ПЦР Общая схема ПЦР Свойства некоторых

ПЦР

Общая схема ПЦР

Свойства некоторых термостабильных полимераз для ПЦР Taq Vent Tth Pfu Ext 5’-3’ экзонуклеазная активность есть нет есть 3’-5’ экзонуклеазная активность нет есть нет Обратная транскрипция слабая нет есть нет Концы ДНКамплификата 3’A тупые 3’A Число допускаемых ошибок (х10 -6) 285 57 нд 1, 6 нд Рутинная амплификация, при добавлении Pfu значительно повышается точность синтеза, возможность амплификации длинных фрагментов Точная амплификация RT-ПЦР Точная амплификация Амплификация фрагментов >5 kb Применение

Конструирование праймеров для амплификации фрагмента ДНК • Длина праймеров 18 -24 н • 40 -60% (G+C) • Отсутствие внутренних вторичных структур (шпилек) • Отсутствие димеров праймеров • Отсутствие протяженных (более 3) последовательностей G и С вблизи 3’ конца праймера • Близкие Tm обоих праймеров

Примеры нежелательных вторичных структур с участием праймеров Шпилька AGGCTTCAAGCT-3’ Праймер-димер 5’-AGTTGCGTAAGTAGTCCTA-3’ T TAAGAAGTGTTC-5’ 3’-CCGCGTTCAGGACCTATA-5’

Синтез вырожденных праймеров Символ Нуклеотиды В не A Вырожденный праймер – это смесь праймеров: D не C 5’-AGRTCCGGACYTAGCTTATG-3’ H не G I Инозин K G или T M A илиc N любой AGATCCGGACTTAGCTTATG R A или G AGGTCCGGACTTAGCTTATG S C или G V не T W A или T Y C или T AGATCCGGACCTAGCTTATG AGGTCCGGACCTAGCTTATG

Конструирование вырожденных (degenerate) праймеров ЗАДАЧА: Секвенирование последовательности, когда известны лишь гомологи 1. Поиск известных гомологов в Gene Bank или другой подходящей базе данных 2. Выравнивание последовательностей 3. Поиск консервативных участков 4. Конструирование праймеров, локализованных в консервативных участках 5. Использование специальных приемов для проведения ПЦР (Gradient PCR, Degenerate PCR, Nested PCR) 6. Клонирование и секвенирование амплифицированного фрагмента

Некоторые специальные приемы для проведения ПЦР Метод Особенности метода Применение Gradient PCR Возможен только на некоторых приборах, позволяет создавать градиент температуры во время отжига Подбор оптимальной температуры отжига Nested PCR Использование двух раундов амплификации с двумя парами праймеров. Матрицей для второго раунда является амплификат первого Увеличение специфичности и чувствительности ПЦР Multiplex PCR Одновременная амплификация различных фрагментов ДНК с использованием нескольких пар праймеров (размер продуктов должен различаться) RT-PCR ПЦР с обратной транскрипцией на первой стадии Одновременная детекция нескольких последовательностей Амплификация ДНКпоследовательностей, комплементарных РНКтранскриптам

Gradient PCR Nested PCR F 1 R 1 F 2 R 2 T отжига Multiplex PCR Использовано 5 пар праймеров

Некоторые специальные приложения ПЦР Прямой праймер содержит сайт рестрикции Стоп-кодон Промотор/RBS/ старт-кодон Введение в последовательность сайтов рестрикции Введение в последовательность промоторных участков и стопкодонов

КЛОНИРОВАНИЕ

Стратегические этапы клонирования I. Источник ДНК 1. м. РНК (банк к. ДНК) 2. Геномная ДНК (геномный банк ДНК) II. Получение фрагментов ДНК для клонирования -Физическое дробление ДНК (ультразвук) -Энзиматическое дробление ДНК (рестрикция) -Амплификация ДНК с помощью ПЦР III. Фракционирование и очистка фрагментов ДНК IV. Присоединение фрагментов ДНК к векторным молекулам в зависимости от полученных концов

Способы амплификации ДНК

Методы отбора рекомбинантных молекул ДНК

пользование a-комплементации в гене lac. Z для селекции рекомбинантных клон +IPTG Хромосома Δ(lac. Z)M 15 Lac. Z 3’ β-галактозидаза Плазмида C-пептид N-пептид +X-gal Белые колонии Lac. Z 5’ Расщепление X-gal Синие колонии

Фаг

Вектора серии p. Bluescript (Stratagene) Синтез дц. ДНК с помощь фага-хелпера p. Bluescript. TM SK+ Ген устойчивости к ампициллину 2958 bp Сине-белая селекция Синтез РНК in vitro Ориджин репликации

Структура вектора для экспрессии чужеродного белка

ВЕКТОРЫ ДЛЯ ЭКСПРЕССИИ КЛОНИРОВАННЫХ ГЕНОВ Векторы серии p. ET (Novagen Inc. ) Ген lac. I Полилинкер f 1 ori Промотор Т 7 Бактериальный штамм BL(DE 3)

