Передача сигнала в клетку Выполнил студент 316 группы

Передача сигнала в клетку Выполнил: студент 316 группы, специальности: «Лечебное дело, очнозаочная форма обучения» , Мулюкин Илья Алексеевич

Важное свойство мембран - способность воспринимать и передавать внутрь клетки сигналы из внешней среды. "Узнавание" сигнальных молекул осуществляется с помощью белковрецепторов, встроенных в клеточную мембрану клеток-мишеней или находящихся в клетке. Клетку-мишень определяют по способности избирательно связывать данную сигнальную молекулу с помощью рецептора.

Если сигнал воспринимается мембранными рецепторами, то схему передачи информации можно представить так: взаимодействие рецептора с сигнальной молекулой (первичным посредником); активация мембранного фермента, ответственного за образование вторичного посредника; образование вторичного посредника ц. АМФ, ц. ГМФ, ИФ 3, ДАТ или Са 2+; активация посредниками специфических белков, в основном протеинкиназ, которые, в свою очередь, фосфорилируя ферменты, оказывают влияние на активность внутриклеточных процессов. Несмотря на огромное разнообразие сигнальных молекул, рецепторов и процессов, которые они регулируют, существует всего несколько механизмов трансмембранной передачи информации: с использованием аденилатциклазной системы, инозитолфосфатной системы, каталитических рецепторов, цитоплазматических или ядерных рецепторов.

Сигнальные молекулы - гормоны, медиаторы, эйконазоиды, факторы роста, оксид азота (NO) Сигнальными молекулами могут быть неполярные и полярные вещества. Неполярные вещества, например стероидные гормоны, проникают в клетку, проходя через липидный бислой. Полярные сигнальные молекулы в клетку не проникают, но связываются специфическими рецепторами клеточных мембран. Такое взаимодействие вызывает цепь последовательных событий в самой мембране и внутри клетки. К полярным сигнальным молекулам относят белковые гормоны (например, глюкагон, инсулин, паратгормон), нейромедиаторы (например, ацетилхолин, глицин, γ-аминомасляная кислота), факторы роста, цитокины, эйкозаноиды.

Рецепторы По локализации различают мембранные, цитоплазматические и ядерные рецепторы. По другой классификации все рецепторы можно разделить на быстроотвечающие (в пределах миллисекунд) и медленноотвечающие, в пределах нескольких минут или даже часов, что характерно для гормонов, передающих сигнал на внутриклеточные рецепторы. Рецепторы первого типа - интегральные олигомерные белки, содержащие субъединицу, имеющую центр для связывания сигнальной молекулы и центральный ионный канал (рис. 1)

Рис. 1 Участие рецепторов в трансмембранной передаче сигнала. Рецепторы: 1 - связанные с ионными каналами, например рецептор ГАМК; 2 - с каталитической активностью (рецептор инсулина); 3 - передающие сигнал на фосфолипазу С, например α 1 -адренорецептор; 4 - с каталитической активностью (гуанилатциклаза, рецептор ПНФ); 5 - передающие сигнал на аденилатциклазу, например β-адренорецепторы; 6 - связывающие гормон в цитозоле или ядре, например рецептор кортизола. Рецепторы второго типа, локализованные в мембранах и не связанные с каналами, подразделяют на 2 большие группы: каталитические рецепторы, обладающие собственной тирозин-киназной или гуанилатциклазной активностью, и рецепторы, взаимодействующие через Gбелок с мембранным ферментом. Связывание ли-ганда (например, гормона) с рецептором на наружной стороне клеточной мембраны приводит к изменению активности цитоплазматического фермента, который, в свою очередь, инициирует клеточный ответ, т. е. через мембрану переносится информация, а не заряды или какие-либо растворённые молекулы. В случае цитоплазматических рецепторов через мембрану проходит гормон, а информация о присутствии гормона в клетке с помощью рецептора передаётся в ядро.

Различные клетки организма в зависимости от выполняемых ими функций имеют определённый набор рецепторов. В мембране одной клетки может быть более десятка разных типов рецепторов. Взаимодействуя с рецептором, внеклеточные химические посредники оказывают влияние на метаболизм и функциональное состояние (пролиферация, секреция и т. д. ) клеток-мишеней.

Рецепторы адреналина адренорецепторы Адренорецепторы различают по распределению в организме центральные и периферические. Центральные адренорецепторы, локализованные в различных областях мозга, участвуют в регуляции функций ЦНС, периферические - контролируют работу внутренних органов. Все адренорецепторы классифицируют на два типа - α- и β-, но каждый тип имеет несколько подтипов, наиболее распространённые из них - α 1 -, α 2 -, β 1, - и β 2 -рецепторы. В зависимости от своего анатомического расположения клетки одного типа, например гладко-мышечные клетки сосудов или адипоциты, содержат разные типы рецепторов. Несмотря на значительное подобие между α- и β-рецепторами и их подтипами, они кодируются разными генами. Адренорецепторы принадлежат к семейству белков, имеющих 7 трансмембранных αспиралей (которые принято называть доменами). Длина N- и С-концов, а также длина 1 -4 доменов различается у разных типов и подтипов рецепторов (рис. 2)

Рис. 2 Мембранная организация β 2 -адренорецептора. 1 - фрагмент рецептора, участвующий в связывании Gs-белка; 2, 3 - участки возможного фосфорилирования протеинкиназой А (2) и киназой β-адренорецептора (3); 4 - участок гликозилирования; 5 - участок связывания адреналина.

