Основы капиллярной электрохроматографии Капиллярная электрохроматография Капиллярный электрофорез

Основы капиллярной электрохроматографии

Капиллярная электрохроматография Капиллярный электрофорез Высокоэффективная жидкостная хроматография Электроосмотический поток – движение жидкости под действием электрического поля 2

Скорость ЭОП в монолитных колонках • Оценка пористости сорбента где σ*/σпотношение u. ЭОП – электроосмотическая скорость, создаваемая монолитом коэффициентов проводимости ε 0 – электрическая проницаемость заполненной колонки (σ*) и пустого капилляра (σп) среды в вакууме, εr – относительная диэлектрическая проницаемость вещества, η – вязкость среды, [м²/с] E – напряженность электрического поля [В] 3

Что лучше: КЭХ или ВЭЖХ? 4

• Уравнение Ван-Деемтера (H), мкм Линейная скорость потока (см/мин) 5 А – параметр, характеризующий вихревую диффузию В – характеризует продольную диффузию С – ответственнен за межфазный массообмен

Режимы разделения в КЭХ 1) сонаправленная КЭХ; 2) противоположнонаправленная КЭХ; 3) смешаннаго типа КЭХ. 6 u. КЭХ – общая скорость миграции, определяемая из электрофореграммы [см/мин]; u. ЭФ – электрофоретическая скорость аналита в КЭХ [см/мин]; k’ 1 c – хроматографический фактор удерживания.

Колонки для КЭХ PLOT – колонки (porous-layer open tubular) Легкость протекания элюента Насадочные колонки Монолитные колонки Нестабильность Способствуют нулевой линии ускорению массообмена Фритты 7 Sкап < SPLOT< Sмонолит , Sнас

Монолитные колонки Неорганические монолиты (на основе силикагеля) Органические монолиты на полимерной основе Полинонборнен Ограничение в использовании в протеомике из-за необратимой адсорбции биополимеров на поверхности сорбента и стенках капилляра Полиакриламиды 8 Полистиролы Полиметакрилаты

Монолитный пористый полимер на акриламидной основе в водном растворе 9 Золь-гелевая связь между частицами кремния и стенками капилляра. Группы R в дальнейшем могут быть подвергнуты функционализации.

Не контроллируемый процесс полимеризаци Содержат не более 5% твердого полимера Большое время анализа Сложность растворения неполярных мономеров в воде 10

Монолитные колонки на основе акриламида 1 этап – формирование свободного персульфатного радикала: 2 этап – полимеризация акриламида: 11 3 этап – перекрестное связывание акриламида с N, N’- метиленбис(акриламидом)

Монолитные колонки на основе акриламида Сорбент обладает высокой физической и химической стабильностью. Полиамидный монолит Недостатки: Большое время процесса полимеризации Неустойчивы при граничных значениях p. H 12

13 Изократическая ЭХ пептидов в капилляре с макропористым полиакриламидным/поли(этиленгликоль) монолитом, дериватизированным лигандами С 12(29%) и содержащим акриловую кислоту. Условия: подвижная фаза, 47% ацетонитрила в 10 ммоль Tris/15 моль борной кислоты (p. H 8. 2) буфере; system peak (1), tyr-arg (2), gly-tyr-arg (3), tyr-ala-glyphe-leu-arg (D-ala 3 leucine enkephalin-arg) (4), tyr-gly-phe-leu-NH 2 (leucine enkephalinamide) (5).

Монолитные капиллярные колонки с полистирольной основой N, N-диметилоктиламин 14

Электрохроматограмма кислотных и основных белков. Колонка - пористый стериновый монолит с диметилоктиламмониевой функцией; подвижная фаза 25% ацетонитрила в 5 ммоль/л фосфатном буфере p. H 3. 0 содержащим 50 ммоль/л хлорид натрия; обращенная полярность, электрокинетический ввод пробы 2 сек, 5 к. В. Пики: ангеотензин II (1), ангеотензин I (2), [Sar 1, Ala 8]-ангеотензин II (3), инсулин(4). Электрохроматограмма четырех основных белков, полученная в изократическом режиме. Для разделения использовалась колонка на основе полихлорметилстирольной основе. Колонка 47 см подвижная фаза 20% ацетонитрила в 20 ммоль/л фосфатном буфере p. H 2. 5; напряжение – 30 k. V; Пики: a-хемотрипсиноген (1), рибонуклеаза (2), цитохром. C (3), лизоцим(4). 15

