Основы метода гибридизации. Риботипирование
Метод гибридизации Гибридизация ДНК, гибридизация нуклеиновых кислот — соединение in vitro комплементарных одноцепочечных нуклеиновых кислот в одну молекулу. При полной комплементарности объединение происходит легко и быстро, а в случае частичной некомплементарности слияние цепочек замедляется, что позволяет оценить степень комплементарности. Возможна гибридизация ДНК и ДНК РНК.
Метод гибридизации Химической основой метода является соединение искомой нуклеиновой кислоты с меченым зондом через комплементарные ДНК участки; исход их взаимодействия учитывается по появлению метки (обычно радиоизотопной) в составе образовавшегося комплекса.
Метод гибридизации Постановка к. ДНК гибридизации предполагает: 1. экстракцию и денатурирование нуклеиновой кислоты; 2. инкубацию ее в растворе с избытком молекул зонда в режимах, специально подобранных для каждой конкретной гибридизации (в конечном счете они определяются степенью комплементарности реагирующих участков); 3. отмывание комплекса от несвязавшихся молекул зонда; 4. учет результатов по интенсивности сигнала, поступающего от метки в составе комплекса. Чаще всего применяют т. н. точечную (dot blot) гибридизацию на мембранных фильтрах.
Метод гибридизации
Риботипирование § один из методов генотипирования; § направлен на выявление у изучаемых штаммов различий в количестве рибосомальных оперонов, а также рестрикционного полиморфизма их нуклеотидных последовательностей.
Риботипирование Последовательность нуклеотидных основа ний в оперонах, кодирующих р. РНК, отлича ется консервативностью, присущей каждому виду бактерий. Эти опероны представлены на бактериальной хромосоме в нескольких ко пиях. Фрагменты ДНК, полученные после об работки ее рестриктазами, содержат последо вательности генов р. РНК, которые могут быть обнаружены методом молекулярной гибри дизации с меченой р. РНК соответствующего виды бактерий. Количество и локализация копий оперонов р. РНК и рестрикционный состав сайтов как внутри р. РНК оперона, так и по его флангам варьируют у различных вида бактерий.
Принцип метода Хромосомную ДНК подвергают действию ферментов рестрикции. Продукты гидролиза ДНК разделяются методом электрофореза в агарозном геле, а затем гибридизуются с ДНК зондами на один или несколько генов, кодирующих 16 S, 23 S, 5 S рибосомальные РНК; в качестве зондов выступают нуклеотидные последовательности генов 16 S и 23 S r. РНК и гипервариабельные нуклеотидные последовательности, рассеянные по геному многих патогенных видов бактерий;
Результаты В результате гибридизации зонда с комплектом р. РНК оперонов получается профиль, содержащий до 10 полос. Такие профили обладают видовой, а зачастую и штаммовой специфичностью.
Характеристики метода Возможно типирование всех штаммов; Отличная воспроизводимость; Легкое выполнение метода; Легкая интерпретация результатов; Риботипирование по всем реакциям было автоматизировано и в настоящее время выполняется роботом. Специальное программное обеспечение позволило получить воспроизводимые «отпечатки пальцев» и создать базу данных для идентификационных целей
Применение для установления видовой принадлежности изолятов и их внутривидовой классификации; позволяет дифференцировать близкородственные и сходные по свойствам виды, а также идентифицировать их новые подвиды; в случае неэффективности анализа рестрикционного профиля ДНК, риботипирование позволяет различить штаммы одного и того же серотипа в пределах вида;
Опосредованная транскрипцией амплифика ция р. РНК используется для диагностики сме шанных инфекций. метод основан на обнаружении с помощью молекулярной гиб ридизации амплифицированных р. РНК, спе цифичных для определенного вида бактерий.
Опосредованная транскрипцией амплифика ция р. РНК Этапы исследования: 1. Амплификация пула р. РНК на матрице, вы деленной из исследуемого материала ДНК при помощи ДНК зависимой РНК полимеразы. 2. Гибридизация накопленного пула р. РНК с комплементарными видоспецифическим р. РНК олигонуклеотидами, меченными флюорохромом или ферментами. 3. Определение продуктов гибридизации методами денситометрии, иммуноферментного анализа (ИФА).
Опосредованная транскрипцией амплифика ция р. РНК Реакция проводится в автоматическом ре жиме в установках, в которых одномоментное определение р. РНК, принадлежащих различ ным видам бактерий, достигается разделе нием амплифицированного пула р. РНК на несколько проб, в которые вносятся компле ментарные видоспецифическим р. РНК мече ные олигонуклеотиды для гибридизации
Скачать презентацию Основы метода гибридизации Риботипирование Метод гибридизации Гибридизация
основы гибридизации. Риботипирование.pptx