Адренорецепторы - гликопротеины, включающие в свой состав различные углеводные фрагменты. Гликозилированию подвергаются расположенные в области N-конца остатки аспарагиновой кислоты. β-Адренорецепторы встречаются практически во всех тканях организма. Количество β-адренорецепторов, приходящееся на клетку, варьирует от 300 до 4000. Центр связывания адреналина образован аминокислотными остатками третьего, пятого и шестого доменов. Другой функционально важный центр - область взаимодействия с G-белками, участвующими в формировании клеточного ответа. Остатки серина и треонина в области третьего внутреннего домена и С-конца адренорецептора могут фосфорилироваться под действием протеинкиназы А или специфической киназой р-адренорецептора. Фосфорилирование приводит к изменению конформации рецептора и снижению сродства к G-белку или препятствует связыванию с G-белком. α-Адренорецепторы различают по локализации (например, гепатоциты имеют α 1 рецепторы, адипоциты - α 2 -адренорецепторы) и механизму трансформации биологического сигнала. Эффекторные системы, связанные с α 1 - и α 2 адренорецепторами, включают G-белки разного типа - Gplc-белки (G-белок стимулирующий) и Gi-белки (G-белок ингибирующий) и соответственно ферменты фосфолипазу С или аденилатциклазу.

Рецепторы с тирозинкиназной активностью Тирозиновые протеинкиназы - ферменты, фосфорилирующие специфические белки по тирозину, подразделяют на 2 типа - мембранные (рецепторные) и цитоплазматические. Внутриклеточные тирозиновые протеинкиназы принимают участие в процессах передачи сигнала в ядро. Рецепторные тирозиновые протеинкиназы участвуют в трансмембранной передаче сигналов. Примером рецепторной тирозиновой протеинкиназы может служить рецептор инсулина (рис. 3). Рецептор инсулина - тирозиновая протеинкиназа, фосфорилирующая белки по ОН-группам тирозина. Рецептор состоит из двух α- и двух β-субъединиц, связанных дисульфидными связями и нековалентными взаимодействиями, α- и βСубъединицы - гликопротеины с углеводной частью на наружной стороне мембраны. Вне мембраны на её поверхности находятся α-субъединицы. Центр связывания инсулина образован N-концевыми доменами αсубъединиц. β-Субъединицы пронизывают мембранный бислой и не участвуют в связывании инсулина.

Рис. 3 Активация рецептора инсулина - тирозиновой протеинкиназы.

Каталитический центр тирозиновой протеинкиназы находится на внутриклеточных доменах β-субъединиц. В отсутствие гормона инсулиновые рецепторы не проявляют тирозинкиназной активности. Присоединение инсулина к центру связывания на αсубъединицах активирует фермент, причём субстратом служит сама тирозиновая протеинкиназа (β-субъединицы), т. е. происходит фо. Сфорилирование β-субъединицы по нескольким тирозиновым остаткам. Фосфорилирование β-субъединиц происходит по механизму межмолекулярного трансфосфорилирования, т. е. одна β-цепь фосфорилирует другую β-цепь той же молекулы рецептора. Это, в свою очередь, приводит к изменению субстратной специфичности тирозиновой протеинкиназы; теперь она способна фосфорилировать другие внутриклеточные белки. Активация и изменение специфичности обусловлены конформационными изменениями рецептора инсулина после связывания гормона и аутофосфорилирования. Ключевой белок, фосфорилируемый тирозиновой протеинкиназой, - субстрат инсулинового рецептора-1 (от англ, insulin receptor substrate, IRS-I). Фосфорилированный IRS-I активирует ферменты, например тирозиновую фосфопротеинфосфатазу, и белки, участвующие в регуляции клеточных процессов. Дефосфорилирование рецептора под действием тирозиновой фосфопротеинфосфатазы возвращает его в неактивное состояние. Сродство рецептора к инсулину снижается при его фос-форилировании протеинкиназой А по аминокислотным остаткам серина и треонина.

