ПРАВИЛА НАПРАВЛЕНИЯ И ПОДГОТОВКИ МАТЕРИАЛА ДЛЯ МОРФОЛОГИЧЕСКОГО ИССЛЕДОВАНИЯ

ПРАВИЛА НАПРАВЛЕНИЯ И ПОДГОТОВКИ МАТЕРИАЛА ДЛЯ МОРФОЛОГИЧЕСКОГО ИССЛЕДОВАНИЯ. МЕТОДЫ, АЛГОРИТМЫ И СТАНДАРТЫ МОРФОЛОГИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ

ПРАВИЛА НАПРАВЛЕНИЯ БИОПСИЙНОГО И ОПЕРАЦИОННОГО МАТЕРИАЛА В ПАТОЛОГОАНАТОМИЧЕСКИЕ УЧРЕЖДЕНИЯ • • Обязательность направления диагностических биопсий, операционного материала, последов и самопроизвольно отделившихся (выделившихся) кусочков тканей на ПА исследование. Доставка с направлением установленной формы (014/у) или компьютерной формой направления, которое должно содержать: наименование лечебного учреждения, ФИО, возраст и пол больного, номер амбулаторной или стационарной карты, дата и время взятия материала, количество объектов и место взятия материала (при необходимости – схема), предполагаемый клинический диагноз, проводимое или проведенное ранее лечение, данные предшествующих исследований, ФИО врача, другая важная информация. Соблюдение маркировки материала. Нефиксированный материал доставляется только непосредственно после операции. Доставка материала в 10% формалине (другие фиксаторы по согласованию с ПАО) не позже 24 часов. Полнота доставки материала. Ответственность за качество несет зав. клиническим отделением, откуда поступает материал.

ОСНОВНЫЕ МЕТОДЫ ПАТОГИСТОЛОГИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ • • Общегистологические (обзорные) – окраска гематоксилином и эозином Специальные - выявление тканевых и клеточных структур (коллагеновых волокон, эластических волокон, ретикулярных волокон, миофибрилл, базальных мембран, аргирофильных клеток), бактерий, грибов. Гистохимические - выявление веществ в структурах (слизь, жиры, ионы металлов, пигменты, гормоны и т. д. ) Иммуногистохимические (выявление тканевых и клеточных антигенов) Цитогенетические Молекулярно-генетические Электронная микроскопия

ДИАГНОСТИКА СООТВЕТСТВЕННО ХАРАКТЕРУ ПАТОЛОГИЧЕСКОГО ПРОЦЕССА И СТАНДАРТАМ • • • Биоптаты печени: Г+Э, окр. по Ван Гизон, окр. по Шиката, PAS-реакция, ИГХметоды. Биоптаты почек: Г+Э, PAS-реакция, окр. по Массону, импрегнация Ag. NOз, ИГХ -методы. Гастробиоптаты: Г+Э, PAS-реакция+альциановый синий, окраска НР, ИГХметоды. Биоптаты кроветворных органов: Г+Э и/или по Романовскому-Гимзе, ИГХметоды. Биоптаты молочной железы: Г+Э, ИГХ-методы. И т. д. ПРИНЦИП РАЗУМНОЙ ДОСТАТОЧНОСТИ

Окр. по Ван Гизон

PAS-реакция и импрегнация Ag. NOз

Окр. по Гимзе

PAS-реакция

Окр. по Циль Нильсену и аурамином

PAS-реакция

Окр. Суданом III

Окр. альциановым синим

Реакция Перлса

Окраска конго красным

?

ОСНОВЫ ИММУНОГИСТОХИМИЧЕСКОЙ ДИАГНОСТИКИ

ИММУНОГИСТО(ЦИТО)ХИМИЯ • Метод, основанный на выявлении наличия и локализации тканевых/клеточных антигенов в гистологических(цитологических) препаратах с помощью специфических антител

ЭТАПЫ РАЗВИТИЯ ИММУНОГИСТОХИМИИ 1941 Coons A. Получение меченых антител. Прямой метод 1950 Coons A. Непрямой иммунофлюоресцентный метод 1966 Иммуноферментный метод. Пероксидаза в качестве метки антител 1974 Sternberg L. Первое издание руководства «Иммуноцитохимия» 1975 Kohler G. , Milstein C. Получены гибридомы, продуцирующие АТ 1979 Получены АТ к пероксидазе. Разработка ПАП метода 1981 Разработка авидин-биотиновых методов 1998 Оптимизированные системы ИГХ окрашивания (DAKO)

