфильтрация – 2, 0 -4, 2% ОРБ (до 400 мг/кг сырой массы за 7 дней), “LSBC”, США

Cостояние рынка рекомбинантных фармацевтически ценных белков, полученных на основе трансгенных растений

Препарат Компания Биореактор Стадия клинических испытаний Глюкоцереброзидаза, терапия болезни Гоше Protalix Bio. Therapeutics Суспензионная культура клеток табака Одобрена USDA для применения Инсулин, при диабете Sem. Bio. Sys Семена подсолнечника Фаза 3 Липаза, терапия при муковисцидозе, панкреатите Meristem Therapeutics Кукуруза На рынке Внутренний фактор, при дефиците витамина В 12 Cobento Biotech AS Арабидопсис На рынке ISOkine. TM, DERMOkine. TM , факторы роста и цитокины ORF Genetics Ячмень На рынке α – интерферон ( Locteron. TM) , при хроническом гепатите С Biolex Ряска Фаза 2 б. Рынок фармацевтически ценных белков и антигенов, получаемых на основе трансгенных растений. Терапевтические белки и пищевые добавки Рынок фарм. белков на основе трансгенных растений, оценивается к 2015 г. -около 20 млрд USD. B. Nagels, K. Weterings, N. Callewaert & E. J. M. Van Damme. Critical reviews in Plant Sciences, 2012. V. 31: 2, pp 148 -180 Obembe O. O. , Popoola J. O. , Leelavathi S. , Reddy S. V. Biotechnology Advances, 2011. V. 29: 2, pp 210 -222 Paul M, Ma JK. Biotechnol Appl Biochem. 2011 Jan-Feb. V. 58: 1. pp 58 -67 Yusibov V. , Streatfield S. J. , Kushnir N. Human Vaccines. 2011. V. 7: 3. pp 313 —

Рынок фармакологически ценных белков и антигенов, получаемых на основе трансгенных растений. Вакцины и антитела Препарат Компания Биореактор Стадия клинических испытаний Вакцина для профилактики болезни Ньюкасла кур Dow Agro. Sciences Растения табака Одобрена USDA Антиген вируса Норфолк University of Arizona Картофель Фаза 1 Вирусоподобные частицы от вируса гриппа H 5 N 1 Medicago Табак Фаза 2 Антиген вируса гепатита В Thomas Jefferson University Салат, картофель Фаза 1, Фаза 2 Антигены вируса бешенства Thomas Jefferson University Шпинат Фаза 1 Антитела, неходжкинская лимфома Bayer Innovation табак Фаза 1 Caro. RX , антитела при зубном кариесе Planet Biotechnology табак Одобрено в ЕС

КОМПАНИИ Системы наработки рекомбинантного белка Системы экспрессии суспензии табак люцерна ряска мох A. thaliana рис ядро хлоро пласты агроинфильт рация Dow Agro. Science Protalix Planet Biotech Bayer Chlorogen Medicago, Inc. Biolex Greenovation Cobento Ventia Производство фармацевтических белков на основе генетически-модифицированных растений Sourrouille C. et al. , Recombinant Proteins From Plants. 2009.

• Затраты на производство 1 г антигена: — клетки млекопитающих – 367 -618 USD — клетки растений – 39 -125 USD Kaufmann S. , 2013 • Лигнин, фенольные соединения, протеазы, пигменты • Большие вложения в процесс сертификации продукта.

Трансгенные растения моркови – продуценты антигенов Mycobacterium tuberculosis

Жизненный цикл Mycobacterium tuberculosi s и различные способы вакцинации Kaufmann S. The Lancet Infectious Diseases Volume 11, Issue 8, 2011, 633 —

Испытания новых вакцин против туберкулеза Ad. Ag 85 A Mc. Master University Hybrid-I+CAF 01 SSI, TBVI H 56+IC 31 SSI, Aeras, Intercell Hyvac 4/ AERAS-404 +IC 31 SSI, sanofi-pasteur, Aeras, Intercell ID 93/GLA-SE Infectious Disease Research Institute, Aeras M 72+AS 01 GSK, Aeras VPM 1002 Max Planck, Vakzine Projekt Mgmt, TBVI Hybrid-1+IC 31 SSI, TBVI, EDCTP, Intercell RUTI Archivel Farma, S. L. MVA 85 A/ AERAS-485 Oxford-Emergent Tuberculosis Consortium, Aeras, EDCTP, Wellcome Trust AERAS-402/ Crucell Ad 35 Crucell, Aeras, EDCTP, NIH Mw [M. indicus pranii (MIP)] Dept of Biotechnology (India), M/s. Cadila. Фаза IIIФаза IIб. Фаза I Source: Tuberculosis Vaccine Candidates – 2011 первичная бустерная пост-инфекционная иммунотерапевтичческая Типы ТБ вакцин Основанные на вирусных векторах: MVA 85 A, AERAS-402, Ad. Ag 85 A Белок в сочетании с адьювантом: M 72, Hybrid-1, Hyvac 4, H 56, ID 93 r. BCG: VPM 1002 Убитые вакцины : Mw, RUTI SSI — Statens Serum Institute TBVI -Tuberculosis Vaccine Initiative GSK — Glaxo. Smith. Kline EDCTP — European and Developing Countries Clinical Trials

