Перекисное окисление липидов Характеристика процесса ПОЛ

Перекисное окисление липидов • Характеристика процесса ПОЛ • Активные формы кислорода • Свободнорадикальный механизм ПОЛ • Методы изучения ПОЛ • Образование перекиси водорода в клетке

История изучения свободнорадикальных реакций Н. Н. Семенов - цепные реакции перекисного окисления жирных кислот 1. 1957 - свободных радикалов в организме нет 2. 1965 - свободные радикалы образуются при патологии 3. 1970 - ПОЛ, свободные радикалы существуют в норме 4. 1978 - ПОЛ – важная регуляторная система клетки 5. 1983 – Государственная премия за разработку проблемы ПОЛ – авторы: Н. М. Эмануэль, Б. Н. Тарусов, Ю. А. Владимиров, А. И. Арчаков

Перекисное окисление липидов ПОЛ - цепной свободнорадикальный процесс окисления ненасыщенных жирных кислот, протекающий по типу аутоокисления Свободный радикал – атом или молекула, имеющая на внешней орбитали один или несколько электронов Активные формы кислорода – продукты восстановления кислорода: синглетный кислород, супероксидный радикал, свободные радикалы, образующиеся при взаимодействии О 2 с Н 2 О 2

1. Аллильный водород очень быстро переходит к окислителю, в результате чего возникает алкильный радикал, который затем превращается в гидроперекись:

2. Свободные радикалы

Активные формы кислорода Термин "АФК" шире, чем "свободные радикалы кислорода" (О 2∙-, НО∙) включает также молекулы: • Н 2 О 2 – перекись водорода • О 2∙ - синглетный кислород • О 3 - озон • НОCL - гипохлорит • NO –оксид азота

Значение свободнорадикального окисления • Бактерицидное и цитотоксическое действие • Регуляция артериального давления • Развитие радиационных повреждений • Развитие УФ - эритемы кожи • Развитие световых ожогов глаз • Отравление ССI 4

3. Образование свободных радикалов

4. Продолжение

5. Продукты перекисного окисления липидов 6. гидроксиноненали: С 5 Н 9 –СНОН – СН = СН – СНО (4 - гидроксиалкеналь)

6. Окисление линоленовой кислоты

Классификация радикалов • Первичные - образуются за счет реакций одноэлектронного восстановления с участием металлов с переменной валентностью (убихинон, супероксид, NO) • Вторичные – образуются из перекиси водорода, липоперекисей, гипохлорита (гидроксильный радикал, алкилдиоксил-, алкоксилрадикал) • Третичные – радикалы антиоксидандов и др.

Радикал убихинона

Оксид азота • Источником образования NO • является L-аргинин Синтез NO • катализирует фермент NO-синтаза нейрональная н. No. С эндотелиальная э. Nо. C индуцибельная и. No. С (печень, мышцы, миокард)

7.

Методы изучения процессов ПОЛ • Продукты ПОЛ • Хемилюминесценция – реакция рекомбинации супероксида, гидроксила, липидных радикалов • Электронный парамагнитнитный резонанс (ЭПР) - радикалы Н· , ОН· , НО 2· • Химические – определение содержания диеновых, триеновых коньюгатов • Определение содержания малонового диальдегида (ТБК-активные продукты) • Определение оснований Шиффа • • Антиоксиданты Определение задержки окисления метилолеата Метод Глевинда (радикал ДФПГ) Определение активности СОД, каталазы, глутатионпероксидазы, содержания витаминов А, Е, С

Значение ПОЛ • 5% кислорода восстанавливается в супероксид-ион, • 10% О 2 превращается в Н 2 О 2 • Ненасыщенные соединения, входящие в состав липидов, белков, нуклеиновых кислот, легко окисляются. • Образуются свободные радикалы • ОН, вытесняющие атомы водорода • Атомы водорода, соединяются с гидроксильными группами, образуют в гидрофобном слое молекулы воды • Происходит распад на фрагменты жирных кислот, пептидов, образуются однонитевые разрывы ДНК • Нарушается гидрофобность мембраны, увеличивается её проницаемость • Продукты ПОЛ взаимодействуют c –SH, - NH 2 и СН 3 – группами, происходит полимеризация белков, образуются основания Шиффа, теряются свойства белков • Образуется липофусцин, накапливающийся в клетке с возрастом