СХЕМА ИГХ-РЕАКЦИИ С ОДНОШАГОВОЙ ПОЛИМЕРНОЙ СИСТЕМОЙ ДЕТЕКЦИИ

ГИБРИДОМЫ – ИСТОЧНИК МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ КЛЕТКИ ПЛАЗМОЦИТОМЫ + = ЛИМФОЦИТЫ ОТ ИММУНИЗИРОВАННОГО ЖИВОТНОГО «БЕССМЕРТНЫЕ» ГИБРИДНЫЕ КЛЕТКИ, ПРОДУЦИРУЮЩИЕ АНТИТЕЛА

ОСНОВНЫЕ ОБЛАСТИ ПРИМЕНЕНИЯ ИММУНОГИСТОХИМИИ 1. ВЫЯВЛЕНИЕ ИНФЕКЦИОННЫХ АГЕНТОВ 2. ДИАГНОСТИКА ИММУНОПАТОЛОГИЧЕСКИХ ПРОЦЕССОВ 3. ВЫЯВЛЕНИЕ ПРОДУКТОВ ПАТОЛОГИЧЕСКОГО МЕТАБОЛИЗМА 4. § § ОНКОМОРФОЛОГИЯ ОПРЕДЕЛЕНИЕ ГИСТОГЕНЕЗА ОПУХОЛЕЙ ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНАЯ ДИАГНОСТИКА ОПУХОЛЕЙ ОПРЕДЕЛЕНИЕ БИОЛОГИЧЕСКОГО ПОТЕНЦИАЛА ОПРЕДЕЛЕНИЕ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ К СПЕЦИФИЧЕСКОЙ ТЕРАПИИ

1994 г. Taylor C. R. Ретроспективный пересмотр 20 000 низкодифференцированных опухолей Первоначальный гистогенетический диагноз оказался ошибочен в 50% случаев

Окраска конго красным

Hep. B CMV

УЛЬТРАСТРУКТУРНЫЕ И ИГХ МАРКЕРЫ ОПУХОЛЕЙ (По С. В. Петрову, Н. Т. Райхлину) ЭМ ИГХ НЕЙРОЭНДОКРИННЫЕ ОПУХОЛИ НЕЙРОСЕКРЕТОРНЫЕ ГРАНУЛЫ ХРОМОГРАНИН, СИНАПТОФИЗИН, БЕЛОК S-100, NSE МИОГЕННЫЕ ОПУХОЛИ МИОФИЛАМЕНТЫ, ПРОМЕЖУТОЧНЫЕ ФИЛАМЕНТЫ, МИКРОФИЛАМЕНТЫ МИОЗИН, ДЕСМИН, АКТИН ЭПИТЕЛИАЛЬНЫЕ ОПУХОЛИ ТОНОФИБРИЛЛЫ, СЕКРЕТОРНЫЕ ГРАНУЛЫ ЦИТОКЕРАТИНЫ, ОРГАНОСПЕЦИФИЧЕСКИЕ МАРКЕРЫ МЕЛАНОМА ПРЕМЕЛАНОСОМЫ, МЕЛАНОСОМЫ ТИРОЗИНАЗА, НМВ 45, Melan. A

АНТИГЕНЫ – МИШЕНИ ИГХ-ДИАГНОСТИКИ 1. Цитоспецифические антигены 2. Тканеспецифические антигены 3. Антигены, связанные с биологическими потенциями (чувствительность к гормонам, пролиферация, апоптоз)

?

?

