ПОДБОР СРЕД с применением математических методов планирования эксперимента

Основные проблемы при подборе ферментационных сред • Рецептура сред обычно включает несколько компонентов • Чаще всего при подборе ферментационных сред используются натуральные компоненты • Важно, в каком соотношении в среде находятся различные компоненты • Обычно оптимальное соотношение подбирают с помощью экспериментов

ТРАДИЦИОННЫЕ МЕТОДЫ • По очереди изучают каждый фактор по отдельности на фоне исходной среды, а потом составляют среду на основе найденных частных оптимумов • В этом случае не учитывается взаимодействие факторов, и найденное соотношение может оказаться неоптимальным • Метод тотального перебора всех возможных сочетаний требует больших затрат времени и средств

ИДЕЯ МЕТОДА БОКСАУИЛСОНА • Вблизи исходной точки ( «фона» ) ставится специальным образом спланированная серия опытов, в которой одновременно варьируются ВСЕ изучаемые факторы, каждый на 2 уровнях (верхнем и нижнем) • Результаты этих опытов математически обрабатывают для получения линейного уравнения, по которому рассчитывают следующую серию – «крутое восхождение»

ИЗОБРАЖЕНИЕ поверхности отклика S 2 A 0 A S 1

Схема процедур метода Бокса-Уилсона

Линейное уравнение регрессии • Исследовательская серия опытов ставится для того, чтобы получить линейное уравнение, связывающее выходной параметр оптимизации P с концентрацией различных субстратов в среде S, от которых он зависит: • P = b 0 + b 1 S 1 + b. S 2 +b 3 S 3 + …. + bn. Sn , • где S 1 , S 2 , S 3 …Sn – концентрации субстратов, а b 0 , b 1 , b 2 , b 3 …bn – соответствующие коэффициенты регрессии

Матрицы планирования • В методе Бокса-Уилсона для исследовательских серий опытов используются ОРТОГОНАЛЬНЫЕ матрицы планирования • Эти матрицы позволяют минимизировать число опытов для получения линейного уравнения и упростить вычислительные процедуры

Свойства матриц • В каждой серии количество вариантов опытов с верхним уровнем каждого фактора равно количеству вариантов с нижним уровнем того же фактора • Верхний уровень любого фактора сочетается одинаковое число раз и с верхними, и с нижними уровнями всех остальных факторов

План для 2 факторов на 2 уровнях №№ опыта 1 S 2 - - 2 + - 3 - + 4 + +

План для 6 и менее факторов №№ 1 2 3 4 5 6 7 8 S 1 + + S 2 + + S 3 + + S 4 + + S 5 + + - S 6 + + -

Пример плана экспериментов для 4 факторов № S 1 S 2 S 3 S 4 Р 1 P 2 Pср Pj - Pср (Pj – Pср)2 1 - (5, 3) - (0, 5) - (0, 6) - (1, 7) 5600 5800 5700 10000 2 + (6, 7) - (0, 5) - (0, 6) + (2, 3) 7200 7000 7100 10000 3 - (5, 3) + (0, 7) - (0, 6) + (2, 3) 6750 6450 6600 150 22500 4 + (6, 7) + (0, 7) - (0, 6) - (1, 7) 6030 6210 6120 90 8100 5 - (5, 3) + (0, 9) + (2, 3) 6930 7030 6980 50 2500 6 + (6, 7) - (0, 5) + (0, 9) - (1, 7) 6740 6400 6570 170 28900 7 - (5, 3) + (0, 7) + (0, 9) - (1, 7) 6080 5940 6010 70 4900 8 + (6, 7) + (0, 9) + (2, 3) 8000 7600 7800 200 40000 - (0, 5)

ОБОЗНАЧЕНИЯ • S 1, S 2 , S 3 , S 4 - концентрации субстратов 1, 2, 3, 4 в среде • P 1 , P 2 , Pср - концентрации продукта, полученные в u-м варианте среды для 1 -й, 2 -й повторности и средняя концентрация для этого варианта • «-» – нижний уровень фактора • «+» – верхний уровень фактора

РАСЧЁТ b 0

Расчёт коэффициентов регрессии bi

Дисперсия воспроизводимости

Доверительный интервал =

ОБОЗНАЧЕНИЯ • u – номер варианта среды в матрице планирования эксперимента • N – общее число вариантов в матрице • j – номер повторности варианта среды • Ϫ – общее число повторностей каждого варианта • Pju – концентрация продукта в j-й повторности u-го варианта среды

ОБОЗНАЧЕНИЯ • Pu – среднее значение концентрации продукта в u-м варианте среды • Siu – кодированное ( «+» или «-» ) значение концентрации i-го субстрата в u-ом варианте среды •