ОБРАЗОВАНИЕ ПЕРЕКИСИ ВОДОРОДА В КЛЕТКЕ Утилизация кислорода в клетке осуществляется в следующих процессах: • биологического окисления в митохондриях, сопряженного с образованием АТФ; • аутоокисления и образования свободных радикалов; • микросомального окисления, связанного с окислением ксенобиотиков; • окисления, сопровождаемого образованием перекиси водорода (Н 2 О 2)

8. Образование перекиси водорода в клетке

9. Четырехэлектронное восстановление кислорода

Скорость образования Н 2 О 2 в органеллах • Микросомы - 1, 5 – 3 нмоль/мин∙г белка • Митохондрии - 0, 5 нмоль/мин∙г белка • Цитоплазма - 0, 1 нмоль/мин∙г белка • Пероксисомы - 80, 0 нмоль/мин∙г белка

10.

Супероксиддисмутаза • СОД в цитозоле состоит из 2 субъединиц, содержит ионы Zn 2+ и Cu 2+ • СОД в митохондриях содержит ион Mn 2+ • При недостаточности СОД образуется пероксинитрит NO· + Н 2 О 2→ ONOO¯ повреждающий стенки эндотелия сосудов

Пероксисомы – специфические органеллы, в которых происходит образование и разрушение перекиси водорода • Пероксисомы(или микротельца) — • 0, 3 -1, 5 мкм, окруженные мембраной. • Матрикс —мелкогранулярное содержимое • Нуклеоид, краевые пластинки кристаллоподобные структуры состоят из упорядоченно упакованных фибрилл и трубочек. • Пероксисомы локализуются вблизи мембран гранулярной эндоплазматической сети.

Пероксисомы

Пероксисомы выделяют из клетки методом дифференциального центрифугирования • Удельная плотность пероксисом 1, 25, митохондрий (1, 19) лизосом (1, 23) • Выделяются в митохондриальной фракции • Тритон WR-1339 снижает плавучую плотность лизосом и они всплывают, а пероксисомы не изменяют своей плотности и осаждаются.

Ферменты пероксисом • Моноаминоксидаза превращает амины в альдегиды • Ксантиноксидаза превращает гипоксантин в ксантин • Уратоксидаза окисляет ураты: Мочевая кислота + 2 Н 2 О + О 2→аллантоин + СО 2 + Н 2 О 2 • Каталаза 2 Н 2 О 2 → 2 Н 2 О + О 2 Этанол → ацетальдегид

Функции пероксисом Метаболическая функция • Образование Н 2 О 2 с участием оксидаз • Липидный обмен: локализация вблизи капель нейтрального жира, цепь β-окисления • Образующийся ацетил-коэнзим А может транспортироваться через цитозоль в митохондрии. • В пероксисомах расщепляется около одной четверти жирных кислот. Пероксисомы стероидных секреторных гранул регулируют содержание холестерола. • Крупные пероксисомы клеток печени и почек участвуют в обезвреживании веществ. • Половина выпитогоэтанола окисляется в пероксисомах до ацетальдегида. Защитная функция • Каталаза и оксидазы аминокислот обладают антимикробным и противогрибковым действием. • Пероксисомы локализованы в желудочно-кишечном тракте, желчном пузыре, крови, дыхательных путях – являются антибактериальной системой организма.

Роль пероксисом • • Адаптивная роль пероксисом Количество пероксисом увеличивается при авитаминозе Е, голодании, недостатке неэтерифицированных жирных кислот, при изменении гомеостаза в процессе адаптации. Способствуют возникновению гиперхолестеролемии и развитию атеросклероза. Нарушение обезвреживающей функции пероксисом в отношении этанола происходит при алкоголизме. При злокачественном росте в клетках опухоли исчезают пероксисомы и их ферменты.