CK

М, 64 года. В 2006 г. – удаление меланомы кожи В 2007 г. – левосторонняя гемиколэктомия по поводу опухоли сигмовидной кишки Первичный гистологический диагноз – недифференцированная лейомиосаркома Пересмотр в ООД – недифференцированный рак

CD 34 Vim

SMA

S-100 НМВ 45

Отрицательные реакции: CKpan, CD 34, CD 117, SMA Позитивные реакции: Vimentin, S-100 Слабо позитивные (? ) реакции: НМВ 45 ИГХ диагноз: беспигментная меланома толстой кишки, вероятнее метастатическая

СЛУЧАЙ 5790/20858 Case N 1 • Ж, 58 ЛЕТ • КЛИНИЧЕСКИЙ ДИАГНОЗ – МЕТАСТАЗ В КОЖУ БЕДРА • МАКРОСКОПИЧЕСКИ – УЧАСТОК КОЖИ С ПОСЛЕОПЕРАЦИОННЫМ РУБЦОМ, УЗЛОМ 3, 0 СМ • ГИСТОЛОГИЧЕСКИЙ ДИАГНОЗ – ЛИМФОБЛАСТНАЯ ЛИМФОСАРКОМА

Vimentin

CD 45

Pan. CK

Pan. CK

ИММУНОФЕНОТИП: CD 45 + в малочисленных лимфоцитах Pan. CK +++ в опухоли с пятнистым типом реакции HMB-45 EMA ++ в опухоли Vimentin + в стромальных элементах и сосудах S-100 – (фоновое окрашивание)

СЛУЧАЙ 5790/20858 ПЕРВИЧНЫЕ ДАННЫЕ (пересмотр № 5790): • МАРТ 2006 г. – ПОЛИПОВИДНЫЙ КРАСНОВАТО-КОРИЧНЕВЫЙ УЗЕЛ 0, 8 СМ НА КОЖЕ БЕДРА • ГИСТОЛОГИЧЕСКИЙ ДИАГНОЗ – МЕЛКОКЛЕТОЧНАЯ МЕЛАНОМА • В АНАМНЕЗЕ ХРОНИЧЕСКИЙ ЛИМФОЛЕЙКОЗ

Pan. CK

Pan. CK

Chromogranin

Chromogranin

HMB-45

ИММУНОФЕНОТИП Pan. CK +++ в опухоли с пятнистым типом реакции HMB-45 EMA ++ в опухоли Vimentin + в стромальных элементах и сосудах S-100 – (фоновое окрашивание) Chromogranin A +++

ДИАГНОЗ: 5790 – РАК КОЖИ ИЗ КЛЕТОК Меркеля 20858 – РЕЦИДИВ РАКА КОЖИ ИЗ КЛЕТОК Меркеля

Роль ИГХ и оценка результатов ØИГХ всегда является дополнением и расширением к рутинному патогистологическому исследованию. ØПри очевидном отсутствии объектов исследования в рутинном материале, при ИГХ исследовании они не появятся. Ведущая роль ИГХ: ØПри значимости определения биологических свойств опухолей для лечения ØПри лимфопролиферативных и пограничных изменениях ØПри диагностике недифференцированных опухолей (мелкоклеточные, веретеноклеточные, анапластические плеоморфные…) ØПри диагностике гистологически сходных мягкотканных новообразований (дерматофиброма/ДФС; клеточные лейомиомы/лейомиосаркомы, лейомиомы/GIST…) ØВ некоторых случаях при диагностике пограничных новообразований (переходноклеточные, шейки матки, нейроэндокринных, простаты) Вспомогательная роль ИГХ: ØПри диагностике источников метастазов Оценка результатов часто интерпретационная, а не констатирующая

Опухоли и опухолеподобные изменения МЖ

CK 34 BE 12 SMA

CK 34 BE 12

Диагностика лимфопролиферативных заболеваний

Иммуногистохимические суррогаты генетических вариантов ДККЛ

Bcl-2 CD 20 FOXP-1

ФЛ in situ

Гастробиоптат Клин: рак желудка

CK AE 1/3 CD 20

CD 20 CD 43 Cyc. D 1

Диагностика опухолей мягких тканей

CD 117 SMA

MMP-1

Гистогенез новообразований

mts

HMB 45 Vim

Образование 1 пальца стопы

HMB 45

CK Vim

Calretinin

Chr. A СК 20 М. , 60 лет. Метастаз в шейный лимфоузел

Простата; аутопсия

СК 20 Chr. A

Биопсия простаты 5 месяцев назад

TTF-1 в гепатоцитах CD 34 в синусоидных капиллярах гепатоцеллюлярных опухолей

TTF-1 Направительный диагноз: анапластическая астроцитома GFАР

Дисплазии и рак шейки матки

Р 16 – ингибитор Cdk 4, 6. контролирует G-S переход p. RB E 2 F Ген р16 Деградация р53 E 6/E 7 p. RB E 2 F Активация клеточного цикла Ген р16 Гиперэкспрессия р16

