Практическое занятие № 2 Методы микроскопических наблюдений Микроэлектродные и радиоизотопные методы Анализ химического состава микроорганизмов Для студентов биологических специальностей по дисциплине «Экология микроорганизмов»
Особенности микроскопии микроорганизмов Микроскопические методы наблюдения – способы изучения очень мелких, неразличимых невооруженным глазом объектов с помощью микроскопов. Разрешающая способность (Е) – это минимальное расстояние между двумя точками, которые можно видеть раздельно: Е = λ/A, где λ - длина световой волны; A - числовая апертура.
Принципы исследований Темнопольная микроскопия позволяет наблюдать живые бактерии. При этом микроорганизмы выглядят ярко светящимися на черном фоне. При этом способе микроскопии могут быть обнаружены мельчайшие микроорганизмы, размеры которых лежат за пределами разрешающей способности микроскопа. Позволяет увидеть только контуры объекта, но не дает возможности изучить внутреннюю структуру. Препараты для исследования в темном поле готовят на очень чистых предметных и покровных стеклах определенной толщины: предметные – не более 1, 2 мм, покровные – 0, 17 мм. Лептоспира в темном поле (микрофотография) Фазово-контрастная микроскопия позволяет изучать живые и неокрашенные объекты, клетки в культуре ткани за счет повышения их контрастности. Распространение световых волн в прозрачных однородных объектах не сопровождается потерей интенсивности света. Фазово-контрастная микроскопия Bacillus сereus на плотной питательной среде 3
Принципы исследований Люминесцентная (флюоресцентная) микроскопия основана на способности некоторых веществ люминесцировать, т. е. светиться при освещении невидимым ультрафиолетовым или синим светом. Флюорохромирование - окрашивание сильно разведенными растворами флюоресцирующих красителей (флюорохромов). Метод используется для бактериоскопического исследования возбудителей некоторых инфекций: туберкулеза (ауромин), включений в клетках, образуемых некоторыми вирусами и др. Этот же способ может применяться для цитохимического изучения живых и фиксированных микроорганизмов: некоторые флюорохромы избирательно связываются с полимерами клетки. В электронном микроскопе вместо света для построения изображения используют поток электронов в вакууме. Наиболее широко применяются просвечивающая (трансмиссивная) и сканирующая электронная микроскопия. Просвечивающая электронная микроскопия применяется для изучения ультратонких срезов микробов, тканей, а также строения мелких объектов (вирусов, жгутиков. и др. ), контрастированных фосфорновольфрамовой кислотой, уранилацетатом, напылением металлов в вакууме и др. Сканирующая электронная микроскопия применяется для изучения поверхности объектов. Препарат риккетсий, окрашенный с помощью РИФ S. аureus. Сканирующая электронная микроскопия
Особенности микроскопии микроорганизмов Øустранение рассеивания применение исключительно иммерсионной системы, состоящей из исследуемого объекта, иммерсионных масла (показатель преломления близок к показателю преломления стекла) и объектива; Øмаксимальная освещенность препарата; Øиспользование красителей из-за малой контрастности микроорганизмов.
Использование красителей Ø Красители – это относительно низкомолекулярные органические вещества, обладающие повышенным сродством к определенным химическим компонентам клетки. Ø Окрашивание позволяет выявлять внутриклеточные структуры, обладающие повышенным сродством к определенным красителям. Выбор красителя связан с характером фиксации и различными методами предварительной обработки клеток. Ø Различают: § основные (щелочные) - избирательно окрашивают базофильные клеточные структуры, характеризующиеся кислотными свойствами; § кислотные - избирательно окрашивают ацидофильные/оксифильные клеточные, характеризующиеся щелочными свойствами; § нейтральные - окрашивают и базофильные, и ацидофильные структуры. Ø Для прижизненной окраски клеток используются наименее токсичные красители, приготовленныев виде водных растворов (метиленовый синий, трипановый синий). Ø Красители для фиксированных клеток могут использоваться в чистом виде (водные или спиртовые растворы, ) – эозин, фуксин. Ø Часто используют смеси красителей, например, смесь Романовского–Гимза, азур–эозин, метилблау–эозин.