Рецепторы с гуанилатциклазной активностью Гуанилатциклаза катализирует образование ц. ГМФ из ГТФ, одного из важных посредников внутриклеточной передачи сигнала (рис. 4, 5). Гуанилатциклаза находится в клетке, как в мембранносвязанном состоянии, так и в цитозольном. Соотношения этих двух форм фермента в различных тканях разное. Например, в клетках тонкогокишечника 90% гуанилатциклазы находится в мембранах, а в лёгких и печени - лишь 20%. Цитозольная и мембранносвязанная гуанилатциклазы различаются не только по локализации, но и по молекулярной массе, активности, способу регуляции. Цитозольная форма гуанилатциклазы состоит из двух субъединиц (α и β) и содержит в своём составе простетическую группу - гем. В области гема связывается активатор этой формы гуанилатциклазы - оксид азота (NO), образующийся из аргинина под действием фермента синтазы оксида азота.

Рис. 4. Образование 3', 5'-циклического ГМФ (ц. ГМФ).

Рис. 5. Регуляция активности мембранной (1) и цитозольной (2) гуанилатциклазы.

Мембранносвязанная гуанилатциклаза - трансмембранный гликопротеин. Внутриклеточный домен гуанилатциклазы проявляет каталитическую активность, внеклеточный домен служит рецептором. Присоединение активатора к рецептору вызывает изменение конформации в мембранном и цитозольном доменах и, как следствие, активацию гуашиатциклазы. В тканях человека присутствуют 3 типа мембранносвязанных гуанилатциклаз, в активации которых принимают участие специфические регуляторы - предсердный натрийуретический фактор (ПНФ), натрийуретический пептид из мозга и кишечный пептид гуанилин. В клетках тканей выявлены 3 основных типа внутриклеточных рецепторных белков, с которыми взаимодействует ц. ГМФ: ц. ГМФ-зависимая протеинкиназа (протеинкиназа G), ц. ГМФ-регулируемые ионные каналы и ц. ГМФ-регулируемая фосфодиэстераза, специфичная к ц. АМФ (катализирует превращение ц. АМФ в АМФ). ц. ГМФ играет важную роль в регуляции Са 2+-гомеостаза в различных типах клеток. Повышение концентрации ц. ГМФ приводит к понижению концентрации Са 2+ как в результате активации Са 2+ - АТФ-аз, так и за счёт подавления рецепторзависимого поступления этого иона в цитоплазму клетки. Эти эффекты опосредованы действием протеинкиназы G на мембранные белки, участвующие в обмене Са 2+.

Cтруктурно-функциональная организация G-белков G-белки (ГТФ-связывающие белки) - универсальные посредники при передаче сигналов от рецепторов к ферментам клеточной мембраны, катализирующим образование вторичных посредников гормонального сигнала. G-белки - олигомеры, состоящие из α, β и γ-субъединиц. Состав димеров βγ незначительно различаются в разных тканях, но в пределах одной клетки все G-белки, как правило, имеют одинаковый комплект βγсубъединиц. Поэтому G-белки принято различать по их α-субъединицам. Выявлено 16 генов, кодирующих различные α-субъединицы G-белков. Некоторые из генов имеют более одного белка, , вследствие альтернативного сплайсинга РНК. Каждая α-субъединица в составе G-белка имеет специфические центры: v связывания ГТФ или ГДФ; v взаимодействия с рецептором; v связывания с βγ-субъединицами; v фосфорилирования под действием протеинкиназы С; v взаимодействия с ферментом аденилатциклазой или фосфолипазой С. В структуре G-белков отсутствуют α-спиральные, пронизывающие мембрану домены. Gбелки относят к группе "заякоренных" белков (рис. 6).

Рис. 6. Положение G-белков в мембране. Для ассоциации G-белков важно ацилирование α-протомеров алифатическими радикалами жирных кислот, миристиновой кислоты (М) или изопреновой. γ-Субъединица G-белка имеет геранильную группу (Г), связанную тиоэфирной связью с остатком цистеина С-конца.

Регуляция активности G-белков Различают неактивную форму G-белка - комплекс αβγ-ГДФ и активированную форму αβγ-ГТФ. Активация G-белка происходит при взаимодействии с комплексом активатор-рецептор, изменение конформации G-белка снижает сродство α-субъединицы к молекуле ГДФ и увеличивает к ГТФ. Замена ГДФ на ГТФ в активном центре G-белка нарушает комплементарность между α-ГТФ и βγ-субъединицами. Рецептор, связанный с сигнальной молекулой, может активировать большое количество молекул G-белка, таким образом обеспечивая усиление внеклеточного сигнала на этом этапе (рис. 7). Активированная α-субъединица G-белка (α-ГТФ) взаимодействует со специфическимбелком клеточной мембраны и изменяет его активность. Такими белками могут быть ферменты аденилатциклаза, фосфолипаза С, фосфоди-эстераза ц. ГМФ, Nа+-каналы, К+-каналы. Следующий этап цикла функционирования G-белка дефосфорилирование ГТФ, связанного с α-субъединицей, причём фермент, катализирующий эту реакцию, - сама α-субъединица.

Рис. 7. Цикл функционирования G-белка. Rs - рецептор; Г - гормон; АЦ - аденилатциклаза.

