Практические основы спектроскопии ЯМР Валентин Новиков Книги

Практические основы спектроскопии ЯМР Валентин Новиков

Книги по ЯМР Особо рекомендуется: • Методичка «Практический курс спектроскопии ядерного магнитного резонанса» , И. Э. Нифантьев, П. В. Ивченко, химфак МГУ • Фримен, Магнитный резонанс в химии и медицине • Richards and Hollerton, Essential Practical NMR for Organic Chemistry • Jacobsen, NMR Spectroscopy Explained Дополнительно: • Levitt, Spin Dynamics • Hore, NMR: the Toolkit • Friebolin, Basic One- and Two-Dimensional NMR Spectroscopy Не рекомендуется: • Блюмих, Основы ЯМР, 2007 (английский оригинал – хороший) • Эрнст, Боденхаузен, Вокаун, ЯМР в одном и двух измерениях • Бакс, Двумерный ядерный магнитный резонанс в жидкости

ЯМР – то же, что и МРТ, но для химии What is NMR

ЯМР и МРТ Nobel prize for NMR (Physics) 1952 Edward Purcell Felix Bloch Nobel prize for MRI (Medicine) 2003 Peter Mansfield Paul Lauterbur

Спектроскопия ядерного магнитного резонанса

Резонанс Определение: Способность системы осциллировать с большей амплитудой при каких-то конкретных частотах

Механический резонанс Отсутствие резонанса Слишком частое или слишком редкое возмущение не влияет на амплитуду осцилляций, либо даже уменьшает ее

Механический резонанс Система в резонансе Небольшое воздействие, производимое с правильной частотой приводит к увеличению амплитуды осцилляций: происходит поглощение энергии

Resonance: collapsed bridge

Resonance: 17 people shake the building “It just happens to be that the vibration cycle caused by Tae Bo collided with the vertical vibration cycle unique to the building…”

Ядерный магнетизм Ядра очень малы Ядра изолированы Их сложно изучать Некоторые ядра обладают магнитными свойствами Ядерный спин – собственный момент количества движения, имеющий квантовую природу и не связанный с перемещением частицы как целого. 0 for 12 C, 16 O, 18 O … ½ for 1 H, 13 C, 15 N, 19 F, 31 P … 1 for 2 H, 14 N … 3/2, 2, 5/2… немагнитные ядра «хорошие» ядра квадрупольные, «плохие» ядра

Вращение без вращения Заряженная частица Магнитное поле Частица вращается Заряженное ядро Магнитное поле Наблюдается прецессия n 0 g B 0 Прецессия магнитного момента Вращается ли ядро? Ларморова частота Гиромагнитное отношение (характеристика ядра) Индукция магнитного поля

Двухуровневая система Энергия “Спин вниз” b Нет поля Увеличение B 0 “Спин вверх” a

Magnetic resonance spectroscopy

Заселенности уровней Переходы происходят как сверху вниз, так и снизу вверх 100000 100001 При комнатной температуре: k. T = 2478 Дж/моль При B 0 = 7. 05 Тл (300 МГц): DE = 0. 0315 Дж/моль

Как повысить чувствительность? нужно сделать как можно меньше • Уменьшить температуру – Раствор замерзает • Увеличить DE – Увеличить g (исследовать протоны, а не 13 C) – Увеличить B 0 (более сильный магнит) • Временно нарушить распределение Больцмана (DNP)

Увеличение напряженности поля ~ 12 000 € ~ 4 500 000 € ~ 2 000 € ~ 600 000 €

Химический сдвиг Магнитное поле на ядре отличается от поля магнита Электроны экранируют ядро s – безразмерная константа экранирования d – химический сдвиг, изменение резонансной частоты ядра в результате экранирования электронными облаками Измеряется в миллионных долях (м. д. ) от ларморовой частоты.