Ki 67 H&E Case 295 p 16

p 16 INK

Ki 67 CIN II p 16 INK Ca in situ

Сравнение классификаций дисплазий и карциномы in situ шейки матки Дисплазия CIN Richart R. M. (1973) Биологическая сущность Bethesda system (2001) Биологическая сущность Reagan J. W. , Hamonic M. J. (1956) Изменения В отечеств. литературе Слабая 1/3 эпителия I CIN I Продуктивная фаза HPV инфекции LGSIL Продуктивная фаза HPV инфекции Умеренная до ½ эпителия II CIN II Этапы неоплазии HGSIL Этапы неоплазии Тяжелая 2/3 эпителия III CIN III Ca in situ Весь пласт Ca in situ Инвазивны й рак Инвазивный рак LGSIL – low grade squamous intraepithelial lesion HGSIL – high grade squamous intraepithelial lesion Инвазивный рак

до 10% более 12%

Переходноклеточные новообразования Рак простаты и доброкачественные изменения

p 504 S+p 63

Диагностика НЭО

Chr. A Lung tumor Ki 67

CK Биопсия шейки матки: §лимфома §плоскоклеточный неороговевающий рак Chrom p 16

FISH

Fluorescent In Situ Hibridization

днк ТРАНСКРИПЦИЯ m-RNA СИНТЕЗ БЕЛКОВ ПРОДУКТ ИГХ РЕАКЦИИ

РЕЗУЛЬТАТЫ ИММУНОГИСТОХИМИЧЕСКИХ РЕАКЦИЙ КАК СУРРОГАТНЫЕ МАРКЕРЫ ГЕНЕТИЧЕСКИХ ИЗМЕНЕНИЙ Мутации в лимфомах: днк ТРАНСКРИПЦИЯ m-RNA Фолликулярная лимфома t (14: 18) – bcl-2 Лимфома из клеток зоны мантии t (11; 14) – cyclin D 1 AKKL t (2; 5) – ALK-protein СИТЕЗ БЕЛКОВ ПРОДУКТ ИГХ РЕАКЦИИ

IN SITU ГИБРИДИЗАЦИЯ – МЕТОД ВЫЯВЛЕНИЯ НУКЛЕОТИДНЫХ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ В КЛЕТКАХ (ИХ ЯДРАХ) ПРИ СОХРАНЕНИИ ОБЩЕЙ СТРУКТУРЫ ТКАНЕЙ И КЛЕТОК üНа парафиновых срезах üЗамороженные срезы üЦитологические препараты üУльтратонкие срезы

ПРАКТИЧЕСКОЕ ПРИМЕНЕНИЕ …ISH üДиагностика амплификации гена Her 2/neu üДиагностика лимфопролиферативных заболеваний • ХЛЛ • Фолликулярная лимфома • Лимфома Беркитта • Лимфома зоны мантии • Лимфома MALТ типа üДиагностика хронического миелолейкоза t(9; 22)(q 34; q 11) üДиагностика рака мочевого пузыря (эксфолиативный материал) üДиагностика герминогенных опухолей üДиагностика нейрогенных опухолей (нейробластома – n-myc) üДиагностика меланоцитарных новообразований üДиагностика синовиальной саркомы üДиагностика саркомы Юинга (t 9(11; 22)(p 11; q 11) üДиагностика липосаркомы

СХЕМА FISH РЕАКЦИИ Хромосома Ген Флуоресцентная метка ДНК-зонд Метка по принципу комплементарности А-Т Г-Ц

Хромогенная ISH - CISH Из материалов проф. С. В. Петрова

ДНК – пробы Центромерные Локус-специфические Хромосомные

Центромерные пробы Норма Делеция Трисомия Локус-специфические пробы Норма Делеция Амплификация

А- Her 2/neu А+

транслокация