План 1 Наследственные болезни и их классификация 2

План: 1. Наследственные болезни и их классификация. 2. Человек как специфический объект генетического анализа. 3. Основные методы исследования генетики человека.

Фенилаланин Меланин Тирозин Альбинизм ФПВК Фенилкетонурия Схема нормального обмена и его нарушений аминокислоты фенилаланина

Особенности человека как объекта генетического анализа, обусловленные биологической сущностью: 1. Сложный кариотип – много хромосом и генов (30 тыс. ) 2. Позднее половое созревание (13 -15 лет) 3. Редкая смена поколений (25 лет); 4. Низкая плодовитость из-за небольшого числа потомков (в семье 1 -2 -3 ребенка); 5. Большой генотипический и фенотипический полиморфизм

Особенности человека как объекта генетического анализа, обусловленные социальной сущностью: 1. Невозможность планирования искусственных браков и экспериментирования; 2. Невозможность создания абсолютно одинаковых условий жизни для всех потомков; 3. Необходимость считаться с особенностями культуры, традициями и обычаями народов.

Основные методы исследования генетики человека: 1. Генеалогический 2. Близнецовый 3. Биохимический 4. Дерматоглифический 5. Цитогенетический 6. Популяционно-статистический 7. Молекулярно-генетический (метод анализа ДНК) 8. Генетики соматических клеток 9. Биологического моделирования 10. Математического моделирования (биоинформатика)

Генеалогический метод позволяет установить: 1) является ли данный признак наследственным; 2) тип и характер наследования; 3) генотип лиц родословной; 4) пенетрантность гена; 5) вероятность рождения ребенка с данной наследственной патологией

Этапы клинико-генеалогического метода: 1. Сбор данных о всех родственниках обследуемого (анамнез); 2. Построение родословной; 3. Анализ родословной: 3. 1. Определение, наследуемый ли данный признак; 3. 2. Определение типа наследования; 3. 3. Определение генотипов членов родословной; 3. 4. Определение вероятности проявления признаков у потомков. 4. Выводы.

Символы, используемые при составлении родословной

Типы наследования: 1. Аутосомно-доминантный; 2. Аутосомно-рецессивный; 3. Сцепленный с Х-хромосомой рецессивный; 4. Сцепленный с Х-хромосомой доминантный; 5. Сцепленный с Y-хромосомой (голандрический)

Аутосомно-доминантный тип наследования 1. Больные в каждом поколении; 2. Больной ребенок у больных родителей; 3. Болеют в равной степени мужчины и женщины; 4. Наследование идет по вертикали и по горизонтали; 5. Вероятность наследования 100%, 75% и 50%. (Полидактилия, веснушки, курчавые волосы, карие глаза. . )

Аутосомно-рецессивный тип наследования: 1. Больные не в каждом поколении; 2. У здоровых родителей больной ребенок; 3. Болеют в равной степени мужчины и женщины; 4. Наследование идет преимущественно по горизонтали; 5. Вероятность наследования 25%, 50% и 100%. (Фенилкетонурия, муковисцидоз, серповидно-клеточная анемия…)

Фенилкетонурия. Альбинизм кожноглазного типа

Сцепленный с Х-хромосомой рецессивный тип наследования: 1. Больные не в каждом поколении; 2. У здоровых родителей больной ребенок; 3. Болеют преимущественно мужчины; 4. Наследование идет в основном по горизонтали; 5. Вероятность наследования 25% от всех детей и 50% у мальчиков. (гемофилия, мышечная дистрофия, дальтонизм …)

Сцепленный с Х-половой хромосомой доминантный тип наследования Сходен с аутосомно-доминантным. Мужчина передает этот признак всем дочерям. (особая форма рахита, устойчивая к витамину D )

а б Мальчики 6 лет, больные витамин-D-резистентным рахитом (а) и почечным тубулярным ацидозом (б): а - выраженная варусная деформация нижних конечностей; б - задержка физического развития и вальгусная деформация нижних конечностей.

Сцепленный с Y-половой хромосомой (голандрический) тип наследования: 1. Больные во всех поколениях; 2. Болеют только мужчины; 3. У больного отца больны все сыновья; 4. Вероятность наследования у мальчиков 100%. (ихтиоз кожи, гипертрихоз (обволошенность наружных слуховых проходов и средних фаланг пальцев, перепонки между пальцами на ногах…)

Гипертрихоз на ушной раковине Врожденный ихтиоз (Ихтиоз Арлекино)

Близнецовый метод При использовании близнецового метода проводится сравнение: 1) монозиготных (однояйцевых) близнецов (МБ) c дизиготными (разнояйцевыми) близнецами (ДБ); 2) партнеров в монозиготных парах между собой; 3) данных анализа близнецовой выборки с общей популяцией.