Причина возникновения химического сдвига

Почему «химический» ? Заместители изменяют электронную плотность вокруг ядра Акцепторные группы: оттягивают часть электронов ⇒ уменьшают экранирование CHBr 3 CH 2 Br 2 CH 3 Br ТМС Ненасыщенные группы (C=O, C=C, ароматика): снижают экранирование за счет индуцированных токов

Кольцевые токи в бензольном кольце

Диапазоны химических сдвигов для 1 H и 13 C

Терминология Увеличение d «Слабое поле» “Down field” Высокая частота Понижение экранирования Уменьшение d «Сильное поле» “Up field” Низкая частота Усиление экранирования

Интегральная интенсивность CH 3 CH 2 OH OH CH 2 CH 3 В спектре наблюдается несколько сигналов, соответствующих группам эквивалентных протонов. Интегральная интенсивность сигнала (площадь) пропорциональна числу эквивалентных ядер

Симметрия: плоскость

Поворотная ось

Метильные группы: быстрое вращение Полное усреднение при комнатной температуре

Конформационный обмен «кресло-кресло» Комнатная температура 200 K 1 сигнал 2 сигнала

Задание: группы эквивалентных протонов

Задание: группы эквивалентных протонов • Cl-CH 2 -CH 3 • C 2 H 5 OH • (CH 3)2 CHOH

Задание: группы эквивалентных протонов

Задание: группы эквивалентных протонов C 2

Скалярное спин-спиновое взаимодействие

Триплет

Мультиплетность сигнала синглет 1 дублет 1 1 один протон триплет 1 2 1 два протона 1 3 3 1 три протона квадруплет нет соседних протонов квинтет 1 4 6 4 1 секстет 1 5 10 10 5 1 септет 1 6 15 20 15 6 1 четыре протона пять протонов шесть протонов

Дублет дублетов, J = 10, 4 Гц

Дублет триплетов, J = 10, 5 Гц

Триплет триплетов, J = 6, 3 Гц

Дублет-дублет-триплет, J = 4, 3, 1. 5

Правила спин-спинового взаимодействия • Эквивалентные ядра не расщепляются друг на друге • Константы взаимодействия уменьшаются при удалении ядер • Мультиплетность определяется числом взаимодействующих протонов (N + 1) • Взаимодействие с неэквивалентными протонами: – Мультиплетность (Na + 1)(Nb + 1) • Интенсивности пиков соответствуют треугольнику Паскаля • Константы взаимодействия не зависят от напряженности поля • Константы взаимодействия могут быть отрицательными

Константа спин-спинового взаимодействия J • Зависит от числа связей между ядрами – как правило, от одной до трех связей – Прямая (1 JCH), геминальная (2 JHH) и вицинальная (3 JHH) константы • Зависит от порядка связи – одинарная, двойная, тройная • Зависит от угла между связями – Торсионный угол в случае вицинальных протонов • Пропорциональна gagb JCH = 6. 5 * JCD • Измеряется в Гц – Диапазон от 0. 05 Гц до тысяч Гц

Зависимость 3 J от торсионного угла Спин-спиновое взаимодействие передается через связи Значение 3 J зависит от перекрывания орбиталей Минимальное перекрывание в случае перпендикулярных орбиталей (q = 90)

Информация, содержащаяся в спектре ЯМР • Химический сдвиг ядер – Химическое (электронное) окружение ядра – Не зависит от напряженности поля • Расщепление сигналов – Взаимодействие с соседними ядрами – Торсионные углы химических связей • Интегральные интенсивности – Число магнитно-эквивалентных ядер в группе – Зависит от релаксации

Спектр этанола

Пример протонного спектра

Пример протонного спектра

Пример решения задачи по ЯМР C 7 H 14 O 1. 0 1. 5 1. 8 3. 4 5. 8 5. 5 (d, 6 H) (d, 3 H) (m, 1 H) (d, 2 H) (d, 1 H) (m, 1 H)

Пример решения задачи по ЯМР C 10 H 18 O 2 0. 9 2. 1 2. 2 2. 5 1. 3 2. 3 (s, 6 H) (s, 3 H) (s, 2 H) (t, 2 H)

Более детальное рассмотрение химических сдвигов и спин-спинового взаимодействия

Измерение химического сдвига d – химический сдвиг, изменение резонансной частоты ядра в результате экранирования электронными облаками Химический сдвиг измеряют в миллионных долях (м. д. ) Долях чего? Почему не в герцах? Химический сдвиг, выраженный в м. д. не зависит от B 0