Наследственные дефекты пероксисом • При акаталазии наблюдается угнетение липидного обмена. • Болезнь Цельвегера характеризуется отсутствием пероксисом, сопровождается резкой мышечной слабостью, нервными расстройствами, восприимчивостью к инфекциям. Новорожденные живут всего несколько месяцев. • Хронический грануломатоз - дефект ферментов, участвующих в в образовании АФК в лейкоцитах → бактериальные инфекции

РЕГУЛЯЦИЯ ПЕРЕКИСНОГО ОКИСЛЕНИЯ В КЛЕТКЕ Состояние ПОЛ в клетке определяется следующими факторами: • Качественным составом ненасыщенных жирных кислот и фосфолипидов мембран • Наличием достаточного количества кислорода, его активных форм • Наличием катализаторов или прооксидантов • Наличием антиоксидантов • Факторами инициации

Не все фосфолипиды одинаково чувствительны к перекисному окислению • При усилении ПОЛ мембраны обогащаются более устойчивыми к окислению фракциями фосфолипидов - фосфатидилхолин - сфингомиелин • Уменьшение скорости ПОЛ приводит к повышению уровня легкоокисляемых фракций фосфолипидов -фосфатидилсерин -фосфатидилинозит -фосфатидилэтаноламин

ПРООКСИДАНТЫ Прооксиданты (или катализаторы) – это вещества, стимулирующие процессы ПОЛ К ним относятся: • активные формы кислорода • перекись водорода • свободные радикалы • ионы металлов с переменной валентностью • витамин D • ионы железа

Роль ионов железа

Метаболизм железа в организме Содержание железа в белках: • Гемоглобин 3, 0 г • Миоглобин 0, 15 г • Ферритин 0, 7 г • Трансферрин 0, 003 г • Цитохром с • Др белки 0, 003 г

11. Усвоению железа в полости кишечника способствует аскорбиновая кислота, восстанавливающая железо. В клетках слизистой кишечника железо соединяется с апоферритином с образованием ферритина, при этом ферритин окисляет Fe 2+ в Fe 3+. Поступление железа из энтероцитов в кровь сопровождается окислением железа ферментом сыворотки крови ферроксидазой (церулоплазмин). В крови Fe 3+ транспортирует белок трансферрин(транзитный пул). В ткани Fe 2+ используется для синтеза железосодержащих белков или депонируется в ферритине (медленно обменивающийся пул)

Антиоксиданты содержат подвижный атом водорода с ослабленной связью с углеродом, препятствуют образованию свободных радикалов • Ловушки радикалов • Вещества-синергисты • Комплексоны

Ловушки радикалов • Ингибиторы свободнорадикальных реакций, липидные антиоксиданты • Резко тормозят свободнорадикальные реакции в низких концентрациях • Витамин Е, бутилированный гидрокситолуол • Менее радикальный путь торможения ПОЛ осуществляется за счет взаимодействия гидроперекисей НЖК с глутатионпероксидазой и предотвращения процесса разветвления цепей

Витамин Е

• Витамин Е отдает атом водорода свободному радикалу ROO●, восстанавливая его до ROOH и таким образом останавливает развитие ПОЛ. • Сам витамин Е превращается в стабильную окисленную форму токоферолхинон

Витамин Е • Фактор резистентности эритроцитов к гемолизу, повышает перекисную резистентность эритроцитов • Снижает агрегацию тромбоцитов • Повышает уровень ЛПВП в крови • Недостаточность: дегенеративные и дистрофические процессы в скелетных мышцах и миокарде, повышается проницаемость капилляров, повреждение мембран лизосом. Нарушается функция оплодотворения • Витамин размножения

Вещества-синергисты • Способны восстанавливать Fe 3+ до Fe 2+ • Являясь донорами водорода, способны восстанавливать окисленную форму антиоксиданта и замедляют его расходование • К веществам – синергистам относятся аскорбиновая, лимонная, никотиновая, мочевая кислоты

Витамин С Аскорбиновая кислота: 1. Восстанавливает окисленную форму витамина Е 2. Являясь сильным восстановителем, взаимодействует с водорастворимыми АФК : О 2●-, Н 2 О 2, НО● и инактивирует их