Критерий Стьюдента Число степеней свободы f Критерий Стьюдента t 1 12, 71 2 4, 30 3 3, 18 4 2, 78 5 2, 57 6 2, 45 7 2, 37 8 2, 31 10 2, 23 12 2, 18 16 2, 12 20 2, 09 30 2, 04 60 2, 00 1, 98 t

Значимость коэффициентов • Значимыми являются коэффициенты, величина которых по модулю превышает доверительный интервал • Если коэффициент оказался незначимым, данный фактор не изменяют, а сохраняют на прежнем уровне (основном уровне)

ОПРЕДЕЛЕНИЕ «ЗАПАСА» ПО КАЖДОМУ ФАКТОРУ • При крутом восхождении рассчитывается серия опытов, в которых факторы увеличиваются или уменьшаются в зависимости от знака коэффициента регрессии • Это увеличение или уменьшение не может быть бесконечным, а ограничено максимальным или минимальным уровнем каждого фактора (они заданы)

ФОРМУЛЫ ДЛЯ «ЗАПАСА» • Для факторов с положительным коэффициентом регрессии • Δi =Si max – S 0 i • Для факторов с отрицательным коэффициентом регрессии • Δi = S 0 i – Si min

«КРИТИЧНОСТЬ» • Физически параметр «критичность» отражает соотношение «запаса» с величиной «шага» по данному фактору (с учётом его влияния на результат, выраженного в величине коэффициента регрессии) • Чем ниже значение по модулю показателя «критичность» , тем меньшее (по сравнению с другими) число шагов уместится в «запасе» для этого фактора. То есть, фактор с минимальной по модулю величиной «критичности» является определяющим, критичным для всей программы крутого восхождения • Формула для вычисления |Δi / biλi| (модуль!)

ВЫБОР ШАГА КРУТОГО ВОСХОЖДЕНИЯ • Обычно крутое восхождение проводится путём равномерного пошагового приращения в каждом последующем опыте величин уровней факторов (концентраций) • При этом для одного из факторов – наиболее критичного (базового фактора) – величина приращения (шага) выбирается, а для всех остальных – рассчитывается пропорционально произведениям bi λi

РАСЧЁТ ШАГА БАЗОВОГО ФАКТОРА • Обычно в направлении крутого восхождения проводят 5 – 8 шагов (экспериментов), не более. Эта цифра ( m ) задаётся произвольно • Величина шага базового фактора : ΔSБ =( ΔБ ) / m , где ΔБ - «запас» по базовому фактору • Полученную цифру обычно округляют

РАСЧЁТ ШАГОВ ОСТАЛЬНЫХ ФАКТОРОВ • ΔSi= ΔSБ*(biλi) / (b. БλБ) • Здесь ΔSi - шаг i-го фактора • bi –коэффициент регрессии i-го фактора • b. Б – то же для базового фактора • λi и λБ – интервалы варьирования соответственно для i-го и базового факторов

НАПРАВЛЕНИЕ ДВИЖЕНИЯ • Для факторов с положительным коэффициентом регрессии в каждом последующем опыте шаг прибавляется к предыдущему значению и наоборот – для отрицательных – вычитается • Для незначимых факторов значение уровня фактора не изменяется для всех опытов крутого восхождения

ЦЕЛЬ ОПТИМИЗАЦИИ • Если параметр оптимизации должен быть увеличен в процессе крутого восхождения, для факторов с положительными коэффициентами регрессии шаги прибавляются • Если задано снижение величины параметра (например, время процесса и т. п. ), порядок изменения фактора в процессе крутого восхождения обратный

ИСХОДНЫЕ ДАННЫЕ S 1, S 3, S 4, крахмал, % (Si)0 (Si)max (Si)min λi bi S 2, (NH 4)2 SO 4 , % кукурузный экстракт, % соевая мука, % 6, 0 10, 0 0 0, 7 +283 0, 6 2, 0 0 0, 1 +30 0, 75 2, 0 0 0, 15 +222 2, 0 5, 0 0 0, 3 +515

МАТРИЦА ПЛАНИРОВАНИЯ № S 1 S 2 S 3 S 4 Р 1 P 2 Pср Pj - Pср (Pj – Pср)2 1 - (5, 3) - (0, 5) - (0, 6) - (1, 7) 5600 5800 5700 10000 2 + (6, 7) - (0, 5) - (0, 6) + (2, 3) 7200 7000 7100 10000 3 - (5, 3) + (0, 7) - (0, 6) + (2, 3) 6750 6450 6600 150 22500 4 + (6, 7) + (0, 7) - (0, 6) - (1, 7) 6030 6210 6120 90 8100 5 - (5, 3) + (0, 9) + (2, 3) 6930 7030 6980 50 2500 6 + (6, 7) - (0, 5) + (0, 9) - (1, 7) 6740 6400 6570 170 28900 7 - (5, 3) + (0, 7) + (0, 9) - (1, 7) 6080 5940 6010 70 4900 8 + (6, 7) + (0, 9) + (2, 3) 8000 7600 7800 200 40000 - (0, 5)