Химический сдвиг в герцах

Зависимость разрешения мультиплета от B 0

Химический сдвиг в герцах

Не всегда сильное поле - лучше

Улучшение разрешения

Системы высоких порядков Система первого порядка: Dd. AB >> JAB При увеличении B 0: Dd. AB (в Гц) увеличивается JAB не зависит от B 0 Усиление поля позволяет анализировать спектры ЯМР в рамках теории спектров первого порядка Спектры высоких порядков интерпретировать сложней

Эффект «крыши»

Система AB

Спектр высокого порядка

Эффект «крыши» для системы A 2 B 2

Система ABC, Jac = 0

«Крыша» в ароматике

Гетероядерная спектроскопия ЯМР

Диапазоны химических сдвигов для 1 H и 13 C

Спин-спиновое взаимодействие

Спектр без подавления

Гетероядерная развязка

Спектр с подавлением (развязкой)

13 C-спектр фенетола в D 2 O

13 C-спектр сахарозы в D 2 O

Особенности интерпретации протонных спектров

Алгоритм интерпретации спектров 1. Хорошо ли спектр записан? Хорошая форма линии, отношение сигнал/шум, разрешение, правильная фаза, базовая линия, правильные интегралы. 2. Идентификация сигналов растворителя и очевидных примесей. 3. Есть ли в предполагаемом соединении какие-то необычные фрагменты, ведущие к нестандартным спектрам (хиральный центр, затрудненное вращение, нестандартная стереохимия и т. д. )? 4. Можно ли идентифицировать сигналы, интеграл которых очевиден? 5. Отнесение сигналов в спектре, слева направо. 6. Каждый сигнал должен соответствовать предполагаемой формуле по трем параметрам: химический сдвиг, мультиплетность и интеграл. Если что-то не совпадает, то нужно найти причину. 7. Если есть серьезные расхождения – поиск другой возможной формулы. 8. Если окончательно соотнести спектр или определить строение соединения нельзя на основании только одного спектра, какой дополнительный эксперимент стоит провести? 13 C, двумерная спектроскопия, NOE? 9. Продолжать до полного соответствия предполагаемого строения спектрам.

Обменивающиеся протоны ROH, RCONH 2, RNHR’, RSH, RSO 3 H Быстрый обмен с присутствующими в растворителе протонами Широкие линии, отсутствие спин-спинового взаимодействия Исчезновение сигнала при регистрации спектра в D 2 O В апротонных растворителях – обмен заторможен Зависимость химического сдвига от температуры

Расщепление на амидных протонах

Добавление D 2 O для обмена

Добавление D 2 O для обмена

Широкие сигналы карбоксильных групп

Взаимодействие в ароматическом кольце орто мета пара 6. 0 – 9. 4 Гц, обычно 8. 0 Гц 1. 2 – 3. 1 Гц, обычно 2. 5 Гц 0. 2 – 1. 5 Гц, обычно не видно

Эффект заместителей в бензольном кольце -NO 2 0. 95 0. 17 0. 33 -Cl 0. 02 -0. 06 -0. 04 -NH 2 -0. 75 -0. 24 -0. 63

Фенил с одним нейтральным заместителем

Фенил с одним донорным заместителем

Фенил с одним акцепторным заместителем

Магнитная неэквивалентность JAB ≠JAB’ JA’B ≠JA’B’

Магнитная неэквивалентность

1, 3 – замещенный бензол

Тризамещенный бензол

Соли и свободные основания Пиридин + DCl Пиридин

Двойные связи Jab (цис-взаимодействие) Jaс (транс-взаимодействие) Jbс (геминальное взаимодействие) 7 -13 Гц, обычно 11 Гц 11 -18 Гц, обычно 16 Гц Примерно 1 -2 Гц

Двойная связь в стироле

Простейший ЯМР спектрометр • Образец • Магнит • Источник излучения (передатчик) • Детектор поглощения энергии (приемник)

Образец

Ампулы для ЯМР • Целые, без трещин и сколов – Стоимость ампулы: ~5 $ – Стоимость датчика: ~50000 $ • Тщательно закрытые – Целые крышки – Parafilm – Предпочтительно, тефлоновые • Чистые – Тщательно мыть – Не использовать хромовую смесь – Не сушить в печи

