Понятие об антигене и антителе Реакции типа антиген+антитело. Часть 1 Занятие 12
Строение, свойства, классификация АНТИГЕНЫ
Антигены • Антигенами называются вещества, несущие признаки генетически чужеродной информации и при введении в организм вызывающие развитие специфических иммунологических реакций.
Открытие К. Ландштейнера (1900 г. ) эритроциты у разных людей отличаются по антигенной специфичности: группы крови 0, А, В, и АВ.
Природные антигены • Белки • Полисахариды • Мукополисахариды • Липополисахариды • Высокомолекулярные препараты нуклеиновых кислот
Основные свойства антигенов • Чужеродность • Специфичность • Антигенность • Иммуногенность
Иммуногенность • Зависит от степени чужеродности, особенностей строения, и от молекулярной массы вещества. Наименьшая молекулярная масса веществ, против которых удается получить антитела составляет около 1000 Дальтон. • Вещества меньшей молекулярной массы являются неполноценными антигенами или гаптенами
Гаптены • Обладают чужеродностью и способны связываться с готовыми антителами, однако не способны при иммунизации индуцировать образование антител. • Гаптены могут приобрести свойства полноценных антигенов, если удается искусственно увеличить их молекулярную массу: например, присоединить гаптен к белку или адсорбировать на коллоидных частицах.
Антигены бактерий. • Структурные, нерастворимые непосредственно связанные с клеткой • Растворимые, секретируемые во внешнюю среду токсины, ферменты агрессии
Структурные антигены бактерий • Антиген клеточной стенки соматический – О антиген (термостабильный) • У Грам положительных тейхоевые кислоты • У Грам отрицательных липополисахарид
Структурные антигены бактерий • Антиген жгутиков – Н антиген • Белок флагеллин – термолабильный • Капсульный антиген – К антиген у большинства бактерий – мукополисахарид, у некоторых белковой природы. Разновидность капсульного антигена – Vi антиген (антиген вирулентности) у возбудителя брюшного тифа
Структурные основы антигенной специфичности • Антитела связываются не со всей поверхностью антигена, а с определенным небольшим участком, который называется антигенной детерминантой или эпитопом. • В белковой молекуле величина антигенной детерминанты соответствует последовательности из 6 8 аминокислот.
Специфичность антигенной детерминанты зависит: • От величины молекул, входящих в ее состав • Их пространственного расположения • Распределения положительных и отрицательных зарядов на поверхности антигенной детерминанты. Эпитопы
Белковые антигены • Антигенные детерминанты состоят, преимущественно, из гидрофильных аминокислот и образуют на поверхности белковой глобулы выступы или петли • На одной молекуле антигена может находиться от нескольких до нескольких сотен антигенных детерминант, имеющих различную специфичность.
Валентность антигена • Количество антигенных детерминант, приходящихся на одну молекулу антигена, называется валентностью • Молекула яичного альбумина имеет 5 антигенных детерминант (валентность равна 5); • молекула дифтерийного токсина – 8 детерминант (валентность=8), • валентность молекулы тиреоглобулина равна 40
Типы антигенной специфичности • Видовая специфичность – обусловлена совокупностью антигенов, одинаковых у всех особей данного вида • Групповая специфичность – обусловливает антигенные различия особей внутри вида; например, по антигенным группам крови.
Типы антигенной специфичности • Типовая специфичность – понятие, имеющее отношение, в основном, к микроорганизмам. Например, пневмококки по специфичности полисахаридных антигенов делятся на типы 1, 2, 3, 4 и т. д.
Типы антигенной специфичности • Гетероспецифичность (перекрестная) – наличие общих антигенов у представителей различных видов • Патологическая специфичность – измененная под воздействием различных факторов специфичность собственных тканевых антигенов (например, в результате ожога, переохлаждения, воздействия излучений)
Суперантигены микробов, взаимодействующие с МНС II класса антигенпрезентирующих клеток (АПК) и Т клеточным рецептором (Tc. R) Т лимфоцитов, вне антигенсвязывающей щели, т. е. не в активных центрах. Суперантигены присоединяются как бы сбоку молекул МНС II и Tc. R. Они блокируют возможный специфичный иммунный ответ и вызывают поликлональную активацию, выброс цитокинов и, затем, гибель Т лимфоцитов с явлениями иммунодефицита.