Расчёт доверительного интервала коэффициентов N = 8; Υ = 2 ΣΣ = 2 (10000+ 10000 +22500 +8100 + + 2500 + 28900 + 40000) = 253800 σ2 = ΣΣ / ((Υ – 1)·N) = 253800 / 8 = 31725 Критерий Стьюдента t зависит от f (числа степеней свободы). f = (Υ – 1)·N = 8; отсюда t = 2, 31 Доверительный интервал ε = t·(σ2/NΥ)0, 5 =145

ЗНАЧИМОСТЬ ФАКТОРОВ • • • S 1 (b 1 = + 283) – значим ( 283 > 145 ) S 2 (b 2 = + 30) – незначим ( 30 < 145 ) S 3 (b 3 = + 222) – значим ( 222 > 145 ) S 4 (b 4 = + 515) – значим ( 515 > 145 ) В данном примере со знаком «+» все коэффициенты. Но даже если они со знаком «-» , но по модулю больше доверительного интервала ε, то этот фактор значим

Вспомогательные параметры Δi 4, 0 1, 4 1, 28 3, 0 (Δi) / 0, 02 0, 47 0, 038 0, 019 (biλi) Модуль (biλi) +198 +3 +33 +155 ΔSi +0, 64 -- +0, 11 +0, 5

Расчёт шагов по каждому субстрату • Принимаем m = 6 • Базовый фактор S 4 (наименьшая критичность). Для него «запас» Δ 4 = 3, 0 • ΔS 4 = + 0, 5 • ΔS 1 = 0, 5 · (198 / 155) = + 0, 64 • ΔS 3 = 0, 5 · (33 / 155) = + 0, 11 • ΔS 2 = 0 (незначимый фактор)

Пояснения • Физически программа крутого восхождения – это перечень выбранного числа ферментационных сред в направлении увеличения выхода (параметра оптимизации) • Формирование происходит по принципу изменения концентраций каждого компонента среды Si , начиная от основного уровня, на величину шага для данного компонента с учётом знака (который совпадает со знаком коэффициента регрессии). Для факторов со знаком «+» в каждом следующем опыте Si увеличивается на величину шага, со знаком «-» – уменьшается • Для незначимых факторов величина шага равна 0, но это не значит, что и концентрации во всех опытах нулевые. Они должны соответствовать концентрациям основного уровня

ПРОГРАММА крутого восхождения № № S 1 S 2 S 3 S 4 Pрасч. Pэксп. 9 6, 6 0, 86 2, 5 7879 7140 10 7, 3 0, 6 0, 97 3, 0 9155 7630 11 7, 9 0, 6 1, 08 3, 5 10430 8350 12 8, 6 0, 6 1, 19 4, 0 11706 8510 13 9, 2 0, 6 1, 30 4, 5 12982 7220 14 9, 9 0, 6 1, 41 5, 0 14258 7110

КОММЕНТАРИИ • Программа крутого восхождения включает 6 вариантов сред, каждая из которых включает 4 компонента (субстрата) • В графе Ррасч представлены значения выхода Р, рассчитанные для каждого варианта среды. Как и следовало ожидать, в каждом следующем опыте происходит увеличение выхода Р • В графе Рэксп представлены данные выхода Р, полученные в реальном эксперименте

КОММЕНТАРИИ-2 • Как видно из данных эксперимента, увеличение выхода в каждом следующем варианте сред программы крутого восхождения не настолько велико, как это следует из расчёта • Больше того, в вариантах №№ 12 и 13 происходит не увеличение, а уменьшение выхода по сравнению с предыдущим вариантом • Это вполне понятно, поскольку уравнение регрессии ПРИБЛИЖЁННО описывает поверхность отклика, характеризуя лишь ситуацию в непосредственной близости к центру планирования – основному уровню • Но всё же возрастание выхода происходит, и полученный в опыте № 11 результат превышает лучший достигнутый ранее результат на 20%. А затрачено всего 13 опытов!

Перспективы методов планирования эксперимента • Метод Бокса-Уилсона хорошо себя зарекомендовал и часто используется при подборе ферментационных сред • Есть и другие методы планирования эксперимента, тоже эффективные • Уровень специалиста определяется тем, какие методы он использует в своей работе. Можно ведь и площадь треугольника определять, считая квадратики на миллиметровой бумаге

Рекомендация Эйнштейна • «Всё должно быть сделано настолько просто, насколько это возможно, но не проще!»