Влияние примесей на однородность поля

Однородность поля Неоднородное поле Несколько сигналов Однородное поле Единичный сигнал

Высота столбика растворителя

Влияние объема образца на форму линии

Отношение сигнал/шум S/N (Signal/Noise) S/N пропорционально NS S/N пропорционально n NS = число накоплений (number of scans), n = количество вещества

Сколько займет накопление? NS Время Сигнал/шум 256 15 мин. 1 1, 000 1 ч (обеденный перерыв) 2 4, 000 4 ч (половина дня) 4 16, 000 16 ч (ночное накопление) 8 64, 000 64 ч (все выходные) 16

Приготовление образца • • Максимальная концентрация образца – Но без осадка или агрегации – Подбор растворителя – Подбор температуры Использование одного дейтерированного растворителя – Или добавление стандарта ТМС Однородность поля в образце – Осадок, пузырьки воздуха, расслоение образца – Достаточное количество растворителя – Фильтрование образца Отсутствие примесей (в т. ч. парамагнитных) – Удаление растворенного кислорода – Тщательное мытье ампул – Использование резиновых перчаток

Мы обожаем слышать такие фразы: • Вещество - 100% чистое. Всего одно пятно на ТСХ. • Ну, оно растворялось в хлороформе в лаборатории. • Не, ну я понимаю, что за ночь сигнала не появилось вообще. Но может поставить на две ночи? • Не говорите глупостей, конечно тут есть сигнал. • Вы знаете, константа H 1 с H 2 составляет 4. 93 Гц, но вот константа H 2 с H 1 – только 4. 20 Гц. • Ой, а какой это растворитель? • Помните, Вы мне два года назад спектр записывали? • Бог ты мой, как же долго спектр копился. На самом деле, у меня этого вещества – сколько угодно. Что, надо было больше концентрацию сделать?

Дейтерированные растворители В образце – 1% вещества, 99% растворителя Сигналы растворителя закрывают сигналы вещества Выход: использовать дейтерированные растворители CDCl 3, CD 2 Cl 2, C 6 D 6, CD 3 C(O)CD 3, D 2 O и т. д. Характерный вид сигналов в 1 H и 13 C спектрах Использование сигнала растворителя в качестве стандарта 2 D – квадрупольное ядро (S = 1, расщепления на три состояния) H D D 2

Изотопный сдвиг

D 2 O в бензоле-d 6

Взаимодействие с квадрупольными ядрами Растворитель ДМСО-d 6 Примесь NH 4+ Видно только при симметричном окружении квадрупольного ядра

Взаимодействие с квадрупольными ядрами 1 H - спектр BH 4− Изотоп 11 B Изотоп 10 B Спин 3/2 Спин 3 Природное содержание 81. 2% Природное содержание 18. 8%

Магнит

Сверхпроводящий магнит • Соленоид из Nb/Sn (Nb/Ti) проволоки, погруженный в жидкий гелий (4 К) • Сверхпроводимость • Нулевое сопротивление • Ток, без потерь циркулирующий по катушке • Стабильное магнитное поле • Необходимость использования жидких азота и гелия ($)

Стабильность окружения • Вибрация – Собственные колебания здания – Компрессоры, кондиционеры – Рабочие с перфораторами – Трамваи • Изменение температуры – Стабильная температура в помещении – Коррекция температуры в датчике • Длительность накопления

Источник радиочастотного излучения

ЯМР с разверткой поля • Плавное изменение поля • Постоянная частота • Поглощение энергии Проблемы: − Длительная регистрация − Большую часть времени пишем область спектра без сигналов

Импульсная спектроскопия Высота тона зависит от длины и упругости струны Определение аккорда, зажатого на гитаре: • Померить длину и упругость всех струн. • Сыграть аккорд и определить его на слух.

