Отчет 3 курса кафедры клеточной биологии и гистологии

Отчет 3 курса кафедры клеточной биологии и гистологии по практике на Беломорской биологической станции имени Н. А. Перцова 2014 год

Как все начиналось

Объекты

Задача № 1. Дробление и ранние стадии развития нематоды Pontonema vulgare

Цель: Исследовать дробление и ранние стадии развития Pontonema vulgare Задачи: 1. Сбор материала и ознакомление с объектом 2. Получение яиц 3. Наблюдение за развитием яиц Материалы и методы: Камера - Digital camera for microscope DCM 510 (USB 2. 0), 5 megapixels, CMOS ship Программа - Scope Photo Бинокуляр – увеличение х7

Объект: Pontonema vulgare • Обитает на сублиторали, в заиленных грунтах, в сплетениях ризоидов и на талломах бурых водорослей • 12 -20 мм в длину, диаметр в середине тела 170 -220 мкм • Тело белое, кишка коричневая, у ♀ сквозь полупрозрачные покровы средней части тела просвечивают крупные белые яйца • Яйцекладущая нематода с кладкой из 40 -50 яйц, склеенных между собой и покрытых общей прозрачной оболочкой • Детритофаг, падальщик Тип: Nemathelmintes Класс: Nematodes Подкласс: Enoplia Отряд: Enoplida Pontonema vulgare Преимущества • Развитие в течение всего весенне-летнего сезона • Легко доступны • Можно наблюдать поведение пронуклеусов при оплодотворении и процесс дробления

Ход работы

Фото Черанев В. , Дронов И. , Фридман И. 24. 06. 14, 10: 52 Яйца попали в благоприятную для них среду, сначала они имеют овальную форму, затем округляются, увеличение x 40

Фото Черанев В. , Дронов И. , Фридман И. 24. 06. 14, 15: 06 Начинает формироваться борозда деления, проходящая экваториально

Фото Черанев В. , Дронов И. , Фридман И. 24. 06. 14, 18: 56 Возможно, видим полярное тельце, в остальном видимых изменений нет

Фото Черанев В. , Дронов И. , Фридман И. 25. 06. 12: 59 Стадия 2 бластомеров, осуществляется подготовка к следующему делению

Фото Черанев В. , Дронов И. , Фридман И. 27. 06. 14, 21: 31 Предположительно, стадия 8 бластомеров.

Фото Черанев В. , Дронов И. , Фридман И. 27. 06. 14, 21: 18 Стадия >16 бластомеров. Деления становятся асинхронными

Выводы • Нематода Pontonema vulgare является удобным объектом для изучения дробления, т. к. ее яйца могут дробиться в условиях лаборатории, в чашке Петри, без перемены воды, при комнатной температуре. • Мы проследили за развитием нематоды Pontonema vulgare до стадии 16 бластомеров. • Стадию 2 бластомеров наблюдали спустя 26 часов, 8 - спустя 58 часов

Планы • Провести цейтраферную съемку и проследить образование полярного тельца • Под микроскопом выявить наличие бластомеров разного размера (показать асинхронное деление)

Задача № 2. Устойчивость функционирования ресничного эпителия жабр трех видов моллюсков под воздействием ряда химических и физических факторов

Цель: изучение устойчивости функционирования ресничного эпителия жабр моллюсков, обитающих в различных биотопах, под воздействием различных химических и физических факторов Задачи: 1. Получить жизнеспособные препараты 2. Выявить закономерности изменения функционирования ресничного эпителия при воздействии ЭДТА и метиленового синего 3. Определить наличие автофлуоресценции клеток эпителия

Объекты исследования: Modiolus modiolus Mya arinaria Mytilus edulis

Сбор материала

Ход работы: 1. Вскрыть моллюсков в чашке Петри с морской водой и извлечь жабры. 2. Изучить общую структуру жабр и жаберных нитей. 3. Из участка жабры приготовить препарат, используя предметные стекла с лункой. 4. Для изучения устойчивости функционирования ресничного эпителия обработать препараты химическими реактивами: - метиленовым синим - ЭДТА. 5. Снять воздействие и засечь время восстановления биения ресничек. 6. Каждый эксперимент повторить 3 раза.