Дефосфорилирование приводит к образованию комплекса α-ГДФ, который не комплементарен специфическому белку мембраны (например, аденилатциклазе), но имеет высокое сродство к ру-протомерам. G-белок возвращается к неактивной форме - αβγ-ГДФ. При последующей активации рецептора и замене молекулы ГДФ на ГТФ цикл повторяется снова. Таким образом, α-субъединицы G-белков совершают челночное движение, перенося стимулирующий или ингибирующий сигнал от рецептора, который активирован первичным посредником (например, гормоном), на фермент, катализирующий образование вторичного посредника. Некоторые формы протеинкиназ могут фосфорилировать α-субъединицы Gбелков. Фосфорилированная α-субъединица не комплементарна специфическому белку мембраны, например аденилатциклазе или фосфолипазе С, поэтому не может участвовать в передаче сигнала.

Аденилатциклаза Фермент аденилатциклаза, катализирующий превращение АТФ в ц. АМФ (рис. 8), ключевой фермент аденилатциклазной системы передачи сигнала. Аденилатциклаза обнаружена во всех типах клеток. Фермент относят к группе интегральных белков клеточной мембраны, он имеет 12 трансмембранных доменов. Внеклеточные фрагменты аденилатциклазы гликозилированы. Цитоплазматические домены аденилатциклазы имеют два каталитических центра, ответственных за образование ц. АМФ - вторичного посредника, участвующего в регуляции активности фермента протеинкиназы А. На активность аденилатциклазы оказывают влияние как внеклеточные, так и внутриклеточные регуляторы. Внеклеточные регуляторы (гормоны, эйкозаноиды, биогенные амины) осуществляют регуляцию через специфические рецепторы, которые с помощью α-субъединиц G-белков передают сигналы на аденилатциклазу. αs-Субъединица (стимулирующая) при взаимодействии с аденилатциклазой активирует фермент, α-субъединица (ингибирующая) ингибирует фермент. В свою очередь, аденилатциклаза стимулирует проявление ГТФ-фосфатазнойактивности αсубъединиц. В результате дефосфорилирования ГТФ образуются субъединицы α s. ГДФ и αi-ГДФ, не комплементарные аденилатциклазе. Из 8 изученных изоформ аденилатциклазы 4 - Са 2+-зависимые (активируются Са 2+). Регуляция аденилатциклазы внутриклеточным кальцием позволяет клетке интегрировать активность двух основных вторичных посредников ц. АМФ и Са 2+.

Рис. 8. Образование циклического аденозинмонофосфата (ц. АМФ).

Фосфолипазы - ферменты класса гидролаз, катализирующие катаболизм глицерофосфолипидов. Различают фосфолипазы секреторные, входящие в состав панкреатического сока, и клеточные фосфолипазы. Клеточные фосфолипазы А 1, A 2, D, С различаются по специфично- к отщепляемой группе. Все фосфолипазы кальцийзависимые ферменты (рис. 9). Фосфолипаза С фермент, гидролизующий фосфоэфирную связь в глицерофосфолипидах. В клетках человека идентифицировано 10 изоформ фосфолипазы С, разлетающихся по молекулярной массе, локализации, способу регуляции, субстратной специфичности. В структуре всех изоформ фосфолипазы С отсутствуют гидрофобные домены, которые могли бы обеспечить их взаимодействие с мембраной. Однако некоторые формы фосфолипазы С связаны с мембраной с помощью гидрофобного "якоря" -ацильного остатка миристиновой кислоты или за счёт взаимодействия с поверхностью бислоя. Каталитическая активность всех изоформ фосфолипазы С зависит от ионов кальция. Большинство фосфолипаз С специфично в отношении фосфатидилинозитолов и практически не гидролизует другие типы фосфолипидов. Активный фермент может гидролизовать до 50% от общего количества фосфатидилинозитолов клеточной мембраны. При гидролизе фосфатидилинозитол-4, 5 -бисфосфата (ФИФ 2) образуются продукты диацилглицерол (ДАТ) и инозитол-1, 4, 5 -трифосфат (ИФ 3), служащие вторичными посредниками в трансмембранной передаче сигнала по инозитолфосфатному пути.

Рис. 9. Действие фосфолипаз.

Протеинкиназы Все полярные сигнальные молекулы, действующие на клетку-мишень через мембранные рецепторы, осуществляют свою биологическую функцию путём фосфорилирования специфических белков и ферментов, регулирующих метаболизм в клетке. Фосфорилирование изменяет (увеличивает или уменьшает) их активность. Катализируют фосфорилирование белков (протеинов) протеинкиназы по аминокислотным остаткам серина, треонина, тирозина. Протеинкиназы могут быть субъединицей мембранного рецептора, например тирозиновая протеинкиназа рецептора инсулина, активность которой регулируется гормоном. Другая группа Протеинкиназы, регулируемые вторичными вестниками гормонального сигнала (ц. АМФ, ц. ГМФ, Са 2+, ДАТ), например протеинкиназа А, протеинкиназа С, протеинкиназа G, кальмодулинзависимые протеинкиназы и др.