Строение, свойства, классификация АНТИТЕЛА
Антитела • Молекулы гликопротеинов, способные к специфическому связыванию с антигенными детерминантами (эпитопами) антигенов • Антитела относятся к классу гамма глобулинов • Другое название антител – иммуноглобулины
Расшифровка строения антител (Портер и Эдельман 1958 г. ) У млекопитающих существует 5 классов иммуноглобулинов, различающихся по своему строению и некоторым свойствам: • Ig G • Ig M • Ig A • Ig E • Ig D
Строение иммуноглобулинов Наиболее типичное строение имеют Ig. G Молекула состоит из 4 белковых цепей: двух легких (L) и двух тяжелых (H), которые соединены между собой дисульфидными связями.
Схема строения Ig. G N-конец C-конец Легкая цепь (L) Углеводный компонент C-конец Тяжелая цепь (H)
Fab- и Fc- фрагменты Активные центры Fabфрагменты L ПАПАИН Fc- фрагмент H
H и L цепи Меркаптоэтанол L L H H
Константные и вариабельные участки легких и тяжелых цепей VH 1 CH 1 VL VL VH VH CH 2 CH 3 Вариабельная область (активный центр) Константная область
Строение активного центра антитела Активный центр антитела образуется вариабельными доменами легкой и тяжелой цепей и представляет собой полость (паратоп), имеющую определенную конфигурацию и распределение электрических зарядов на своей поверхности
Активный центр антитела Центр связывания с антигенной детерминантой называется активным центром антитела Антиген H L Конфигурация активного центра зависит от аминокислотных последовательностей вариабельных доменов как легкой, так и тяжелой цепей, поэтому замена даже одной аминокислоты в этой области может привести к изменению специфичности активного центра Размер, форма активного центра и распределение зарядов на его поверхности определяет специфичность, т. е. способность связываться с определенной антигенной детерминантой (эпитопом), имеющей комплементарную структуру
Связывание антигена • Для связывания эпитопа антигена с активным центром антитела требуется взаимное притяжение атомных групп на участках молекул антигена и антитела, контактирующих друг с другом • При этом образуются нековалентные связи (водородные, электростатические, гидрофобные)
Прочность связи активного центра антител с антигенной детерминантой аффинность Аффинность – это мера сродства активного центра и антигенной детерминанты
Доля Ig. G 75% от общего количества сывороточных имуноглобулинов • 4 подкласса молекул Ig. G: Ig. G 1, Ig. G 2, Ig. G 3, Ig. G 4 • Отличаются друг от друга по аминокислотным последовательностям тяжелых цепей в шарнирной области, количеству дисульфидных связей • Ig. G 1 содержатся в сыворотке крови в наибольшей концентрации, Ig. G 4 – в наименьшей
Свойства Ig. G • Способность проходить через плаценту – во внутриутробном периоде и в течение 6 месяцев после рождения в крови ребенка циркулируют материнские антитела класса Ig. G (естественный пассивный иммунитет)
Свойства Ig. G • На тяжелых цепях Ig. G имеется рецептор для связывания с фракцией комплемента С 1 • После образования комплекса АГ+АТ происходит активация комплемента и образуется большой иммунный комплекс АГ+АТ+К
Схема активации комплемента Антиген С 1 АГ+АТ+К = большой иммунный комплекс
Строение Ig. M • К классу Ig. M относится около 10% общего пула иммуноглобулинов • Молекула Ig. M представляет собой пентамер, т. е. состоит из 5 одинаковых молекул, сходных по своему строению с молекулой Ig. G • Ig. M имеет 10 активных центров.