12. Суточная потребность в витаминах • Е 100 - 600 мг • С 100 - 700 мг • В 2 2 – 6 мг • В 6 2 – 6 мг • D 5 – 15 мкг • А 1 – 3 мг • Каротиноиды 30 мг • Ликопин 5 – 10 мг

Витамин С • Связывает токсические вещества: свинец, мышьяк, бензол, бактерии, вирусы • Предотвращает ломкость сосудов. Поддерживает целостность сосудистой стенки и сердечной мышцы • Недостаточность: неожиданное повреждение капилляров, образование тромбов, чаще развивается у курильщиков

Комплексоны • Снижают образование вторичных радикалов, связывая ионы железа • ЭДТА, ортофосфаты, пирофосфаты, десфероксамин (десферал), тетрациклин • К природным соединениям, способным к связыванию Fe 2+ относится карнозин (β-аланил-гистидин) – уменьшает латентный период

Глутатион • Глутатионпероксидаза восстанавливает гидроперекиси липидов в составе мембран, в качестве кофермента использует Se. При недостатке Se активность антиокидантной защиты снижается

13. Система глутатионпероксидаза обладает антирадикальным и антиперекисным действием Глутатионпероксидаза • 2 G–SH + 2 RO 2 G–SS–G + 2 ROOH • 2 G–SH + ROOH G–SS–G + ROH + H 2 O • 2 G–SH + H 2 O 2 G–SS–G + 2 H 2 O Глутатионредуктаза • G–SS–G + 2 НАДФН 2 G–SH + 2 НАДФ+

Кудесан

14. КЛАССИФИКАЦИЯ ПЕРЕКИСНЫХ СИСТЕМ • В образовании липидных перекисей в клетках животных принимают участие 2 системы: • 1. Аскорбатзависимая неферментативная система ПОЛ (АЗП) включает ионы Fe 2+, активатором (индуктором) является аскорбиновая кислота. Участие аскорбата в индукции ПОЛ связано с его способностью: а) восстанавливать Fe 2+ из Fe 3+ и б) проявлять прооксидантный эффект в присутствии Fe 2+: 2 АК + 2 О 2 (2 О 2 – + 2 Н+) Н 2 О 2 + О 2 – • Аскорбиновая кислота является синергистом антиоксидантов, в частности токоферола. Прооксидантное действие связано с её окислительно-восстановительными свойствами. Не чувствительна к нагреванию и действию сульфгидрильных ядов. • 2. НАДФН- или НАДН-зависимая система ПОЛ (НЗП) является ферментативной, представлена гемоглобином, цитохромами (особенно активен цитохром С). Для работы необходимы НАДН или НАДФН, пирофосфат, Fe 2+ и ферментоактивный белок. Система нечувствительна к ЭДТА и другим комплексообразователям.

Биологическая роль ПОЛ • Синтез эйкозаноидов • Образование перекисей липидов в микросомах • Образование желчных кислот из холестерола • Респираторный взрыв

5.

Производные арахидоновой кислоты • Каннабиноиды – продукты взаимодействия арахидоновой кислоты с аминами (анандамин) • Липоксины, лейкотриены и эндоперекиси (ГПЭТЕ) – образуются при участии липоксигеназы в тромбоцитах, лейкоцитах • Изопростаны – продукты взаимодействия арахидоновой кислоты с радикалами

Микросомальное окисление

Метаболизм холестерола

ПОЛ при патологии • Ионизирующие излучения • Злокачественный рост • Атеросклероз • Катаракта

Ионизирующие излучения • • • Радиолиз воды Радиотоксины Кислородный эффект Скрытые повреждения Интерфазная гибель клеток Снижение антиокислительной активности • Индукция опухолей

Злокачественный рост • Факторы: канцерогены, ионизирующие излучения, вирусы • На начальных этапах количество радикалов – увеличивается • В сформировавшейся опухоли – снижается • Опухоль - ловушка антиоксидантов

Атеросклероз • Атеросклероз – хроническое поражение артерий, вызванное разрастанием множественных плотных утолщений артерий (бляшек), суживающих их просвет и способствующих образованию тромба • Ишемическая болезнь сердца и мозга, гипертоническая болезнь Липидно-инфильтративная теория: • при атеросклерозе повышается содержание ХС в крови, • увеличивается свертываемость крови, • в стенке сосудов – отложения липидов • разрастание соединительной ткани