Результаты: автофлуоресценция ресничного эпителия Modiolus modiolus 405 561 488

Воздействие FCCP, ЭДТА и метиленового синего • При воздействии метиленового синего у всех трёх видов моллюсков наблюдалось обратимое замедление биение ресничек (через 10 -30 мин после начала воздействия). Исходная скорость восстанавливалась и при отсутствии отмывания. • FCCP использовали в концентрациях 0, 5 мк. М и 5 мк. М, наблюдение проводили в течение 30 мин. В концентрации 0, 5 мк. М значительно замедляет биение ресничек у Modiolus modiolus и Mya arinaria и полностью останавливает у мидии. 5 мк. М FCCP вызывает полную и необратимую остановку биения ресничек у всех трёх исследованных видов моллюсков. • При воздействии 1 м. М ЭДТА: у Modiolus modiolus через 10 мин после начала воздействия реснички неподвижны либо двигаются крайне медленно; при отмывании биение ресничек восстанавливается. У Mytilus edilus и Mya arinaria происходила полная остановка ресничек, которая оказывалась обратимой при отмывании морской водой. Следовательно, для движения ресничек необходимо присутствие в среде двухвалентных катионов.

Воздействие глутарового альдегида

Воздействие опреснения В пресной воде у глубоководного моллюска Modiolus modiolus биение ресничек прекращается уже через 10 мин после начала воздействия, в то время как у литоральных видов биение сохраняется, даже если скорость его значительно снижается. Остановка биения ресничек происходит у Modiolus и при 70%-м опреснении, в то время как у двух других видов оно, как правило, сохраняется в некоторой степени. Кроме того, на восстановление подвижности ресничек после замены опреснённой воды обычной морской у Modiolus требуется наибольшее время (около 5 мин).

Выводы: 1. Ресничный эпителий моллюсков обладает слабой автофлуоресценцией на всех длинах волн. 2. При воздействии ЭДТА движение ресничек останавливается, после отмывки движение восстанавливается. Следовательно, для движения ресничек необходимо наличие двухвалентных катионов. 3. Метиленовый синий адсорбируется эпителиальными клетками, не нарушая работу ресничек, а лишь немного замедляя их движение при его добавлении. 4. Реснички эпителия трех видов моллюсков при добавлении ЭДТА и метиленового синего ведут себя сходным образом.

Планы • Задача выполнена полностью • Можно расширить спектр воздействий (например, устойчивость к ультрафиолетовому излучению) • Можно оценивать жизнеспособность клеток эпителия после воздействий

Задача № 3. Временные препараты эпителиев беспозвоночных фауны ББС

Цель: изучение особенностей строения эпителиев некоторых типов беспозвоночных Задачи: 1. Приготовить препараты эпителиев; 2. Изучить макроскопические особенности строения покровных и кишечных эпителиев некоторых типов беспозвоночных; 3. соотнести особенности среды обитания животных со строением их эпителиальной ткани.

Объекты Морская звезда Тип Echinodermata Класс Asteroidea Отряд Forcepulata Семейство Asteridae Asterias rubens Бокоплав Тип Arthropoda Класс Crustacea Отряд Amphipoda Семейство Gammaridae Gammarus dubeni

Объекты Медуза Тип Cnidaria Класс Scyphozoa Отряд Semaeostomae Семейство Ulmaridae Aurelia aurita Нематода Тип Nemathelminthes Класс Nematodes Отряд Enoplida Семейство Oncholaimidae Pontonema vulgare

Материалы: Оборудование: Камера DCM 510, 5 megapixels, бинокуляр, микроскоп ЛОМО МИКМЕД-1; чашки Петри, препаровальные иглы, пинцеты, ножницы, бритвенные лезвия; предметные стёкла, предметные стёкла с лункой, покровные стёкла Реактивы: 4% раствор параформальдегида(ПФА) в 1 х. PBS; морская вода; этиловый спирт, красители гематоксилин-эозин Метод: световая микроскопия

Ход работы Морская звезда • Проведение вскрытия в слабом спирте • Отрезание покровов, выделение пищеварительной системы Бокоплав • Фиксация особи в формалине • Отделение внешнего слоя • Рассмотрение строения кутикулы; окрашивание спинных щитков метиленовым синим • Удаление колец наружного скелета, конечностей, выделение пищеварительной системы • Немертина • Разрезание немертины поперёк на три части, помещение их в 30% спирт (на 30 минут) • Исследование кутикулы • Выделение пищеварительной системы Медуза • Фиксация медузы в спирте • Вырезание ропалия под бинокуляром • Серия срезов желудка

Результаты Asterias rubens желудок Клетки эпителия высокие, цилиндрические. Хорошо заметна щёточная каёмка Видны бокаловидные клетки (объектив 40 х)

Результаты Gammarus dubeni Спинной щиток (объектив 40 х) Видны морулярные амёбоциты в толще кутикулы Пигментные клетки (объектив 10 х) Кишечник (объектив 4 х) Белые стрелки указывают стенки средней кишки По бокам от кишечной трубки липидные капли оранжевого цвета Видны белёсые печёночные выросты