Строение Ig. M J - цепь • Не проходят через плацентарный барьер • В комплексе с антигеном связывают комплемент • Связь с антигенной детерминантой менее прочная, чем у Ig. G
Антитела класса Ig. А • Составляют 15 20% от общего содержания иммуноглобулинов • Молекула Ig. А состоит из 2 х легких и 2 х тяжелых цепей, имеет 2 активных центра • В сыворотке крови Ig. А присутствуют в мономерной форме • В секретах слизистых оболочек Ig. А представлены в виде димеров и называются секреторными или s. Ig. А, имеют 4 активных центра
Строение антител класса Ig. А Секреторный компонент Сывороточный Ig. A J-цепь • Не проникают через плацентарный барьер • Не фиксируют комплемент • Высокая концентрация s. Ig. А обнаруживается в женском грудном молоке, особенно в первые дни лактации. Они защищают желудочно кишечный тракт новорожденного от инфекции Секреторный Ig. A (s. Ig. A)
Строение Ig. D • Имеют строение, подобное Ig. G: два активных центра • Ig. D в основном находятся на мембране В лимфоцитов – выполняют функцию специфических рецепторов
Строение и свойства Ig. Е • По своему строению Ig. Е сходен с Ig. G, имеет 2 активных центра • Молекулы Ig. Е в основном фиксированы на поверхности тучных клеток и базофилов. • Концентрация свободного Ig. Е в сыворотке крови чрезвычайно низкая
Строение и свойства Ig. Е • Ig. Е имеет существенное значение в развитии антигельминтозного иммунитета • Ig. Е играет главную роль в патогенезе некоторых аллергических заболеваний (бронхиальная астма, сенная лихорадка) и анафилактического шока
Изотипы (разновидности) легких и тяжелых цепей иммуноглобулинов • Легкие цепи – 2 изотипа: и • Тяжелые цепи обозначаются буквами греческого алфавита – γ, μ, α, δ, ε (соответственно для Ig. G, Ig. M, Ig. A, Ig. D, Ig. E) • В молекуле антитела могут объединяться пары легких и тяжелых цепей любого типа, но обе цепи в паре всегда относятся к одному изотипу
Эффекторные функции антител Кроме специфического связывания антигена антитела выполняют и другие – эффекторные функции: • связывание с клеточной мембраной • активация комплемента
Связывание Ig с мембраной • На мембране клеток, участвующих в иммунном ответе присутствуют рецепторы, способные связывать С концевые участки антител различных классов • Молекулы Ig. G и Ig. А способны фиксироваться на моноцитах, макрофагах и нейтрофилах
Связывание Ig с мембраной • Иммуноглобулины класса Ig. E связываются с рецепторами мембран тучных клеток и базофилов • Реакция АГ с антителом, фиксированным на поверхности клеток называется клеточно опосредованной
Активация комплемента • На тяжелых цепях молекул Ig. G и Ig. М имеются рецепторы для фракции С 1 комплемента. Они становятся доступными только после взаимодействия антитела с антигеном. • Активация комплемента идет по классическому пути (С 1 С 4 С 2 С 3 С 5 С 9),
Иммунные комплексы • Комплекс АГ+АТ= малый иммунный комплекс=циркулирующий иммунный комплекс (ЦИК) • Комплекс АГ+АТ+К=большой иммунный комплекс (БИК) • Большие иммунные комплексы, в отличие от малых, распознаются и поглощаются макрофагами. Таким образом происходит удаление антигенов из кровеносного русла
Реакции агглютинации, преципитации МЕХАНИЗМ РЕАКЦИЙ АГ+АТ
В основе иммунологических реакций лежит взаимодействие АГ и АТ, которое визуально не проявляется. Для выявления взаимодействия используют различные иммунологические реакции
Диагностикумы – это взвесь убитых нагреванием или формалином определенных микробных клеток с известным содержанием клеток в единице объема. В качестве антигена могут быть использованы также взвеси живых бактерий. Для серологических реакций могут быть использованы целые клетки (корпускулярные антигены), например, лимфоциты, плазмоциты, клетки, пораженные вирусами, опухолевые клетки и т. д. (РИФ, РИА, ИФА); бактериальные клетки (РА, РИФ, РИА, ИФА); а также растворимые компоненты (растворимые, молекулярные АГ) для реакции преципитации, нейтрализации, ИФА и других. Принципы получения корпускулярного антигена: Корпускулярный АГ – это живые или убитые (инактивированные) клетки в изотонических или буферных растворах. При инактивации клеток пользуются методами, не вызывающими изменения специфичности и снижения иммуногенных свойств.