ВВЕДЕНИЕ РЕКОМБИНАНТНЫХ МОЛЕКУЛ В РАЗЛИЧНЫЕ ОРГАНИЗМЫ

Методы трансформации физические химические биологические микроинъекции бомбардировка микрочастицами электропорация Ca. Cl 2 PEG DEAE-dextran липиды A. tumefaciens A. rhizogenes вирусы

Методы введения ДНК в клетки растений Метод Комментарий Использование Ti-плазмид Отличная высокоэффективная система, но применима не для всех видов растений Бомбардировка микрочастицами Используется для широкого круга растений и тканей; простой и дешевый метод Использование векторов на основе вирусов Неэффективный способ доставки ДНК в растительные клетки Прямое введение генов в протопласты Может использоваться для введения генов только в протопласты растительных клеток, из которых могут быть регенерированы жизнеспособные растения Микроинъекции Имеют ограниченное применение, поскольку единовременно инъекцию можно сделать только в одну клетку; манипуляции могут проводить только специалисты Электропорация Применяется для введения генов только в протопласты, из которых могут быть регенерированы жизнеспособные растения Слияние липосом Применяется для введения генов только в протопласты, из которых могут быть регенерированы жизнеспособные растения

Схема агробактериальной трансформации Хромосомная ДНК Ti-плазмида Хромосома Т-ДНК Трансформированная клетка A. tumefaciens Корончатый галл

Формирование “бородатых корней” и “корончатого гала” на редисе A. rhizogenes A. tumefaciens

Структура Ti-плазмиды и основные опины NH 2 HN C Т-ДНК Ауксин NH (CH 2)3 CH Цитокинин NH Опин Л COOH HOOC П (CH 2)2 CH COOH Нопалин NH 2 HN Катаболизм опина C NH (CH 2)3 Гены vir CH COOH NH ori CH 3 O CH COOH Октопин O OH N OH O OH Агропин OH

Пути биосинтеза основных гормонов в агробактерии NH 2 CH C OH O O 2 O CH 2 tms 1 C NH 2 O Триптофан tms 2 CO 2 + H 2 O Инозитол-3 -ацетамил CH 2 C OH NH 3 Индолилуксусная киалота NH 2 O + O O- CH 2 OPO 3 - tmr H OH 5’-АМФ OH P O- PPi H CH 3 NH CH CH 2 O O P O- CH 3 O CH 2 CH C CH 3 Изопентилдифосфат C CH 3 O H OH CH 2 OPO 3 - OH H Изопентиладенозинмонофосфат

Сигнальные молекулы O O CH 3 C C OCH 3 O CH 2 OH OCH 3 O OH OH Ацетосирингон Гидроксиaцетосирингон

Требование к векторным системам Идеальная векторная система на основе Tiплазмиды должна содержать: v сигналы, необходимые для переноса и стабильной интеграции в ДНК растений; v узнаваемый растительными полимеразами промотор; v селективный маркер для селекции трансформированных клеток; v репортерные гены для отбора трансгенных растений; v v полилинкер (уникальные сайты рестрикции), в который будет клонирован чужеродный фрагмент ДНК; не содержать онкогены.

Схема конструирования вектора на основе Ti-плазмиды Ti-плазмида p. BR 322 + T-ДНК ДНК растения Ген растения p. BR 322 Встраивание гена растения в несущественный участок ТДНК p. BR 322 Agrobacteria Интеграция Т-ДНК с новым геном в геном растения Ti-плазмида со встроенным геном Гомологичная рекомбинация с Tiплазмидой

Бинарный вектор Ген интереса Л ori E. coli ori A. tumefaciens Растительный селективный маркерный ген П + Хелперная плазмида, содержащая virгены селективный маркерный ген и для E. coli, и для A. tumefaciens Коинтегративный вектор Ген интереса Гомологичный участок Растительный селективный маркерный ген П ori A. tumefaciens Л Рекомбинантная Tiплазмида Бактериальный селективный маркерный ori E. coli ген Гены vir

Системы репортерных и селективных маркерных генов растительных клеток Фермент Использование в качестве селективного маркерного гена Использование в качестве репортерного гена гигромицинфосфотрансфераза да да дигидрофолатредуктаза да да хлорамфеникол-ацетилтрансфераза гентамицин-ацетилтрансфераза нопалинсинтаза да да нет да октопинсинтаза нет да β-глюкоронидаза нет да стрептомицинфосфотрансфераза да фермент, обуславливающий устойчивость к блеомицину да да нет люцефераза светляка нет да бактериальная люцефераза нет да треониндегидротаза да да металлотионеин II да енол-пирувилшикимат-3 -фосфатсинтаза да да фосфинотрицин-ацетилтрансфераза да да β-галактозидаза нет да бластицидин S-дезаминаза ацетолактатсинтаза да да да нет бромоксинилнитраза да нет неомицинфосфотрансфераза нет

Репортерные гены Ген LUX Ген GFP Ген GUS

Схема баллистической трансформации пластиковый цилиндр микропули штифт клетка (ткань) - мишень цилиндр с камерой Зарядное устройство Выстрел микропулями в растительные клетки перенос клеток начашку с фильтром формирование растений-регенерантов микропуля внутри клетки вакуоль цитоплазма ядро клеточная стенка