Использование красителей Ø Флуорохромы - вещества, применяемые в люминесцентной, или флуоресцентной, микроскопии для обработки объектов, не обладающих природной способностью люминесцировать. Флуорохромами являются красители (аурамин, корифосфин и др. ), пигменты и их производные (хлорофилл, порфирины), некоторые алкалоиды (берберин) и др. Ø Возбуждение люминесценции микроскопических объектов, окрашенных флуорохромами, производится ультрафиолетовым, фиолетовым и синим светом. Преимущества флуоресцирующих красителей: − возможность использования метода прижизненной окраски; − использование минимальных концентрациях (1: 100000 – 1: 5000000), что значительно снижает повреждающее воздействие на клетку и позволяет изучать объект в наиболее физиологических условиях; − Высокая скорость работы. ØВыделяют: − щёлочные – характеризуются тем, что находятся в кислой среде в сильно диссоциированном состоянии. Флуоресцирующим компонентом краски является положительно заряженный катион. В сильно щёлочных растворах такие краски находятся в недиссоциированном состоянии; − кислые – диссоциируются в щёлочной среде. Флуоресцирующим компонентом краски является отрицательно заряженный анион; − электронейтральные – слабо кислые или слабо щёлочные краски, диссоциация которых при флуорохромирова.
Микроэлектродные методы Методы исследования с использованием микроэлектродов получили свое название потому, что диаметр их регистрирующей поверхности составляет около одного микрона. Бывают металлическими и стеклянными. Ø Металлический микроэлектрод представляет собой стержень из специальной высокоомной изолированной проволоки с регистрирующим кончиком. ØСтеклянный микроэлектрод диаметром около 1 мм изготавливается из специального стекла - пирекса, с тонким незапаянным кончиком, заполненным раствором электролита. Микроэлектроды позволяют проникать в микроокружение клеток в природных эконишах, измеряя там градиент р. Н, температуры, концентрации кислорода и т. д.
Микроэлектродные методы Схема измерений мембранного потенциала покоя с помощью внутриклеточного стеклянного микроэлектрода (М). Второй электрод (И) помещен в омывающую клетку жидкость.
Радиоизотопные методы n В биологии в основном применяются изотопы с β- и γ-излучениями. Выбор изотопа определяется применяемым методом, его удельной активностью, энергией, периодом полураспада и другими факторами, от которых зависит эксперимент. Изотоп Период полураспада Тип распада Энергия Мэ. В Тритий 12, 26 лет β 0, 018 Углерод-14 5568 лет β 0, 155 Сера-35 87, 2 сут β 0, 167 Хлор-36 3*105 лет β 0, 714 Фосфор-32 14, 3 сут β 1, 710 Иод-131 8, 06 сут γ 0, 810 Иод-125 60 сут γ 0, 035
Радиоизотопные методы 11
Идентификация микроорганизмов по их липидному профилю Липидный состав микроорганизмов отличается друг от друга. Существует 6 классов липидов, каждый из которых состоит из индивидуальных с 6 и более структурными особенностями, это легло в основу идентификации микроорганизмов, но микроорганизмы могут менять свой профиль в зависимости от возраста культуры и условий культивирования клеток. Ø Анализ основан на изучение и сравнение метиловых эфиров жирных кислот, входящих в состав липидов. Ø Процесс включает эстерификацию липидов, метилирование входящих в их состав жирных кислот, их разделение на хроматографических колонках и количественное определение с помощью газовой хроматографии или высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). Ø 12
Идентификация микроорганизмов по их липидному профилю Ø Специальным образом обработанные колонки дают хорошее разрешение МЭЖК, что позволяет сравнивать их время удерживания с ранее идентифицированными липидными профилями (стандарты). Количество каждой жирной кислоты можно рассчитать по площади хроматографического пика, а абсолютные концентрации – при введении внутреннего стандарта. Интерпретация результатов, однако, иногда встречает значительные трудности вследствие идентичности многих липидов у различных представителей изучаемого микробного сообщества. Ø Липидомика – идентификация и количественное измерение липидов биологического объекта.