АГ для серологических реакций Микроорганизмы инактивируют: 1) высокой температурой, подвергая медленному нагреванию во избежание денатурации белков; 2) химическими веществами (формалином, спиртом и другими); 3) ультразвуком, ультрафиолетом и рентгеновскими лучами. Облучением, в частности, инактивируют опухолевые клетки. Стандартные антигены из инактивированных патогенных микроорганизмов широко применяются в серологическом анализе при обнаружении антител в сыворотках людей и животных. С помощью серологических реакций выявляют у исследуемых бактериальных клеток антигенный состав. Взвеси эритроцитов, лимфоцитов, опухолевых клеток в серологических реакциях используют для определения локализованных на их поверхностных мембранах АГ групп крови, СД маркеров, трансплантационных, опухолеспецифических и других АГ, а также для обнаружения в сыворотках АТ к этим антигенам.
Принципы получения иммунных сывороток Иммунная сыворотка (антисыворотка) представляет собой сыворотку крови, содержащую антитела к данному антигену. В большинстве случаев иммунные (диагностические) сыворотки к микробным, тканевым и другим антигенам получают экспериментальным путем, иммунизируя животных соответствующими антигенами. В числе основных требований, предъявляемых к антисывороткам, их высокая специфичность и достаточное содержание антител. По специфичности различают поливалентные (полиспецифические) и моновалентные (моноспецифические) антисыворотки. Поливалентные сыворотки содержат антитела ко многим антигенам, моноспецифические к одному конкретному антигену.
Принципы получения иммунных сывороток Получить моноспецифические сыворотки можно: 1) используя для иммунизации животных высокоочищенные антигены, 2) очищая нативные сыворотки от антител нежелательной специфичности. Для этого используют: 1) иммуноаффинный метод, в основе которого лежит связывание антител определенной специфичности соответствующими антигенами, иммобилизованными на твердофазном носителе, с последующим разделением образовавшихся комплексов АГ АТ и выделением антител; 2) метод адсорбции по Кастеллани. Для этой цели к нативной иммунной сыворотке, содержащей группоспецифические перекрестно реагирующие антитела, последовательно добавляют микроорганизмы, в состав которых входят все групповые антигены, адсорбируя таким образом гомологичные антитела. Такие адсорбированные моноспецифические антисыворотки содержат антитела к различным детерминантам молекулы антигена, которые гетерогенны по классовой (подклассовой) принадлежности и авидности, поскольку синтезируются разными клонами лимфоцитов, вовлеченными в иммунный ответ
Принципы получения иммунных сывороток Идентичными по всем характеристикам являются антитела к одной антигенной детерминантной группе, продуцируемые клеточным клоном, происходящим из одного лимфоцита, т. е. моноклональные антитела. Для иммунизации животных готовят корпускулярные или растворимые антигены различной степени очистки в зависимости от задач исследования. Получение сыворотки, отвечающей предъявляемым требованиям, во многом зависит от кратности, сроков и способов введения антигенов. Способы введения антигенов животным могут быть различными (внутривенные, подкожные, внутрикожные и другие). Хорошо комбинировать внутривенное и локальное введение антигенов. Количество антител в полученной сыворотке устанавливают титрованием ее в соответствующей серологической реакции с гомологичным антиген
Титром сыворотки называется то ее максимальное разведение, в котором обнаруживается агглютинация антигена. Чем выше титр антител, тем достовернее результаты реакции. Чтобы дифференцировать причину положительной реакции (ранее перенесенная инфекция, вакцинация или текущее заболевание), оценивают динамику нарастания титра антител, которое наблюдается только при текущей инфекции. При наличии у разных бактерий одинаковых или сходных групповых антигенов они могут агглютинироваться одной и той же антисывороткой, что затрудняет их идентификацию. В таких случаях применяют реакцию адсорбции агглютининов по Кастеллани. Данная реакция основана на способности родственных групп бактерий адсорбировать из антисыворотки только группо вые антитела при сохранении в ней типоспецифических анти тел. Полученные сыворотки называются монорецепторным и, так как содержат антителя только к одному определенному антигену. Они применяются для детального изучения антигенной структуры бактерий с целью определения их серовара
Реакция агглютинации ориентировочная на стекле О Аг. Соматические О Аг термостабильны и выдерживают кипячение в течение 2 ч. При взаимодействии с AT образуют мелкозернистые агрегаты. Н Аг (жгутиковые) термолабильны и быстро разрушаются при 100 °С, а также под действием этанола. В реакциях с Н антисывороткой через 2 ч инкубации образуют рыхлые крупные хлопья (образованы бактериями, склеившимися жгутиками). Vi Ar брюшнотифозных бактерий относительно термостабилен (выдерживает температуру 60 62 °С в течение 2 ч); при инкубации с Vi антисывороткой образуется мелкозернистый агглютинат.