Протеинкиназы А (ц. АМФ-стимулируемые) участвуют в аденилатциклазной системе передачи сигнала. Протеинкиназа А состоит из 4 субъединиц R 2 C 2 двух регуляторных субъединиц (R 2) и двух каталитических (С 2) (см. рис. 13). Комплекс R 2 C 2 нe обладает ферментативной активностью. Комплекс R 2 C 2 разными способами прикрепляется к мембране. Некоторые формы Протеинкиназы А "заякориваются" с помощью алифатического остатка миристиновой кислоты каталитических субъединиц. Во многих тканях протеинкиназа А связана с "заякоренным" белком AKAPS (от англ. c. AMPdependent protein kinase anchoring proteins). AKAPs имеет центр связывания для регуляторных субъединиц протеинкиназы А. С помощью белка AKAPS протеинкиназа А связывается с мембраной в области локализации ферментов, катализирующих образование ц. АМФ (аденилатциклаза) или его гидролиз (фосфодиэс-тераза), а также белков, в регуляции активности которых фермент принимает участие, например потенциалзависимые Са 2+-каналы. Регуляторные субъединицы Протеинкиназы А имеют специфические центры для связывания ц. АМФ. Присоединение ц. АМФ к регуляторным субъединицам приводит к изменению конформации последних и снижению сродства к каталитическим субъединицам С, происходит диссоциация по схеме: ц. АМФ 4 + R 2 C 2 → ц. АМФ 4 R 2+ С Субъединицы С представляют собой активную форму Протеинкиназы А, которая катализирует реакции фосфорилирования белков по серину и треонину. Каталитические субъединицы С у разных типов протеинкиназ А не идентичны, они различаются прежде всего специфичностью в отношении белков-субстратов.

Протеинкиназы С участвуют в инозитолфосфатной системе передачи сигнала. Фермент состоит из двух функционально различных доменов - регуляторного и каталитического. Регуляторный домен содержит 2 структуры ("цинковые пальцы"), образованные фрагментами пептидной цепи, богатыми цистеином, и содержащими 2 иона цинка. "Цинковые пальцы" участвуют в связывании диацилглицерола. Другой фрагмент регуляторного домена имеет высокое сродство к Са 2+. Повышение концентрации кальция в цитозоле увеличивает сродство Протеинкиназы С к фосфатидилсерину мембраны. Транслокация Протеинкиназы С к мембране позволяет ферменту связаться с ДАГ, который ещё больше повышает сродство Протеинкиназы С к ионам кальция (рис. 10). Наиболее распространённые изоформы протеинкиназы С активируются Са 2+, диацилглицеролом и фосфатидилсерином. Каталитический домен имеет центр, связывающий АТФ и белок-субстрат. Активная форма фермента Протеинкиназы С фосфорилирует белки по остаткам серина и треонина. Снижение концентрации ионов кальция в клетке нарушает связь Протеинкиназы С с фосфатидилсерином и диацилглицеролом, фермент переходит в неактивную форму и отделяется от мембраны.

Рис. 10. Регуляция активности протеинкиназы С (ПКС). ФС - фосфатидилсерин; ДАГ - диацилглицерол.

Протеинкиназы G В отличие от Протеинкиназы А, протеинкиназа G присутствует не во всех тканях, её обнаруживают в лёгких, мозжечке, гладких мышцах и тромбоцитах. Изоформы Протеинкиназы G могут быть связаны с мембраной или находиться в цитоплазме. Растворимая протеинкиназа G состоит из двух идентичных субъединиц, каждая из которых имеет два центра для связывания ц. ГМФ. Присоединение ц. ГМФ к регуляторным центрам вызывает конформационные изменения субъединиц и повышает каталитическую активность фермента (рис. 11). Протеинкиназа G, подобно протеинкиназе А и С, специфична в отношении определённых белковых субстратов, которые она фосфорилирует по остаткам серина и треонина.

Рис. 11. Регуляция активности протеинкиназы G (ПКG).

Фосфодиэстеразы - ферменты, катализирующие превращение ц. АМФ (рис. 12) или ц. ГМФ в неактивные метаболиты АМФ или ГМФ. Фосфодиэстеразы, снижая концентрации вторичных посредников, разрывают цепь превращений, вызванных активатором рецептора. Фосфодиэстеразы присутствуют в клетках тканей в 2 формах: в форме растворимого белка и мембранносвязанного. Формы фермента, связанные с мембраной, в разных тканях составляют 5 -40%. В одной и той же ткани могут присутствовать разные формы фосфодиэстеразы, различающиеся по сродству к субстратам, молекулярному весу, заряду, регуляторным свойствам и локализации в клетке. Фосфодиэстеразы циклических нуклеотидов не обладают абсолютной специфичностью, поэтому, как правило, одна и та же форма фермента способна гидролизовать как ц. АМФ, так и ц. ГМФ. Однако скорости гидролиза этих двух нуклеотидов под действием одной и той же фосфодиэстеразы могут значительно различаться. Это зависит от того, какая фосфодиэстераза присутствует в клетке - более специфичная в отношении ц. АМФ или более специфичная к ц. ГМФ, от соотношения концентраций ц. АМФ и ц. ГМФ в клетке и от действия регуляторов фосфодиэстеразы. В большинстве тканей специфичная к ц. АМФ, кальмодулин и ц. ГМФ. присутствует фосфодиэстераза-1, более активируемая Са 2+, комплексом 4 Са 2+-

Рис. 12. Превращение ц. АМФ в АМФ.