Результаты Кутикула Pontonema vulgare На срезе видны слои кутикулярного эпителия: эпикутикула, промежуточный слой с полостями, базальный слой кутикулы

Результаты Aurelia aurita ропалий желудок

Выводы • Описанная методика позволяет наблюдать клетки в некоторых типах кишечных и кутикулярных эпителиев беспозвоночных животных Планы • Отвести больше времени на обучение технике приготовления полутонких срезов эпителиев • Отработать методики окраски полутонких срезов • Сравнить строение кутикул и кутикулярных эпителиев различных беспозвоночных и провести анализ зависимости кутикул от среды обитания

Задача № 4 Тема: Изучение автофлуоресценции клеток гидроидного полипа Obelia geniculata и ропалия сцифоидной медузы Aurelia aurita

Цель работы Изучение автофлуоресценции клеток гидроидного полипа O. geniculata и ропалия сцифоидной медузы A. aurita, обитающих в Белом море Задачи 1. Подготовить образцы тканей ножки полипа и ропалия медузы для прижизненного наблюдения; 2. Ознакомиться с принципами устройства конфокального микроскопа; 3. Провести прижизненное наблюдение автофлуоресценции клеток беспозвоночных на разных длинах волн.

Материалы и методы: Оборудование: 1. Чашка Петри (2 мл) со стеклянным дном 2. Бритвенное лезвие; 3. Препаровальные иглы; 4. Предметные и покровные стёкла.

Методы: Прижизненное наблюдение, сканирующий конфокальный микроскоп Nikon A 1

Объекты: Obelia geniculata Тип: Cnidaria Класс: Hydrozoa Отряд: Leptolida Сем. : Campanulariidae Obelia geniculata (ножка гидранта)

Объекты: Aurelia aurita Тип: Cnidaria Класс: Scyphozoa Отряд: Semaeostomae Сем. : Ulmaridae Aurelia aurita (ропалий)

Ход работы 1. В конце июня на Еремеевских порогах Белого моря, в сублиторальной зоне, нами была найдена ламинария, на которой росла O. geniculata; 2. Кусочек водоросли с частью колонии был помещен нами в чашку Петри № 1 с приклеенным на дно покровным стеклом; 3. Препарат был облучён синим лазером, λ=488 нм; 1. В конце июня в Белом море, на пирсе в районе ББС, нами была выловлена сцифоидная медуза A. aurita; 2. Был отрезан ропалий и помещен в чашку Петри № 2; 3. Препарат был облучён зелёным лазером, λ=561 нм;

Анализ результатов Obelia geniculata Видим 6 ярких зелёных пятен, находящихся в ножке гидранта. Это фотоциты, содержащие GFP, который излучает свет большей длины волны, чем длина волны падающего света( эффект Стокса).

Анализ результатов Aurelia aurita Мы рассматриваем чашевидный глазок ропалия медузы. Многочесленные красные точки – это скопления пигмента.

Выводы 1. Мы собрали подходящий для изучения материал и подготовили препарат к прижизненному наблюдению; 2. Нам удалось произвести прижизненное наблюдение за флуоресценцией различных типов клеток; 3. К флуоресценции способны клетки как Obelia geniculata, так и Aurelia aurita.

Задача № 5. Хлоридные клетки рыб Докладчик: Фридман И. А. Преподаватель: Смирнова Т. А. Беломорская биостанция МГУ, июль 2014

Цель: изучить поведение митохондрий хлоридных клеток из жабр рыб при воздействии FCCP и в различных условиях солености.

Объект исследования: КЕРЧАК тип Chordata Класс Osteichthyes Отряд Scorpaeniformes Семейство Cottidae Myoxocephalus scorpius (Linnaeus, 1758)

Ход работы: Рыбе отрезать голову, вырезать жаберную дугу, промыть морской водой, срезать жаберные нити. Поместить жаберные нити в морскую воду, содержащую 0, 1 мк. М митохондриального красителя TMRE, на 30 мин, отмыть в морской воде 15 мин. Сканирующая конфокальная микроскопия: найти хлоридные клетки, сфотографировать на малом и большом увеличении (флуоресценция митохондриального красителя + в проходящем свете).

Препараты: 1. Контроль в морской воде 2. Препарат в смеси морской воды и бескальциевого буфера 1: 1 3. В морской воде с добавлением Ca. Cl 2 4. 10 м. М раствор FCCP

Препарат № 1: контроль (в морской воде)

Препарат № 4: FCCP (в морской воде) В FCCP красное свечение митохондрий затухает, т. к. исчезает потенциал на их мембране. При величине концентрации 10 м. М свечение не наблюдается. Это доказывает, что все светящиеся точки являлись митохондриями.