РА Реакция агглютинации — простая по постановке реакция, при которой происходит связыва ние антителами корпускулярных антигенов (бактерий, эритроцитов или других клеток, нерастворимых частиц с адсорбированными на них антигенами, а также макромолекулярных агрегатов). Она протекает при наличии электролитов, например при добавлении изо тонического раствора натрия хлорида. Применяются различные варианты реакции агглютинации: развернутая, ориентировоч ная, непрямая и др. Реакция агглютинации проявляется образованием хлопьев или осад ка (клетки, «склеенные» антителами, име ющими два или более антигенсвязывающих центра — рис. 13. 1). РА используют для: 1) определения антител в сыворотке крови боль ных, например, при бруцеллезе (реакции Райта, Хеддельсона), брюшном тифе и паратифах (реак ция Видаля) и других инфекционных болезнях; 2) определения возбудителя, выделенного от больного; 3) определения групп крови с использова нием моноклональных антител против алло антигенов эритроцитов.
РА Для определения у больного антител ставят развернутую реакцию агглютинации: к разве дениям сыворотки крови больного добавля ют диагностикум (взвесь убитых микробов, ) и через несколько часов инкубации при 37 ˚С отмечают наибольшее разведение сыворотки (титр сыворотки), при котором произошла агглютинация, т. е. образовался осадок. Характер и скорость агглютинации зави сят от вида антигена и антител. Примером являются особенности взаимодействия диагностикумов (О и H антигенов) со специ фическими антителами. Реакция агглютина ции с О диагностикумом (бактерии, убитые нагреванием, сохранившие термостабильный О антиген) происходит в виде мелкозернис той агглютинации. Реакция агглютинации с Н диагностикумом (бактерии, убитые фор малином, сохранившие термолабильный жгу тиковый Н антиген) — крупнохлопчатая и протекает быстрее. Если необходимо определить возбудитель, выделенный от больного, ставят ориентиро вочную реакцию агглютинации, применяя диа гностические антитела (агглютинирующую сыворотку), т. е. проводят серотипирование возбудителя. Ориентировочную реакцию проводят на предметном стекле. К капле диа гностической агглютинирующей сыворотки в разведении 1: 10 или 1: 20 добавляют чистую культуру возбудителя, выделенного от больно го. Рядом ставят контроль: вместо сыворотки наносят каплю раствора натрия хлорида. При появлении в капле с сывороткой и микроба ми хлопьевидного осадка ставят развернутую реакцию агглютинации в пробирках с увели чивающимися разведениями агглютинирую щей сыворотки, к которым добавляют по 2— 3 капли взвеси возбудителя. Агглютинацию учитывают по количеству осадка и степени просветления жидкости. Реакцию считают положительной, если агглютинация отмеча ется в разведении, близком к титру диагнос тической сыворотки. Одновременно учитыва ют контроли: сыворотка, разведенная изото ническим раствором натрия хлорида, должна быть прозрачной, взвесь микробов в том же растворе — равномерно мутной
Ориентировочная реакция агглютинации на стекле. К капле агглютинирующей сыворотки (разведение 1 : 20) добавляют взвесь бактерии, выделенных от больного животного. Образуется хлопьевидный осадок Развернутая реакция агглютинации с возбудителем, выделенным от больного животного. К разведениям агглютинирующей сыворотки добавляют взвесь бактерий, выделенных от больного Развернутая реакция агглютинации с сывороткой крови. К разведениям сыворотки добавляют диагностикум. Агглютинация с О диагностикумом (бактерии, убитые нагреванием, сохранившие O антиген) происходит в виде мелкозернистой агглютинации. Агглютинация с Н диагностикумом (бактерии, убитые формалином, сохранившие жгутиковый Н антиген) крупнохлопчатая и протекает быстрее.