Дизиготные (двуяйцевые) близнецы – развиваются из нескольких оплодотворенных яйцеклеток и имеют разный генотип.

Монозиготные (однояйцевые) близнецы – развиваются из одной оплодотворенной яйцеклетки и имеют совершенно одинаковый генотип.

Конкордантность – процент сходства группы близнецов по изучаемому признаку. Дискордантность – процент различия группы близнецов по изучаемому признаку

Формула Хольцингера КМБ – КДБ Н= × 100% 100 – КДБ Е = 100 – Н Н – коэффициент наследственности КМБ – конкордантность монозиготных близнецов КДБ – конкордантность дизиготных близнецов Е – влияние среды на развитие признака

Признаки Конкордантность (%) МБ ДБ Группа крови АВО 100 46 Цвет глаз 99, 5 28 Цвет волос 97 23 Папиллярные узоры 92 40 Косолапость 32 3 «Заячья губа» 33 5 Полиомиелит 36 6 Бронхиальная астма 19 4, 8 Корь 98 94 Туберкулез 37 15 Эпилепсия 67 3 Шизофрения 70 13 Гипертония 26, 2 10 Нормальные: Патологические

Популяционно-статистический метод используется для изучения: 1) Частоты генов в популяции, включая частоту наследственных болезней. 2) Закономерности мутационного процесса. 3) Роли наследственности и среды в возникновении болезней с наследственной предрасположенностью. 4) Влияния наследственных и средовых факторов в создании фенотипического полиморфизма человека по многим признакам.

Основные положения закона Харди-Вайнберга: В идеальной популяции 1. Частоты аллелей сохраняются неизменными в ряду поколений р + q = 1 (100%), или А + а = 1 (100%) 2. Частоты генотипов сохраняются неизменными в ряду поколений (p + q)2 = p 2 (АА) + 2 pq (Аа) + q 2 (аа) = 1, или АА + 2 Аа + аа = 1.

Формула Харди-Вайнберга: р2 (AA) + 2 pq (Aa)+ q 2 (aa) = 1 p (A) + q (a) = 1

Движущие силы эволюции (5 основных факторов). 1. Мутации 4. Дрейф генов 2. Популяционные волны 5. Отбор 3. Изоляция

Результат действия естественного отбора

На основе изучения распространения генов среди населения различных географических регионов (геногеография) можно установить центры происхождения различных этнических групп и их миграции, определить степень риска появления той или иной наследственной патологии в конкретном регионе

Цитогенетический метод основан на микроскопическом исследовании кариотипа Этапы метода: 1) культивирование клеток человека (чаще лимфоцитов) на искусственных питательных средах; 2) стимуляция митозов фитогемагглютинином (ФГА); 3) добавление колхицина (разрушает нити веретена деления) для остановки митоза на стадии метафазы; 4) обработка клеток гипотоническим раствором, вследствие чего хромосомы рассыпаются и лежат свободно; 5) окрашивание хромосом; 6) изучение под микроскопом и фотографирование; 7) вырезание отдельных хромосом и построение идиограммы.

Рутинная (равномерная) окраска. Используется для анализа числа хромосом и выявления некоторых структурных нарушений (аберраций).

Цитогенетический метод

Дифференциальная окраска хромосом Методы разработаны в 70 -е годы XX в. Основаны на линейной неоднородности хромосом и индивидуальном рисунке каждой хромосомы (цитологической карте). Используются для точной идентификации добавочных или аномальных хромосом, инверсий и крупных транслокаций.

Методы дифференциальной окраски хромосом: G-окраска, R-окраска, Q-окраска. Участки сильной и слабой конденсации по длине хромосомы специфичны для каждой хромосомы и имеют разную интенсивность окраски.

Денверская классификация хромосом человека (1960). Группа А (1 -3) – три пары самых крупных метацентрические и 1 субметацентрическая. хромосом: две Группа В – (4 -5) – две пары длинных субметацентрических хромосом. Группа С (6 -12) – 7 пар субметацентрических аутосом среднего размера и Х-хромосома. Группа D (13 -15) – три пары средних акроцентрических хромосом. Группа E (16 -18) – три пары метацинтрическая и субметацентрические хромосомы. Группа F (19 -20) – две пары маленьких метацентрических хромосом. Группа G (21 -22 и Y) – две пары мелких акроцентрических хромосом и Yхромосома. При рутинной окраске достоверно можно идентифицировать только 5 хромосом: 1, 2, 3, 16 и Y-хромосому, при дифференциальной – все хромосомы.