Липопротеины • При атеросклерозе изменяется состав ЛП крови: повышается содержание ЛПНП и снижается содержание ЛПВП • ЛПНП являются фактором риска развития атеросклероза за счет усиления переноса ХС из ЛПНП в пораженные сосуды • В ЛПНП при атеросклерозе накапливаются продукты ПОЛ (МДА, диены)

Перекисно-модифицированные липопротеины • Окисленные липопротеины имеют большую плотность, больше содержат сфингомиелина, лизофосфатидилхолина, чем нативные ЛПНП • Окисленные ЛПНП стимулируют накопление ХС в макрофагах

ПОЛ при атеросклерозе • Активация аутоокисления ХС • Антиоксидантная недостаточность • Нарушение превращения ХС в желчные кислоты • Свободно-радикальное окисление → распад липопротеинов и фосфолипидов распад эластических волокон

Тромбоз Предрасположенность к тромбозу: • Повреждение эндотелия • Изменение скорости кровотока • Склонность к повышенной свертываемости крови • Дефицит витамина С • Ломкость сосудов • Стрессовые состояния • Курение

Факторы риска • Гиподинамия • Снижение поступления антиоксидантов с рафинированной пищей • Снижение количества антиоксидантов в пище в зимне-весенний период • Стрессовые ситуации: вспышка свободно-радикального окисления, усиленное поступление О 2 и выброс в кровь жирных кислот

Катаракта • Катаракта – помутнение хрусталика • Факторы: действие ионизирующих излучений, ультрафиолет, травмы хрусталика, диабет, воспалительные заболевания глаз, избыточное поступление стероидов, диуретиков, генетическая предрасположенность • Кристаллины могут агрегировать друг с другом, в сшивках принимают участие продукты ПОЛ

Гипероксия, гипоксия • Гипероксия – кислородное отравление • Гипоксия – накопление АДФ, образование Fe 2+, «разрыхление мембран» • При гипероксии –избыток акцептора электоронов - О 2 • При гипоксии – избыток доноров электронов – восстановленных переносчиков

Окислительный стресс • Повреждение мембран • Снижение активности антиоксидантных ферментов • Накопление первичных и вторичных продуктов ПОЛ • Распад липопротеинов и фосфолипидов • Повреждение эластических волокон • Повреждение эндотелия сосудов • Воспаление (активация нейтрофилов) • Перекисный гемолиз

Три линии защиты от цитотоксического действия АФК • Супероксидисмутаза – защищает от O 2· – • Каталаза - защищает от Н 2 О 2 • Глутатионпероксидаза – защищает от радикалов и перекисей • Активация антиоксидантных ферментов предотвращает последствия, связанные с образованием свободных радикалов

Активные формы кислорода • Образование свободных радикалов ингибирует ферменты • Инициирует образование поперечных сшивок в молекулах коллагена • АФК, являясь прооксидантами, способствуют развитию воспаления • Вызывают перекисный гемолиз эритроцитов

Перекисная гипотеза гибели клетки 1. В биологических мембранах клетки содержатся субстраты ПОЛ – ненасыщенные жирные кислоты, фосфолипиды, холестерол, а также катализаторы процесса, содержащие ионы Fe 2+. В нормально функционирующих клетках скорость ПОЛ ограничена антиоксидантами. Нарушение молекулярной организации мембран или разрушение антиоксидантов могут приводить к усилению реакций ПОЛ. 2. Процесс ПОЛ имеет аутокаталитический, самоускоряющийся характер. Раз начавшись, процесс идет со всё возрастающей скоростью, и остановить его чрезвычайно трудно. 3. Продукты ПОЛ токсичны, вызывают полимеризацию белков, окисление SH –групп белков, повреждают мембраны

16. Перекисный тип повреждения клетки Повреждающее воздействие Антиоксиданты Прооксиданты Усиление Процессов ПОЛ Торможение ПОЛ Окислительный стресс Нарушение проницаемости мембран Накопление Ca 2+, Na+ в клетке Разобщение окислительного фосфорилирования Активация лизосомальных ферментов