Выводы: В морской воде митохондрии препарата функционируют нормально. Краситель TMRE подходит для наблюдения за митохондриями на конфокальном микроскопе. Окрашивание специфично для энергизованных митохондрий.

Планы Увеличить продолжительность воздействия агентов Проводить эксперимент на живой рыбе (in vivo) Провести эксперименты с жабрами других рыб

ЗАДАЧА № 8 ТКАНИ ВНУТРЕННЕЙ СРЕДЫ БЕСПОЗВОНОЧНЫХ

Введение Интерстициальные ткани типа рыхлой соединительной ткани широко распространены у представителей различных типов беспозвоночных животных. Тканевая жидкость играет роль посредника в обмене веществ между клетками тканей и циркулирующей кровью, в связи с чем состав ее непрерывно обновляется. Возможна реализация трофической функции путем создания обширных полостей, заполненных тканевой жидкостью - гемолимфой, которая омывает работающие органы. Возможна реализация транспортной функции по специализированным межклеточным щелям

Объекты и цели исследования Объекты: двустворчатые моллюски Modiolus modiolus (Linnaeus, 1758) Mytilus edulis (Linnaeus, 1758) Цели: 1) Получить мазки и отпечатки паренхимы и гемолимфы моллюсков 2) Сделать временные препараты 3) Рассмотреть разные типы клеток и определить их возможные функции по морфологическим признакам

Микрофотографии временных препаратов Клетки паренхимы Modiolus m. Объектив х40, окраска гематоксилин-эозин Клетки паренхимы Mytilus ed. Объектив х40, окраска гематоксилин-эозин

Клетки паренхимы Mytilus edilus, объектив х40, окраска гематоксилин-эозин

Типы клеток Mytilus edulus , их морфология и возможные функции Гемолимфа мидии АМЁБОЦИТ ГЕМОЦИТ Паренхима мидии АГРАНУЛОЦИТ ЯЙЦЕКЛЕТКА АМЁБОЦИТ ИММУННАЯ КЛЕТКА (? ) КЛЕТКА ЭПИТЕЛИЯ ФИБРОБЛАСТ ЗАПАСАЮЩАЯ КЛЕТКА ФИБРОБЛАСТ ИММУННАЯ КЛЕТКА (? ) ЭРИТРОЦИТЫ

Типы клеток Modiolus modiolus, их морфология и возможные функции Гемолимфа моллюска ФИБРОБЛАСТ ИММУННАЯ КЛЕТКА (? ) ОСТРОВОК ЭПИТЕЛИАЛЬНЫХ КЛЕТОК Паренхима моллюска ФИБРОБЛАСТ СОЕДИНИТЕЛЬНАЯ ТКАНЬ

Результаты и обсуждения 1) Мы научились : - выделять клетки тканей внутренней среды - делать временные препараты мазков гемолимфы и паренхимы двустворчатых моллюсков. 2) Целомическая жидкость содержит различные типы клеток: эпителиальные, мышечные, запасающие, половые и клетки соединительной ткани.

Планы Отработать методику окраски мазков и отпечатков тканей беспозвоночных по Романовскому-Гимза Отработать методы фиксации мазков и отпечатков тканей беспозвоночных ацетоном и метиловым спиртом

Задача № 3. Культура клеток холоднокровных (пойкилотермных) животных.

Описание эксперимента. Вскрытие морской звезды с целью извлечь нужный орган (печеночный вырост) производилось в отфильтрованной морской воде. Затем измельчили и поместили в центрифужную пробирку с солевым раствором без Са и Мg. Поместили в холодильник на 30 -45 мин. Центрифугировали 10 мин при 400 g. Слили надосадочную жидкость, затем к клеткам прилили 1 мл р-р без Са и Mg. Пипетировали р-р с добавлением 8 мл полной среды с сывороткой. Разделили на несколько проб в чашки петри с покровными стеклами. Перед проверкой проб их окрасили эозином и гематоксилином.