СХЕМА РАЗВИТИЯ МУКОЗАЛЬНОГО ИММУННОГО ОТВЕТА CD 4 Th 2 Th 1 Патогены IL-1 IL-6 IL-8 Дендритная клетка CD 28 Клеточный иммунный ответ Синтез Ig. A IFNγ TGFβ, IL-4, 5 IL-12 Эпителий Макрофаг. В Т ТТМ-клетка АГ Дендритная клетка Эпителий. ПЕЙЕРОВА БЛЯШКА Общая схема формирования мукозального ответа Схема формирования мукозального ответа в тонком кишечнике

Концепция «съедобной вакцины» • чужеродные белки способны синтезироваться в клетках трансгенных растений в их природной, иммунологически активной форме • антигены (природный и синтезируемый трансгенными растениями) вызывают однотипные иммунологические реакции • при пероральной доставке антигены способны проходить через желудочно-кишечный тракт теплокровных • адаптивный мукозный иммунитет • стабильность целевого иммуногена при хранении • стандартизация иммуногена

Антигены M. tuberculosis для экспрессии в растениях Вид растения Антиген, комбинация антигенов Экспрессионная система Авторы Nicotiana tabacum L. Ag 85 B , ESAT 6, и слитый белок ESAT 6/ Ag 85 B Вирусная (ВТБ) Dorokhov Y. L. , et al. 2007 Агробактериальная трансформация ESAT 6 в составе слитого белка ESAT-2 A-CP Вирусная ( PVX , Х-вирус картофеля) Zelada A. M. , et al. 2006 Ag 85 B/ESAT 6 Агробактериальная трансформация Floss D. M. , et al. 2010 Arabidopsis thaliana L. ESAT -6 в составе слитого белка LTB — ESAT -6 Агробактериальная трансформация Rigano M. M. , et al. 2006; Rigano M. M. , et al. Lactuca sativa L. Ag 85 B , ESAT 6, и слитый белок ESAT 6/ Ag 85 B Агробактериальная трансформация Матвеева и др. ,

Схема сборки целевого гена и Т-области бинарной плазмиды Ca. MV 35 SRB t. NOSnpt IIp. NOS t. NOSuid. Acfp 10 esat 6 d. IFN LBBam. H IXba I cfp 10 -esat 6 — d. IFN (1070 bp)Xba I Bam. H Icfp 10 (303 bp) d. IFN (469 bp) up 1 up 3 lo 1 esat 6 (288 bp) up 2 lo 2 link

Создание трансгенных растений моркови с генами est 6, cfp 10 M. tuberculosis и d. IFN человека а б 6 k. Da ESAT 616 k. Da CFP 10 -ESAT 6 32 k. Da CFP 10 -ESAT 6 –d. IFN 50 k. Da Результаты ПЦР с геномными ДНК трансгенной моркови Вестерн-блот-анализ белковых экстрактов из корнеплодов трансгенных растений моркови. 1 – 3– ДНК трансгенных растений; 4 — ДНК нетрансгенного растения; 5– положительный контроль (p. Bi 121 -CFP 10 -ESAT 6 -d. IFN); 6 — отрицательный контроль (без матричной ДНК); 7– маркёр длин фрагментов ДНК (в bp). а) контроль — очищенный r. CFP 10 -ESAT 6 -d. IFN, наработанный в E. сoli (10 нг); b) экстракт корнеплодов трансгенной моркови.

0 сутки — первая иммунизация 13 сутки 14 сутки — вторая иммунизация 21 -й сутки Иммунизация Сбор биологических образцов. ESAT-6 CFP-10 Контроль 1 М одель 1 ( пероральная доставка антигенов) CFP 10 -ESAT 6 -d. IFN Экспери м ентальны е м од ели • линия мышей BALB/c • самцы • возраст 6 -7 недель ESAT-6 CFP-10 Контроль 2 М одель 2 ( инъекционная доставка антигенов) CFP 10 -ESAT 6 -d. IFN 28 -й сутки Лабораторные животные в SPF -виварии

Подготовка биологического материала 13 день 21 день 28 день Без антикоагулянта (для ИФА) С добавлением антикоагулянта (РБТЛ)

Оценка гуморального иммунитета *** • иммунизация химерным белком повышает уровень анти-ESAT, а иммунизация CFP 10, наоборот, снижает; • инъекции CFP 10 -ESAT 6 -d. IFN приводили к максимальному росту антител, специфических для данного антигена; • при пероральной доставке химерного белка, статистически значимое превышение контрольного уровня отмечено только для анти-ESAT ; • при пероральной доставке к химерному белку наработки специфических антител не выявлено пероральноинъекционно

Estimation of cell-mediated immunity Индекс стимуляции для ESAT 6 #*** #** Статистически значимое (# — p < 0. 05 ) превышение контрольного уровня было отмечено у животных , иммунизированных: а) ESAT 6 или химерным белком; б) CFP 10 и химерным белком; в) у всех иммунизированных животных. а б в РБТЛ

Спасибо за внимание!