Реакция преципитации РП (от лат praecipilo осаждать) это формирование и осаждение комплекса растворимого молекулярного антигена с антителами в виде помутнения, называемого преципитатом. Он образуется при смешивании антигенов и антител в эквивалентных количествах, избыток одного из них снижает уровень образования иммунного комплекса. Реакцию преципитации ставят в пробирках (реакция кольцепреципитации), в гелях, питательных средах и др. Широкое распространение получили разновидности реакции преципитации в полужидком геле агара или агарозы двойная иммунодиффузия по Оухтерлони, радиапьная иммунодиффузия, иммуноэпектрофорез и др.
Реакция кольцепреципитации. Реакцию проводят в узких преципитационных пробирках: на иммунную сыворотку наслаивают растворимый антиген. При оптимальном соотношении антигена и антител на границе этих двух растворов образуется непрозрачное кольцо преципитата. Если в качестве антигенов в реакции используют прокипяченные и профильтрованные экстракты тканей, то такая реакция называется I реакцией термопреципитации (реакция, при которой выявляют сибиреязвенный гаптен).
Обязательным условием постановки реакции преципитации (РП) в жидкой среде является максимальная прозрачность иммунореагентов. Реакция происходит при смешивании растворов АГ и АТ или наслоения одного иммунореагента на другой. В этом случае по характеру образовавшего преципитата (в виде кольца) реакция получила название кольцепреципитации. Реакцию проводят в узких преципитационных пробирках: на иммунную сыворотку наслаивают растворимый антиген. При оптимальном соотношении антигена и антител на границе этих двух растворов образуется непрозрачное кольцо преципитата.
Реакция радиальной иммунодиффузии. Иммунную сыворотку с расплавленным агаровым гелем равномерно наливают на стекло. После застывания в геле делают лунки, в которые помещают антиген в различных разведениях. Антиген, диффундируя в гель, образует с антителами кольцевые зоны преципитации вокруг лунок. Диаметр кольца преципитации пропорционален концентрации антигена. Реакцию используют для определения в сыворотке крови иммуноглобулинов различных классов, компонентов системы комплемента и др.
Реакция двойной иммунодиффузии по Оухтерлони. Для постановки реакции растопленный агаровый гель тонким слоем выливают на стеклянную пластинку и после затвердевания в нем вырезают лунки. В лунки геля раздельно помещают антигены и иммунные сыворотки, которые диффундируют навстречу другу. В месте встречи в эквивалентных соотношениях они образуют преципитат в виде белой полосы. У многокомпонентных систем между лунками с антигенами и антителами появляется несколько линий преципитата; у идентичных АГ линии преципитата сливаются; у неидентичных АГ пересекаются.
Иммуноэлектрофорез сочетание метода электрофореза и иммунопреципитации: смесь антигенов вносится в лунки геля и разделяется в геле с помощью электрофореза, затем в канавку параллельно зонам электрофореза вносят иммуннук сыворотку, антитела которой диффундируют в гель и образуют в месте "встречи" с антигеном линии преципитации.
Реакция флоккуляции (по Рамону) (от лат. f 1 оecus хлопья шерсти) появление опалесценции или хлопьевидной массы (иммунопреципитации) в пробирке при реакции токсин антитоксин или анатоксин антитоксин. Ее применяют для определения активности антитоксической сыворотки или анатоксина.
Скачать презентацию Понятие об антигене и антителе Реакции типа антиген+антитело.
Тема 12.ppt