Преобразование Фурье – математическая процедура, которая переводит данные из частотного представления во временное (и наоборот) Зависимость от времени Зависимость от частоты t n

Аккорд до мажор

Импульсная спектроскопия ЯМР Импульс Измерение отклика системы на возмущение FID (ССИ) Преобразование Фурье

Схема обычного одномерного эксперимента

Накопление FID ССИ – free induction decay – спад свободной индукции

Умножение на оконную функцию Полезный сигнал Чувствительность В основном - шум Разрешение F(t) = 1 * e - ( LB * t ) LB – параметр, определяющий уширение линии

Умножение на экспоненту

Релаксация

Повторение • Импульс выводит систему из равновесия • Сразу после импульса в катушке датчика возникает ток • Преобразование Фурье зависимости интенсивности тока в катушке от времени дает спектр ЯМР Вопросы • Что происходит во время импульса? • Почему в катушке возникает ток? • Почему ток затухает? Импульс

Прецессия n 0 g B 0 ларморова частота гиромагнитное отношение (характеристика ядра) индукция магнитного поля

Макроскопическая намагниченность

Фазовая когерентность В равновесии фаза прецессии для всех спинов - разная До импульса: После импульса: • Импульс заставляет все спины прецессировать с одинаковой фазой • Прецессия «в фазе» создает изменяющееся магнитное поле • Магнитное поле индуцирует в катушке приемника электрический ток

Поперечная намагниченность

Влияние дополнительного поля B 1

Вращающаяся система координат Mz Mxy

180 -градусный импульс • 180°-импульс инвертирует начальный заселенности уровней • Фазовая когерентность отсутствует, сигнала нет

90–градусный импульс • 90°-импульс выравнивает заселенности уровней • Появление поперечной намагниченности • Фазовая когерентность приводит к появлению электрического тока в катушке приемника

Релаксация Почему FID затухает? Возвращение к равновесию Восстановление распределения Больцмана

Система после p/2 -импульса • Макроскопическая намагниченность в плоскости x-y • Заселенности уровней равны • Наличие фазовой когерентности • • Возвращение к равновесному состоянию: Макроскопическая намагниченность вдоль оси z Больцмановские заселенностей уровней Отсутствие фазовой когерентности 1. Разрушение поперечной намагниченности 2. Восстановление намагниченности вдоль оси z

Спин-спиновая релаксация • Разрушение фазовой когерентности • Исчезновение поперечной намагниченности • «Разворачивание веера» (“fan out”) Mx = My = M 0 exp(-t/T 2) T 2 – время спин-спиновой релаксации

Влияние T 2 на спектр ЯМР • Уничтожение поперечной намагниченности • Затухание спада свободной индукции T 2 релаксация

Разница между T 2 и T 2*

Спин-решеточная релаксация • Восстановление намагниченности вдоль оси z • Заселенности уровней: распределение Больцмана • Передача избыточной энергии «решетке» (растворителю) Mz = M 0(1 - exp(-t/T 1)) T 1 – время спин-решеточной релаксации T 1 ≥ T 2 T 1 определяет, как часто можно повторять эксперимент

Сокращение T 1 Задержка между 30° импульсами – 1 с Добавленный Cr(acac)3 Без Cr(acac)3

Влияние кислорода на T 1

Зависимость времен релаксации от MW

Широкие сигналы и методика CPMG 90 180 t Полистирол (50, 000) + камфора t = 1. 5 ms

Зависимость T 2 от молекулярного движения tc MW - время корреляции - молекулярная масса

Ядерный эффект Оверхаузера

13 C-спектр фенетола в D 2 O

Ядерный эффект Оверхаузера (NOE) 4 bb H−C W 1(C) D = 8− 4 = 4 8 W 1(H) D = 12− 4 = 8 W 1(H) D = 16− 8 = 8 ab 12 W 1(C) D = 16− 12 = 4 16 aa ba

Ядерный эффект Оверхаузера (NOE) 8 bb H−C W 1(C) D = 12− 8 = 4 12 W 1(H) D=0 ab 8 W 1(C) D = 12− 8 = 4 12 aa ba

Ядерный эффект Оверхаузера (NOE) 8 bb H−C W 1(C) D = 12− 8 = 4 12 W 1(H) W 0 D=0 W 1(H) D=0 ab 8 W 1(C) D = 12− 8 = 4 12 aa ba

Ядерный эффект Оверхаузера (NOE) 0 bb H−C W 1(C) D = 12− 0 = 12 12 W 1(H) W 0 D=0 W 1(H) D=0 ab 8 W 1(C) D = 20− 8 = 12 20 aa ba