Аденилатциклазная система При участии аденилатциклазной системы реализуются эффекты сотни различных по своей природе сигнальных молекул - гормонов, нейромедиаторов, эйкозаноидов. Функционирование системы трансмембранной передачи сигналов обеспечивают белки: Rs-рецептор сигнальной молекулы, которая активирует аденилатциклазу, и Ri-рецептор сигнальной молекулы, которая ингибирует аденилатциклазу; Gs-стимулирующий и Gjингибирующий аденилатциклазу белки; ферменты аденилатциклаза (АЦ) и протеинкиназа А (ПКА) (рис. 13).

Рис. 13. Аденилатциклазная система.

Последовательность событий, приводящих к активации аденилатциклазы: связывание активатора аденилатциклазной системы, например гормона (Г) с рецептором (Rs), приводит к изменению конфор-мации рецептора и увеличению его сродства к G sбелку. В результате образуется комплекс [Г][R][О-ГДФ]; присоединение [Г][R] к G-ГДФ снижает сродство α-субъединицы G s -белка к ГДФ и увеличивает сродство к ГТФ. ГДФ замещается на ГТФ; это вызывает диссоциацию комплекса. Отделившаяся субъединица α, связанная с молекулой ГТФ, обладает сродством к адени-латциклазе: [Г][R][0 -ГТФ] → [Г][R] + α-ГТФ + βγ; взаимодействие α-субъединицы с аденилатциклазой приводит к изменению конфор-мации фермента и его активации, увеличивается скорость образования ц. АМФ из АТФ; конформационные изменения в комплексе [α-ГТФ][АЦ] стимулируют повышение ГТФфосфатазной активности α-субъединицы. Протекает реакция дефосфорилирования ГТФ, и один из продуктов реакции - неорганический фосфат (Pi) отделяется от α-субъединицы, а комплекс [α-ГДФ] сохраняется; скорость гидролиза определяет время проведения сигнала; образование в активном центре α-субъединицы молекулы ГДФ снижает его сродство к аденилатциклазе, но увеличивает сродство к βγ-субъединицам. G s-белок возвращается к неактивной форме; если рецептор связан с активатором, например гормоном, цикл функционирования Gs белка повторяется.

Активация протеинкиназы А (ПКА) Молекулы ц. АМФ могут обратимо соединяться с регуляторными субъединицами ПКА. Присоединение ц. АМФ к регуляторным субъединицам (R) вызывает диссоциацию комплекса С 2 R 2 на комплекс ц. АМФ 4 R 2 и С + С. Активная протеинкиназа А фосфорилирует специфические белки по серину и треонину, в результате изменяются конформация и активность фосфорилированных белков, а это приводит к изменению скорости и направления регулируемых ими процессов в клетке. Концентрация ц. АМФ. в клетке может регулироваться, она зависит от соотношения активностей ферментов аденилатциклазы и фосфодиэстеразы. Большую роль в регуляции внутриклеточной сигнальной системы играет белок AKAPs. "Заякоренный" белок AKAPs участвует в сборке ферментных комплексов, включающих не только протеинкиназу А, но и фосфодиэстеразу и фосфопротеинфосфатазу.

Каскадный механизм усиления и подавления сигнала. Передача сигнала от мембранного рецептора через G-белок на фермент аденилатциклазу служит примером каскадной системы усиления этого сигнала. Одна молекула, активирующая рецептор, может "включать" несколько G-белков, и затем каждый активирует несколько молекул аденилатциклазы с образованием тысяч молекул ц. АМФ. На этом этапе сигнал усиливается в 102 -103 раз. Образующийся ц. АМФ "включают" другой фермент - протеинкиназу А, усиливая сигнал ещё в 1000 раз. Фосфорилирование ферментов протеинкиназой А ещё больше усиливает сигнал, в результате суммарное усиление равно 106 -107 раз. Таким образом, по механизму каскадного усиления одна молекула регулятора способна изменить активность миллионов других молекул. Но для любой из систем трансмембранной передачи сигнала клетка имеет другую систему, подавляющую этот сигнал. Каждый из этапов в ферментном каскаде находится под контролем специальных подавляющих этот сигнал механизмов. Например, длительное действие гормона приводит к десенсибилизации мембранных рецепторов: они либо инактивируются, либо вместе с гормоном погружаются в клетку посредством эндоцитоза. В результате десенсибилизации рецепторов степень активации аденилатциклазной системы снижается. Если в клетке длительное время повышена концентрация ц. АМФ (повышена активность протеинкиназы А), может происходить фосфорилирование кальциевых каналов, что приводит к повышению концентрации Са 2+ в клетке. Кальций активирует Са 2+-зависимую фосфодиэстеразу, катализирующую превращение ц. АМФ в АМФ. В результате инактивации протеинкиназы А (R 2 C 2) снижается скорость фосфорилирования специфических ферментов. Завершает "выключение" системы фосфопротеинфосфатаза, дефосфорилирующая фосфопротеины.