Часть проб были проверены вечером того же дня. Были найдены: 1. Найдены множество клетки округлой формы, маленького размера, образуют скопления или лежат поодиночке. (предположительно транспортные клетки) 2. Крупная одиночная клетка неправильной формы, вытянутая, содержит крупные гранулы, ядро неправильной формы. ( «макрофаги» ) макрофаг 3. Большая округлая клетка, ядро замнимает приблизительно всю клетку. (зрелая яйцеклетка)

Часть проб были проверены вечером того же дня. 4. Крупная клетка неправильной формы, с сегментированным ядром. ( «гранулоцит» ) 5. Ромбовидная клетка с отростками и с небольшим округлым ядром по центру. ( «фибробласт» ) 6. Клетки среднего размера, округлое ядро (клетки ткани печени)

Также на следующие сутки были проверены вторая часть проб. Тип 1 (предположительно транспортные клетки) По-прежнему количественно преобладают Тип 2 ( «макрофаги» ) Одиночно встречаются по препарату. Тип 3 (яйцеклетки). Их количество также возросло. 4, 5 (предположительно гранулоциты и фибробласты. Единичное количество. Тип 6 (клетки печени). Не встречаются.

Выводы: 1. Нам удалось предположительно идентифицировать некоторые типы клеток: Фибробласты Яйцеклетки Гранулоциты Макрофаги Транспортные кл. Клетки тканей печеночных выростов. 2. Некоторые клетки не удалось идентифицировать в связи с недостаточным знанием цитологии беспозвоночных. 3. Количество клеток на второй части проб увеличилось в связи с тем, что у них было больше времени на рост и распластывание по препарату.

Получение зрелых гамет и искусственное оплодотворение морской звезды Asterias rubens

Объект: Asterias rubens Внешний вид: 5 лучей одинаковой длины, аборальная сторона тела окрашена в яркооранжевые или кирпичнокрасные тона, а оральная сторона — бледно жёлтая. Размножение: раздельнополые. Личинки планктонные, обитают в пелагиали. При оседании на дно проделывают сложный метаморфоз и оканчивают его примерно через три месяца после вылупления. Классификация • Тип: Echinodermata • Класс: Asteroidea • Отряд: Forcipulatida • Семейство: Asteriidae • Род: Asterias • Вид: Asterias rubens Питание: хищник, падальщик

Ход работы Внешний вид гонад Отлов звезд на пирсе ББС МГУ. Отделение лучей, определение пола по внешнему виду гонад. Извлечение зрелых гонад (семенная жидкость/яйцеклетки) Добавление в чашку Петри с яйцеклетками семенной жидкости. Наблюдение за слиянием и дроблением. Фиксация препарата на стадии 2 -4 бластомеров Окрашивание DAPI для наблюдения митотических картин

Результаты Время Что наблюдаем 0 мин. Роение сперматозоидов вокруг яйцеклетки. Образование семенного бугорка. Выделение оболочки оплодотворения. С 5 -10 мин. Замедление и полная остановка движения сперматозоидов 2 часа Наблюдаются клетки с бороздой дробления. 5 часов Равномерное и неравномерное (нехарактерно) дробление зиготы (стадии 2 -х и 3 -х бластомеров). 6 часов Стадия морулы. Фотография

Результаты Окраска ядер DAPI яйца морской звезды на стадии трех бластомеров

Обсуждение результатов Помимо равномерного, мы наблюдали также неравномерное деление, нехарактерное для иглокожих. Возможные причины аномалии- условия проведения эксперимента (температура, концентрация сперматозоидов и яйцеклеток). Равномерное дробление Неравномерное дробление При окраске DAPI в препаратах яиц окраска ядер бластомеров равномерная, что говорит о том, что митозы не идут (возможно, также из-за условий проведения эксперимента).

Выводы Удалось выделить гаметы, определить их зрелость и пол морской звезды Asterias rubens, провести искусственное оплодотворение Удалось наблюдать дробление зиготы до морулы Условия проведения эксперимента не позволили яйцам развиваться без аномалий Не удалось выявить митотические хромосомы окраской DAPI

Планы Отработать методы накопления митозов в гаметах морской звезды Оптимизировать условия эксперимента для сохранения равномерности дробления

Список задач 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. Дробление и ранние стадии развития Pontonema vulgare (Гаранина А. С. ) Устойчивость функционирования ресничного эпителия жабр трех видов моллюсков под воздействием ряда химических факторов (Савицкая М. А. ) Временные препараты эпителиев беспозвоночных фауны ББС (Гладких А. А. ) Хлоридные клетки рыб (Смирнова Т. А. ) Изучение биолюминесценции и флуоресценции клеток гидроидного полипа Obelia geniculata (Linnaeus) и ропалия сцифоидной медузы Aurelia aurita (Гаранина А. С. ) Культура клеток беспозвоночных (Смирнова Т. А. ) Ткани внутреней среды беспозвоночных (Гладких А. А. ) Получение зрелых гамет и искусственное оплодотворение морской звезды (Вильданова М. С. )

Спасибо за внимание!!!