Идиограмма хромосом человека в соответствии с Денверской классификацией

Идиограмма хромосом человека в соответствии с Денверской и Парижской классификациями A B C E D F G

Изображение набора хромосом (справа) и систематизированный женский кариотип 46 XX (слева). Получено методом пектрального с кариотипирования.

Идиограмма при болезни Дауна, 47, ХY+21

Кариотип 46; 5 р-

Идентификация транслокационной формы б. Дауна флуоресцентной окраской

FISH-окраска – Fluorescent In Situ Hybridisation Многоцветный бэндинг пятой хромосомы человека

Цветная исчерченность хромосом человека при FISH-окраске. а) Метафазная пластинка. б) Раскладка хромосом.

Кариотип человека (идиограмма)

Дерматоглифический метод:

дактилоскопия

Дуговой. Один поток папиллярных линий. Дельт нет

Петлевой. Два потока папиллярных линий. Одна дельта

Завитковый. Три потока папиллярных линий. Две дельты

Молекулярно-генетические методы (методы анализа ДНК). Основаны на определении последовательности нуклеотидов молекулы ДНК. 1. Полимеразная цепная реакция (ПЦР). 2. Секвенирование ДНК. 3. Блот-гибридизация. Образцы ДНК получают из лимфоцитов венозной крови и других биологических субстратов (ткани, соскобы со слизистых, кости, сперма, ворсины хориона, пуповинная кровь и т. д. ).

Метод ПЦР был разработан в 1983 г. Кэрри Мюллисом. В России получил развитие с 1989 г. ПЦР – это метод амплификации ДНК in vitro, с помощью которого в течение нескольких часов можно выделить и размножить определенный участок ДНК (размером от 80 до 3000 пар нуклеотидов (п. н. ) в миллиарды раз.

Этапы ПЦР- анализа: Амплификация ДНК Рестрикционный анализ Электрофорез Идентификация результатов

1 этап выделение ДНК из крови 2 этап полимеразная цепная реакция синтеза ДНК (ПЦР) N/N N/M M/M 3 этап рестрикция (расщепление ДНК ферментом) 4 этап электрофорез в геле и просмотр результатов Условная схема проведения молекулярно-генетического анализа для выявления мутаций

Размер амплифицированных фрагментов 200 п. н. (не расщепляет) Рестрикция (расщепляет) Нормальная ДНК Мутантная ДНК CTG TTG GTC CTG TGG GTC GAC AAC CAG GAC ACC CAG Размер фрагментов после рестрикции 200 п. н. 200 норма Размер фрагментов после рестрикции 150 и 50 п. н. Электрофорез (анализ размера мутация фрагментов ДНК) 150 50

187 Идентификация генотипов гена CYP 1 A 1 методом ПДРФ-анализа. 139 120 Дорожка 1 - амплификат; 2, 3 - Ile/Ile, 4, 7 - Ile/Val; 5, 6 - Val/Val. CYP 1 A 1 пн Идентификация генотипов гена GSTM 1 методом ПЦР анализа. Дорожки 1, 2, 5 - генотип GSTM 1(+); 271 187 дорожки 3, 4 - генотип GSTM 1(0/0). Амплификат размером 187 пн - ПЦР фрагмент гена CYP 1 A 1 (положительный внутренний контроль). GSTM 1 Идентификация генотипов гена Nat 2 методом ПДРФ-анализа NAT 2/Kpn. I NAT 2/Tag. I NAT 2/Bam. HI Схема ПЦР-анализа генов метаболизма ксенобиотиков

В основе метода ПЦР лежит репликация ДНК – комплементарное достраивание ДНК по матрице с помощью фермента ДНК-полимеразы. * Размер праймеров – 20 -25 пн. Праймеры строго комплементарны правой и левой границам специфического участка ДНК и достраивание цепи протекает только между ними.

Для получения достаточного количества копий искомого фрагмента ДНК амплификация включает 30 -35 циклов. Каждый цикл амплификации включает 3 этапа, протекающие в разных температурных режимах

Схема выделения ДНК из лимфоцитов венозной крови человека

Преимущества метода ПЦР: 1. Прямое определение мутаций ДНК. 2. Высокая специфичность. Специфичность ПЦР

Муковисцидоз пн 83 80 ДНК-диагностика делеции del. F 508 муковисцидозе в семье В. методом ПЦР. при Номера на родословной соответствуют номерам на электрофореграмме продуктов амплификации: 1, 2 - родители гетерозиготы F 508/N 3 - больной, гомозигота F 508/F 508; 4, 5 - здоровые дети, 4 - гомозигота N/N, 5 - гетерозигота F 508/N

Технологии использования стволовых клеток Стволовые клетки (тотипотентные, недифференцированные) Печень Кожа Мышцы Гепатоциты Фибробласты Миофибрилы

Гибридизация соматических клеток с образованием синкарионов