Влияние бактериальных токсинов на активность аденилатциклазы (АДФ-рибозилирование G-белков) Для изучения функционирования G-белков аденилатциклазной системы были использованы экзогенные бактериальные яды - холерный и коклюшный токсины. Токсины в экспериментальных условиях повышают активность аденилатциклазы практически во всех клетках организма; так, холерный токсин может стимулировать секрецию тиреоидных гормонов клетками щитовидной железы, стероидных гормонов клетками надпочечников, распад жиров в жировых клетках. Реакция разных клеток на холерный токсин вызвана повышением уровня ц. АМФ в этих клетках. Холерный токсин - олигомерный белок. Одна из субъединиц - фермент АДФрибозилтрансфераза; проникая в клетку, она катализирует присоединение АДФ-рибозы к ос8 субъединице комплекса [αs-ГТФ][АЦ] (этап активации аденилатциклазы). NAD++ [αiβγ-ГТФ][АЦ] → [АДФ-рибозил-αs ГТФ[АЦ] + никотинамид + Н+. АДФ-рибозилирование ингибирует проявление ГТФ-фосфатазной активности αs-субъединицы, не происходит дефосфорилирование ГТФ. Цикл функционирования Gs-белка останавливается на этапе активации фермента аденилатциклазы, отвечающего за образование ц. АМФ из АТФ. Фермент аденилатциклаза сохраняет повышенную активность в течение длительного времени. Субъединица коклюшного токсина, проникая в клетку, катализирует АДФ-рибозилирование αсубъединицы активированного Gs-белка NAD++ [αiβγ-ГТФ] -" [АДФ-рибозил- αiβγ-ГТФ] + никотинамид + Н+. Модифицированная α, -субъединица сохраняет высокое сродство к βγ-субъединицам, т. е. Giбелок теряет способность диссоциировать на αi-ГТФ и βγ-субъединицы. Таким образом, ингибирующий сигнал (αi-ГТФ) не достигает аденилатциклазы, значит в этом случае возможна только её активация при связывании с αs-ГТФ. Действие коклюшного токсина на клетки тканей всегда приводит к повышению уровня ц. АМФ. Симптомы холеры и коклюша развиваются в результате действия токсинов, вырабатываемых соответствующими микроорганизмами.

Инозитолфосфатная система Функционирование инозитолфосфатной системы трансмембранной передачи сигнала (рис. 14) обеспечивают: R (рецептор), фосфолипаза С, Gplc - белок, активирующий фосфолипазу С, белки и ферменты мембран и цитозоля. Рис. 14. Инозитолфосфатная система.

Последовательность событий, приводящих к активации фосфолипазы С: связывание сигнальной молекулы, например гормона с рецептором (R), вызывает изменение конформации и увеличение сродства к Ор1 с-белку. образование комплекса [Г] [К][Срlс-ГДФ] приводит к снижению сродства α-протомера Срlс-белка к ГДФ и увеличению сродства к ГТФ. ГДФ заменяется на ГТФ. это вызывает диссоциацию комплекса; отделившаяся α-субъединица, связанная с молекулой ГТФ, приобретает сродство к фос-фолипазе С. α-ГТФ взаимодействует с фосфолиггазой С и активирует её. Под действием фосфолипа-зы-С происходит гидролиз липида мембраны фосфатидилинозитол-4, 5 бисфосфата (ФИФ 2). в ходе гидролиза образуется и выходит в цитозоль гидрофильное вещество инозитол 1, 4, 5 -трифосфат (ИФ 3). Другой продукт реакции диацилглицерол (ДАГ) остаётся в мембране и участвует в активации фермента протеинкиназы С (ПКС). инозитол-1, 4, 5 -трифосфат (ИФ 3) связывается специфическими центрами Са 2+канала мембраны ЭР, это приводит к изменению конформации белка и открытию канала - Са 2+поступает в цитозоль. В отсутствие в цитозоле ИФ 3 канал закрыт.