Гетероядерный эффект Оверхаузера Развязка + NOE Развязка без NOE Обычный спектр 13 C

Различные виды развязки от протонов • Развязка от протонов (decoupling) • Гетероядерный NOE • Максимальное увеличение соотношения сигнал/шум • Отсутствие развязки от протонов • Гетероядерный NOE • Gated decoupling • Определение мультиплетности • Развязка от протонов (decoupling) • Отсутствие NOE • «Количественный» ЯМР • Inverse gated decoupling decouple

Разные способы регистрации спектров 13 C

Гомоядерный эффект Оверхаузера • Изменение интенсивности сигнала ядра HA при облучении ядра HX, с которым ядро HA взаимодействует по диполь-дипольному механизму • • Позволяет определить пространственно сближенные ядра Пространственная структура молекул в растворе Усиление сигнала в случае гетероядерного NOE 4. 1Å Заметен на расстояниях < 5 Å 2. 9Å

Разностная NOE-спектроскопия

Разностная NOE-спектроскопия Сильный эффект, поэтому H 3 Облучение H 7

Многомерная спектроскопия ЯМР

Принцип двумерной спектроскопии ЯМР

Двумерный спектр ЯМР Диагональные пики Кросс-пики • Наличие кросс-пика свидетельствует о взаимодействии между соответствующими ядрами • Тип взаимодействия определяется типом двумерной последовательности (COSY, TOCSY, NOESY, HMQC и т. д. )

COSY – Correlation Spectroscopy Скалярное 1 H – 1 H взаимодействие A 1 & B 1 связаны с A 2 & B 2 A 6 связан с A 5 A 6 связан с A 6’ Симметричный пик: A 2 & B 2 связаны с A 1 & B 1

TOCSY – Total Correlation Spectroscopy Протон-протонное скалярное взаимодействие по цепочке связей (в пределах спиновой системы) COSY TOCSY

NOESY – Nuclear Overhauser Effect Spectroscopy Диполь-дипольное взаимодействие через пространство Интенсивность кросс-пика зависит от расстояния (1/r 6) между ядрами (≥ 5Ǻ).

1 H – 13 C корреляции HSQC, HMBC и H 2 BC HSQC, HMQC HMBC Через одну связь Через 2 -3(4) связи H 2 BC Только через 2 связи

HMQC и HSQC HMQC - Heteronuclear Multiple Quantum Coherence HSQC - Heteronuclear Single Quantum Coherence Прямое скалярное взаимодействие 1 H и 13 С через одну связь

HMBC - Heteronuclear Multiple Bond Coherence Дальнее скалярное взаимодействие 1 H и 13 С через 2 -4 связи HMBC HMQC

HMBC спектр станолона

Спектры станолона: H 2 BC и HSQC Серые пики – H 2 BC Красные пики – HSQC (CH 2) Синии пики – HSQC (CH или CH 3) 6 -5 5 -4 6 -5 6 6 -7 5 5 -6 8 7 -6 4 4 -5 7 -8 4 -5 7 -6 7

Экзотические методики

DOSY: “ЯМР–хроматография» Разный размер молекул → разная скорость диффузии в растворе Сахароза Ацетон Вода Коэффициент диффузии Большие молекулы Маленькие молекулы

Комплекс или разделенная ионная пара? [(Ph. CH 2)2 C 2 B 9 H 10]-

DOSY: разделение спектра на компоненты [(Ph. CH 2)2 C 2 B 9 H 10]-

Одномерные селективные методики Selective COSY Обычный спектр 1 H

Гомоядерная развязка 1 H – н-бутанол 1 H 1 H “Pure Shift”

Гомоядерная развязка 1 H - станолон 1 H 1 H “Pure Shift”

J-разрешенный спектр сахарозы dd

Подавление воды

STD: Saturation transfer difference

Задачи

C 6 H 14 13 С 1 H

C 6 H 14 13 С 1 H

C 6 H 10 1 H 13 С

C 8 H 10, не взаимодействует с бромной водой 1 H 13 С

C 8 H 10, взаимодействует с бромной водой