Основы генной инженерии и биотехнологии Лекция 4 Технологии

Основы генной инженерии и биотехнологии Лекция 4 Технологии антисмысловых последовательностей Нуклеиновые кислоты как ферменты

Использование нуклеиновых кислот для изменения экспрессии генов в эукариотических клетках

Сферы применения синтетических олигонуклеотидов

Механизмы подавления трансляции антисмысловыми олигодезоксирибонуклеотидами (ODN) Трансляция в норме ODN Разрушение РНКазой H Блок инициации Блок элонгации

Гидролитическое дезаминирование аденозина с образованием инозина аденозиндезаминазой ADAR (Adenosine Deaminase that Acts on RNA) A: T I : C, A, T Инозин в м. РНК распознается системой трансляции как гуанозин и его введение в м. РНК сопровождается миссенс- (но не нонсенс-) мутациями

Метаболизм ds. РНК с участием аденозиндезаминазы ADAR Субстраты для ADAR Неспецифическое Специфическое Редактирование ds. РНК Перенос в цитоплазму Замена АК 25 -30 Оптимум: >100 п. н.

Биогенез микро. РНК в клетках животных - ядро Около 1000 генов mi. RNA у человека Pol II – RNA polymerase II pri-mi. RNA – primary mi. RNA (200 -2000 nt) Drosha – RNAse III pre-mi. RNA (60 nt) Exp 5 – Exportin 5

Биогенез микро. РНК и подавление трансляции в клетках животных - цитоплазма Dicer – вторая РНКаза III RISC – RNA induced silencing complex

Короткие интерферирующие РНК (si. RNA)

Микро-РНК (mi. RNA) и короткие интерферирующие РНК (si. RNA) могут использовать один и тот же механизм для осуществления сайленсинга генов Предшественник микро (mi)РНК Двухцепочечная (ds) РНК – предшественник si. РНК Dicer Малая ds. РНК mi. РНК или si. РНК

Некоторые свойства антисмысловых олигодезоксирибонуклеотидов (ODN) v. Механизм проникновения в клетку напоминает эндоцитоз, опосредованный рецепторами v. Высокие действующие концентрации v. Низкая внутриклеточная стабильность (время полужизни в ооцитах ~20 мин. vгапмеры (gapmer) – ODN, построенные из аналогов нуклеотидов v. Отсутствие иммунного ответа

ODN первого поколения ISIS 2302 20 -звенная молекула, завершены клинические испытания при язвенных колитах, мишень ICAM-1 m. RNA, аппликация через клизму, остановка кровотечений, восстановление слизистой fomivirsen – 1998 – против цитомегаловирусов ODN второго поколения: гапмеры (gapmer) По всей длине фосфоротиоатные связи, на 3’- и 5’концах 2’-модифицированные нуклеотиды phosphorothioate 2‘-O-methyl 2‘-O-methoxyethyl

Модификации на основе бициклических сахаров ENA - ethylene-bridged nucleic acid LNA - locked nucleic acid Oxetane-modified ribose Фиксируют конформацию сахара, усиливая термодинамическую стабильность ДНК-дуплексов

Антисмысловые мофолино- (morpholino) ODN Высокоустойчивы к нуклеазам Высокоспецифичны 6 -звенное морфолиновое кольцо вместо рибозы Эффективны в понижении экспрессии генов in vivo Используются для получения генных нокдаунов Фосфородиамидитная связь вместо фосфодиэфирной связи Электронейтральная молекула

Пептидо-нуклеиновые кислоты (ПНК) Peptide nucleic acids (PNAs) ПНК Ахиральный электронейтральный псевдопептидный (полиамидный) остов ПНК ДНК Сахаро-фосфатный остов ДНК, построенный на основе фосфодиэфирных связей

Комплементарные взаимодействия между ПНК и ДНК

Применение пептидо-нуклеиновых кислот v. Антисмысловые и анти-генные стратегии мишени – м. РНК (AUG-кодоны) и ds. ДНК (триплексы), антимикробные агенты (мишень – 23 S РНК) v. Доставка лекарств и радиоизотопов к генам v. Гибридизация с нуклеиновыми кислотами Не могут быть праймерами в ПЦР, флуоресцентно-меченые зонды для гибридизации in situ, MALDI-TOF масс-спектрометрия, биочипы на основе ПНК v. Аффинное выделение нуклеиновых кислот

Механизм образования тройных спиралей ДНК триплекс-формирующими олигонуклеотидами (TFO) Хугстиновские связи

Трехмерная модель трехцепочечного участка ДНК, образованного триплекс-формирующим олигонуклеотидом (TFO) Молекула псоралена Цепь, обогащенная пуринами TFO 5’→ 3’ Цепь, обогащенная пиримидинами

Условия образования и свойства TFO v. Взаимодействуют с гомопуриновой цепью ДНК по большой бороздке v. Могут содержать в себе как пуриновый, так и пиримидиновый мотивы v. У пиримидиновых TFO (T·A: T) в парах C·G: C остаток C должен быть протонирован по N 3 (что происходит только при низких значениях p. H) v. Пуриновые TFO, а именно: A·A: T и G·G: C образуются независимо от p. H окружающей среды v. Для TFO характерна высокая специфичность: 16 -звенный TFO взаимодействует с одним уникальным сайтом на 109 т. о. v. TFO стабилизируются ионами Mg 2+, Ca 2+ и полиаминами

Использование триплекс-образующих нуклеотидов в молекулярной генетике Псорален – природный фурокумарин Ковалентное взаимодействие c T