Активация протеинкиназы С Повышение концентрации Са 2+ в цитозоле клетки увеличивает скорость взаимодействия Са 2+ с неактивным цитозольным ферментом протеинкиназой С (ПКС) и белком кальмо-дулином, таким образом сигнал, принятый рецептором клетки, раздваивается. Связывание протеинкиназы С с ионами кальция позволяет ферменту вступать в кальций-опосредованное взаимодействие с молекулами "кислого" фосфолипида мембраны, фосфатидилсерина (ФС). Диацилглицерол, занимая специфические центры в протеинкиназе С, ещё более увеличивает её сродство к ионам кальция. На внутренней стороне мембраны образуется ферментативный комплекс - [ПКС][Са 2+] [ДАГ][ФС] - активная протеинкиназа С, фосфорилирующая специфические ферменты по серину и треонину.

Участие белка кальмодулина в инозитолфосфатной передаче сигнала В клетках многих тканей присутствует белок кальмодулин, который функционирует как внутриклеточный рецептор Са 2+, он имеет 4 центра для связывания Са 2+. Комплекс [кальмодулин] -[4 Са 2+] не обладает ферментативной активностью, но взаимодействие комплекса с различными белками и ферментами приводит к их активации. Как и большинство систем трансмембранной передачи сигналов, инозитолфосфатная система имеет не только механизм усиления, но и механизм подавления сигнала. Присутствующие в цитозоле инозитол-1, 4, 5 -трифосфат (ИФ 3) и диацилглицерол (ДАТ) в мембране могут в результате серии реакций опять превращаться в фосфатидилинозитол-4, 5 бисфосфат (ФИФ 2). Ферменты, катализирующие восстановление фосфолипида, активируются фосфорилированием протеинкиназой С. Концентрация Са 2+ в клетке снижается до исходного уровня при действии Са 2+-АТФ-аз цито -плазматической мембраны и ЭР, а также Na+/Ca 2+-и Н+/Са 2+-транслоказ (активный антипорт) клеточной и митохондриальной мембран. Функционирование транслоказ Са 2+ и Са 2+-АТФ-аз может активироваться: комплексом [кальмодулин] [4 Са 2+]; протеинкиназой А (фосфорилированием); протеинкиназой G (фосфорилированием). Понижение концентрации Са 2+ в клетке и диацилглицерола в мембране приводит к изменению конформации протеинкиназы С, снижению её сродства к фосфатидилсерину, фермент диссоциирует в цитозоль (неактивная форма). Фосфорилированные протеинкиназой С ферменты и белки под действием фосфопротеинфосфатазы переходят в дефосфорилированную форму.

Передача сигнала с помощью внутриклеточных рецепторов Передача сигнала липидорастворимых стероидных гормонов и тироксина возможна только при прохождении этих гормонов через плазматическую мембрану клеток-мишеней (рис. 15). Рецепторы гормонов могут находиться в цитозоле или в ядре. Цитозольные рецепторы связаны с белком-шапероном (часто это группа белков-шаперонов). Ядерные и цитозольные рецепторы стероидных и тиреоидных гормонов содержат ДНК-связывающий домен, характеризующийся наличием двух структур "цинковых пальцев". Эффекты гормонов, которые передают сигнал через внутриклеточные рецепторы, нельзя наблюдать сразу, так как на протекание матричных процессов (транскрипцию и трансляцию) требуются часы.

Рис. 15. Передача сигнала на внутриклеточные рецепторы.

Последовательность событий, приводящих к активации транскрипции: гормон проходит через двойной липидный слой клеточной мембраны. взаимодействие гормона с рецептором (R) приводит к изменению конформации рецептора и снижению сродства к белкам-шаперонам, отделяющимся от комплекса гормон-рецептор. комплекс гормон-рецептор проходит в ядро, взаимодействует с регуляторной нуклеотид-ной последовательностью в ДНК - энхансером или сайленсером. увеличивается (при взаимодействии с энхансером) или уменьшается (при взаимодействии с сайленсером) доступность промотора для РНК-поли. Меразы. соответственно увеличивается или уменьшается скорость транскрипции структурных генов. увеличивается или уменьшается скорость трансляции. изменяется количество белков, которые могут влиять на метаболизм и функциональное состояние клетки.

Специфичность сигнализации Для исследователей, имеющих представление о количестве сигнальных молекул, о соответствующем количестве рецепторов, о трансмембранных системах передачи сигналов, вторичных посредниках, остаётся загадкой, как протеинкиназы выбирают соответствующий фермент метаболического пути для фосфорилирования. Исследователи для объяснения этого явления предлагают "гипотезу мишени" (от англ, targeting hypothesis). По этой гипотезе специфичность протеинкиназ и фосфопротеинфосфатаз достигается путём образования компартментов на мембране, в состав которых входят не только сами протеинкиназы и фосфопротеинфосфатазы, но и специфические белки-субстраты. Наличие остатка миристиновой или пальмитиновой кислоты в структуре белков-субстратов - условие их "заякоривания" в соответствующем мембранном компартменте. Однако в большинстве случаев процесс активации какого-либо метаболического процесса находится под контролем не одной, а нескольких систем внутриклеточной сигнализации, поэтому важным фактором ответа клеток служит взаимосвязь этих систем.