Фенотипическая идентификация микроорганизмов Идентификация осуществляется на основе изучения фенотипических характеристик изучаемого микроорганизма и сравнения их с характеристиками известных видов. При этой работе часто применяют эталонные штаммы микроорганизмов, стандартные антигены и иммунные сыворотки к известным прототипным микроорганизмам. При фенотипической идентификации изучают следующие характеристики: 1. Морфологические - форма, величина, особенности взаиморасположения, структура. 2. Тинкториальные - отношение к различным красителям (характер окрашивания), прежде всего к окраске по Граму. 3. Культуральные - характер роста микроорганизма на питательных средах. 4. Биохимические - способность ферментировать различные субстраты, образовывать в процессе жизнедеятельности различные биохимические продукты 5. Антигенные - зависят преимущественно от химического состава и строения клеточной стенки, наличия жгутиков, капсулы, выявляются в иммунологических реакциях. 6. Физиологические - способы углеводного, азотного и других видов питания, тип дыхания. 7. Подвижность и типы движения. 8. Способность к спорообразованию, характер спор. 9. Чувствительность к бактериофагам, фаготипирование. 10. Химический состав клеточных стенок - основные сахара и аминокислоты, липидный и жирнокислотный состав. 11. Белковый спектр (полипептидный профиль). 12. Чувствительность к антибиотикам и другим лекарственным препаратам.
Некультивируемые формы бактерий (НФБ) Некультивируемым состоянием называют такое состояние микроорганизмов, при котором они прекращают рост на питательных средах в ответ на действие неблагоприятных факторов, но сохраняют жизнеспособность, а при улучшении условий культивирования возобновляют пролиферацию. Ø Данные формы нельзя культивировать в лабораторных условиях, поскольку НФБ не росту на твердых питательных средах Ø Некультивируемые состояния бактерий представлены разровидностями : споры , дормантные формы и цистоподобные рефрактерные клетки. Ø Обнаружены у многих патогенных видов. Ø Микрокосмы- экспериментальные системы, моделирующие факторы естественной среды обитания (температура, вода различного состава и солености, аэрация, видимый свет). Ø
Распространение НФБ Микроорганизмы некультивируемых форм и состояний обнаружены в организме человека и животных, в продуктах питания, в объектах окружающей среды: в воде, в почве. Обнаружены у многих патогенных видов. Enterococcus faecalis Vibrio cholerae Аgrobacterium tumefaciens
Индукторы некультивируемого состояния физические индукторы некультивируемого состояния: Ø температура(от +0, 5 до +7 0 С) Ø аэрация Ø солнечной радиации Ø g-лучи химические индукторы некультивируемого состояния: Ø микроэлементы Ø макроэлементы Ø антибиотики Ø дезинфектанты биотические индукторы некультивируемого состояния: Ø Listeria monocytogenes в ассоциации с зелеными водорослями или в присутствии их экзометаболитов способствовали переходу в некультивируемое состояние. Ø синезеленые водоросли и их экзометаболиты ускоряли образование некультивируемого состояния Yersinia pseudotuberculosis.
Индукторы реверсии некультивируемых состояний физические индукторы некультивируемого состояния: Ø температура(повышение до 37 0 С) Ø g-луч и(исключение воздействия) химические индукторы некультивируемого состояния: Ø микроэлементы Ø макроэлементы Ø группа соединений, разрушающих перекись водорода (антиоксиданты). К таким соединениям относят пируват натрия, каталазу, витамин Е биотические индукторы некультивируемого состояния: Ø фетальная сыворотка Ø супернатант растущей культуры или выделенный из нее рекомбинантный белок Rpf Ø фактор некроза опухоли Ø пассаж через восприимчивый организм
Методы обнаружения некультивируемых форм прямой подсчет жизнеспособных клеток (предварительное добавление питательных веществ и налидиксовой кислоты); Ø молекулярно-генетические методы: полимеразная цепная реакция (ПЦР) и ее различные модификации, лигазная цепная реакция, техника гибридизации тотальной клеточной РНК, ПЦР с обратной транскриптазой; Ø применение флуоресцирующих моноклональных антител. Ø
Скачать презентацию Практическое занятие 2 Методы микроскопических наблюдений Микроэлектродные
практика 2 ЭМ.ppt