Основные задачи решаемые лабораторией клеточных технологий и принципы

Основные задачи, решаемые лабораторией клеточных технологий, и принципы ее организации Руководитель отдела научно-исследовательских биотехнологий компании «Адвенсум» Никоненко Татьяна Александровна, к. б. н.

Основные задачи, решаемые клеточной лабораторией Культивирование клеток - метод, позволяющий сохранять жизнеспособность клетки и выращивать клетки, ткани, небольшие органы (или их части) животного, включая человека, или растения вне организма на/в питательной среде. Культура клеток представляет собой гомогенную популяцию генетически однородных клеток, растущих в постоянных условиях.

Основные задачи, решаемые клеточной лабораторией Получение первичной культуры клеток Первичная культура клеток клетки, получаемые из тканей или биологических жидкостей животного/человека и поддерживаемые в культуре до первого субкультивирования (пересева). Первичная культура кардиомиоцитов неонатальных крыс.

Основные задачи, решаемые клеточной лабораторией Первичная культура клеток. • На I этапе получения первичной культуры происходит стерильное удаление фрагмента ткани животного и его механическая или ферментативная (трипсином или коллагеназой) дезинтеграция. • Мелкие кусочки прикрепляются к поверхности чашки благодаря собственной адгезивности, наличию насечек на чашке или с помощью сгустка плазмы. • В этих случаях будет происходить рост клеток из фрагментов, и клетки, мигрирующие из эксплантатов, могут использоваться для пассирования. (Таким образом, например, можно получать культуру клеток дермы - фибробластов. ) • Клетки образующейся при этом суспензии оседают, прикрепляются и распластываются на поверхности стекла или пластика.

Основные задачи, решаемые клеточной лабораторией Первичная культура клеток. Прикрепление к субстрату • • • Большинство клеток млекопитающих могут расти только будучи прикреплёнными к субстрату: к другим клеткам (т. н. клеткам фидерного слоя), к различным матриксам (коллагену, ламинину, фибронектину и т. п. ), к стеклу или к пластику. Хотя для определенных целей используют также культивирование клеточной суспензии. Прикрепление клетки к субстрату.

Основные задачи, решаемые клеточной лабораторией Субкультивирование первичной культуры. После того, как первичная культура достигнет состояния монослоя, она может быть перенесена во второй культуральный сосуд после диссоциации клеток монослоя трипсином и разведения - т. е. пересеяна или субкультивирована. Для суспензионных культур в случае субкультивирования достаточно только разведения. Процесс образования монослоя можно наблюдать в инвертированный микроскоп.

Основные задачи, решаемые клеточной лабораторией Рассев и кормление клеточной культуры. Как определить, что клеточную культуру пора рассевать? • клетки образуют плотный монослой • индикаторный краситель Phenol Red (феноловый красный)меняет цвет с ярко-красного в свежей среде до желто-оранжевого в среде с культивируемыми в течение некоторого времени клетками

Основные задачи, решаемые клеточной лабораторией Пересев и оценка жизнеспособности клеточной культуры. • В процессе пересева после трипсинизации можно оценить состояние клеточной культуры: подсчитать общее количество клеток, и в их числе мертвые и живые клетки. • Для этих целей существует простой метод подсчета клеток в гемоцитометре (камере Горяева) или в автоматизированных счетчиках клеток. • Принцип подсчета: в клеточную суспензию добавляют равный объем 0, 1%-ного трипанового синего - он окрашивает только мертвые клетки.

Основные задачи, решаемые клеточной лабораторией Создание клеточных линий - ограниченных и постоянных • Клеточная линия - культура однородных клеток, обладающих определенными и относительно постоянными свойствами и характеристиками. • Ограниченные клеточные линии живут определённое количество пассажей, а потом культура отмирает. • Ограниченная клеточная линия может также "трансформироваться " и превращаться в постоянную клеточную линию. • Пока неясно, возникают стволовые клетки постоянной культуры в ходе пассирования или они предсуществуют в замаскированной форме в популяции клеток ограниченной линии. Также можно предположить мутационную природу их появления (хромосомные перестройки, траслокации, частичное или полное неспаривание или точечные мутации).