Монолитные колонки на основе метакрилатов Реакция 1 Радикальное инициирование мономера и растущей полимерной церии, А – терминальная группа. Реакция 2 Мономерная радикальная полимеризация, перекрестное связывание с этилен диметилакрилатом. 16

Монолитные колонки на основе метакрилатов • Легко синтезируются • кварцевый капилляр может быть использован либо сразу, без выполнения каких-либо химических изменений его внутренней поверхности, либо после модификации; • не столь высокие требования к чистоте исходных соединений; 17 • окончательная полимеризационная смесь содержит свободные радикальные инициаторы, обеспечивающие ее стабильность и легкость обработки в течение нескольких часов при комнатной температуре или в течение нескольких дней в холодильнике без риска самопроизвольной полимеризации.

Электрохроматографическое разделение Gly-Tyr (1), Val-Tyr-Val (2), метионин 18 энкефалин (3) и лейцин энкефалин (4) на монолитной капиллярной колонке 100 мкм× 28 см с размерами пор ~ 492 нм. Подвижная фаза (1: 9, по объему) 80% 10 м. М 1 -октансульфоната натрия / 5 м. М фосфатного буфера, p. H = 7. 0, и 20% ацетонитрила.

Схема приготовления монолитных капиллярных колонок Пустой капилляр Силанизация поверхности капилляра Силанизированный капилляр Полимеризация Термоинициация УФ-инициация Монолитная капиллярная колонка Постфункционализация 19 Постфункционализированная монолитная капиллярная колонка

Силанизация Реакция силанизации необходима для увеличения смачиваемости поверхности капилляра раствором мономера с последующей иммобилизацией к ней полимерного сорбента 20

Синтез монолитной основы (на примере метакрилатной основы) Глицидилметакрилат AIBN 3 ч при 65 ºС, 16 ч при 78 ºС Порогенный растворитель Метилметакрилат O O 10% пропанола-1 50% формамида O O Этиленгликольдиметакрилат 21 Фотография получена на лазерном микроскопе Leica TCS SL

Постфункционализация 8 ч 70 70 8 ч приприºС ºС • создание электроосмотического потока; • обеспечение электрохроматографического разделения компонентов пробы 22

PLOT-колонки В процессе травления используется аммония гидродифторид (NH 4 HF 2) 23

PLOT-дендримерные 3 1 2 4 Электрохроматограмма смеси стандартов белков (1 мг/мл). Рабочий буфер: 10 м. М раствор H 3 PO 4, , 30% СН 3 СN; 10 к. В. УФ детектирование: 214 нм. Альбумин (1), инсулин (2), миоглобин (3), лизоцим (4). 24

PLOT – модифицированные С 18 Хроматограмма смеси полициклических ароматических углеводородов 25

Золь-гель техника Гидролиз; Преимущества: конденсация или высокоя стабильность поликонденсация золь большая емкость гель предшественников; большая эффективность колонки заполнение капилляра большая площадь поверхности золем; выдерживание; высушивание капилляра. более эффективное удерживаемость относительно простой процедуре приготовления 26

Сравнительные хроматограммы С 8 (А)и золь-гель (В)колонок. Капилляр: 10 мкм, 48 см, рабочее напряжение 30 к. В. П. ф. – метанол/1 м. М ФБР (p. H 7), 0, 5% триэтиламин. 1 - Фенол, 2 - толуол, 3 - нафталин, 4 – бифенил. 27

PLOT – с полиэлектолитным многослоем 28

PLOT – с полиэлектолитным многослоем Pol+ Pol-м + Na+водн Cl-водн↔Pol+Cl-м + Pol-Na+м 29

Спасибо за внимание! 30