ДНК-аптамер ARC 1172 в комплексе с доменом A 1 фактора фон Виллебранда

Глобальный рынок аптамеров медицинского назначения (млн $)

Лиганды аптамеров

Сравнение размеров молекул антитела и нуклеотидного аптамера 17 nt

Области современного применения аптамеров

Схема отбора олигонуклеотидных аптамеров из комбинаторной библиотеки Хроматография Капиллярный электрофорез

Автоматизированная система отбора аптамеров RNA-SELEX

РНК-аптамер, взаимодействующий с AMP 36 nt Контакты преимущественно с кольцом аденина, но не рибозой. Может связывать ATP, NAD

РНК-аптамер, взаимодействующий с GTP Лиганд погружен в связывающий карман КD ~75 n. M 41 nt Обнаруживает много третичных взаимодействий, объясняющих высокое сродство аптамера к лиганду

РНК-аптамер, взаимодействующий с витамином B 12 Лиганд взаимодействует с периферией аптамера 35 nt

РНК-аптамер, взаимодействующий с FMN погружен в ДНК и образует водородные связи по границе изоаллоксазинового кольца 35 nt

Зеркальные аптамеры- шпигельмеры (Spiegelmer) L-Рибоза или L-2’-дезоксирибоза в сахаро-фосфатном остове Получение: 1) Обычный отбор среди обычных нуклеиновых кислот с Dсахарами. Лиганды – полипептиды, построенные из неприродных D-изомеров аминокислотных остатков. 2) После определения первичной структуры – химический синтез из аналогов нуклеотидов, содержащих L-сахара. Синтезированные шпигельмеры взаимодействуют с природными белками Преимущество перед обычными аптамерами: Устойчивость к нуклеазам

Технология получения шпигельмеров

Биосенсоры на основе олигонуклеотидных аптамеров Биосенсоры – молекулярные устройства, количественно преобразующие сигнал от внешних воздействий в измеримый сигнал другой природы Аптамеры биконы ATP Конъюгаты с наночастицам и золота GNP – Gold Nanoparticles (Au-NP) - наночастицы золота

Модификации аптамеров

Рибозимы и дезоксирибозимы

Thomas Cech – первооткрыватель рибозимов 1982 г. Аутосплайсинг интрона рибосомной 35 S-РНК жгутикового простейшего Tetrahymena Нобелевская премия по химии 1989 г. совместно с Sidney Altman

Сидни Олтман (Sidney Altman) получает Нобелевскую премию за РНКазу P

Каталитический цикл рибозима Данные кинетического и рентгеноструктурного анализа РНК-субстрат (S) Рибозим (E) Ферментсубстратный комплекс (E-S) Продукт P 2 5’-OH-конец E-P 2 Продукт P 1 2’-3’-циклический концевой фосфат Комплекс фермент-продукт (E-P 1 -P 2) Mg 2+ Комплекс (в переходном состоянии

5’ Биотинилированный праймер 3’ Схема отбора in vitro дезоксирибозима, обладающего РНКазной активностью B - биотин r. A – AMP (рибонукдеозидмонофосфат) Фолдинг оц. ДНК Гидролиз субстрата Нерасщепленную оц. ДНК отбрасывают

ДНКзимы, обладающие РНКазной активностью Субстрат РНК

Подтипы рибозимов, сконструированных на основе рибозима типа «головки молотка» РНК (субстрат) Рибозим типа «головки молотка» Минизим Максизим ДНКзим

Сборка активного максизима

Подавление репликации HIV гетеродимерным максизимом

Подавление репликации HIV гетеродимерным максизимом (окончание)

Аллостерический рибозим (аптазим) и его пространственная структура Место расщепления РНК Связывание ATP ингибирует рибозим

Некоторые реакции, осуществляемые дезоксирибозимами Реакция Связь Ускор Гидролиз РНК O-P 108 Реакция Diels-Alder С-С 4× 105 Лигирование РНК (3’ 5’) O-P 105 Депуринизация ДНК С-N Лигирование РНК (ветвление) O-P 5× 106 Окислительный разрыв ДНК C-O 106 Лигирование РНК (петля) O-P 105 Фотореактивация тиминовых димеров С-С 3× 104 Фосфорилирование ДНК O-P 109 Гидролиз фосфорамидата N-P 103 Аденилирование ДНК O-P 2× 1010 Введение металлов в порфирины Лигирование ДНК O-P 105 Нуклеопептидная связь Cu-N 103 O-P 5× 105

ДНК в наноконструкторе

Примеры неканонических ветвящихся структур ДНК Концы стрелок соответствуют 3’-концам молекул ДНК

Образование двумерных решеток из стабильных конструкций с липкими концами

Топологические последствия лигирования молекул ДНК, содержащих четное и нечетное число полувитков на границах ячеек Нечетное Кольцевые ковалентно замкнутые молекулы ДНК Четное Линейные молекулы ДНК

Сложные ДНКоригами оц. ДНК фага M 13 (7240 nt) смешивали с 250 олигонуклеотидами-помощниками (32 nt) и охлаждали 2 ч до 20 о. С

Куб как сумма линейных катенанов ДНК Линейные тройные катенаны ДНК (в центре рисунка) спонтанно собираются с образованием куба (слева)

Усеченный октаэдр, построенный из ДНК Фигура построена из 14 кольцевых молекул оц. ДНК. Цветные точки – сахаро-фосфатный остов ДНК, белые точки – азотистые основания. Вид сверху.