Основные задачи, решаемые клеточной лабораторией Трансформация и дифференцировка клеточной культуры. Перерождение клеток характеризуется следующими особенностями: • • • морфологическими изменениями (мельчание или укрупнение, уменьшение адгезивной способности, увеличение ядра); укорочением клеточного цикла (время удвоения уменьшается до 12 часов, обычно 36 - 48); уменьшением зависимости клеток от добавления сыворотки; нетребовательностью к качеству субстрата; увеличением потенции к образованию опухолей. Среди множества трансформированных клеточных линий одной из самых известных является He. La.

Основные задачи, решаемые клеточной лабораторией Транспортировка и хранение клеточной культуры. • • Незамороженые клетки можно транспортировать в виде монослоя либо в сосуде, содержащем лишь следы культуральной среды, либо в сосуде, полностью наполненном средой. Сосуды должны быть прочно закупорены во избежание испарения среды, и внешняя температура при транспортировке не должна выходить из диапазона 10 -37 С. Этот метод транспортировки пригоден только для небольших расстояний. Для транспортировки на большие расстояния культуры клеток замораживают в жидком азоте, а транспортируют их замороженными в твердой углекислоте. Поскольку клетки обладают низкой жизнеспособностью при температуре сухого льда, то сразу после получения их следует использовать или перезаморозить в жидком азоте. Хранение клеточных культур в осуществляется в жидком азоте в специальных емкостях - сосудах Дьюара.

Основные этапы работы в клеточной лаборатории I Работа в клеточной лаборатории состоит из следующих основных этапов Забор крови, тканей, костного мозга, биологических жидкостей II Выделение, культивирование, дифференцировка клеток III IV Замораживание, хранение и витрификация клеточных культур Научные исследования в области генетики, иммунологии, протеомики, физиологии, эмбриологии

Культуральный бокс – основная единица организации пространства клеточной лаборатории Боксовое помещение представляет собой: 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. изолированную комнату; с несорбирующими пыль моющимися покрытиями; имеющую предбоксник; обеспеченную необходимым общим и специальным освещением; системами приточной и вытяжной вентиляции; холодным и горячим водоснабжением; подводами газов и сжатого воздуха.

Схема организации помещения культурального бокса 1 2 3 4 5 6 1 - ламинар II класса биологической безопасности 2 - СО 2 -инкубатор 3 - шкаф с посудой и пластиком для культуральных работ 4 - стол с инвертированным световым микроскопом 5 - холодильник с культуральными средами и реагентами для клеточных работ 6 - предбоксник с рабочей одеждой

Организация пространства клеточной лаборатории Ламинарный шкаф • • Функции: Обеспечение стерильности и предотвращение контаминации при работе с клеточными культурами • 1. Включение/ выключение потока воздуха. 2. Включение/ выключение света или ультрафиолета. 3. Регулировка скорости потока стерильного воздуха с задней стенки ламинара. 4. Лампа дневного света и ультрафиолетовая лампа. 5. Задняя стенка с фильтром, через которую осуществляется подача стерильного воздуха (поток стерильного воздуха идет в лицо работающему). 6. Стол ламинара с металлической поверхностью (протирается перед работой спиртом, на ночь включается ультрафиолетовая лампа). • • •

Организация пространства клеточной лаборатории СО 2 инкубатор • • • 1 - двойная дверь, 2 - панель управления подачей СО 2 3 - многофункциональное цифровое табло 4 - ручка переключения регулируемых параметров 5 - панель управления регулируемыми параметрами (температура); Cтрелка указывает на баллоны с СО 2. Функции: поддержание влажности (внутрь инкубатора ставится емкость с водой с обеззараживающими добавками, например медным купоросом) Поддержание уровня СО 2 При выращивании клеток в посуде типа чашек Петри и пластиковых планшетов клеткам необходим 5 5% содержание СО 2. Поддержание температурного режима (37 градусов Цельсия) • •

Организация пространства клеточной лаборатории Микроскоп инвертированный - это оптический микроскоп, у которого объектив располагается под наблюдаемым предметом, а конденсор - сверху. Такой микроскоп позволяет рассматривать объект снизу. В биологии и медицине с помощью таких микроскопов изучают культуры клеток, прикрепленные ко дну культуральной посуды. Инвepтиpoвaнныe микpocкoпы идeaльны для caмoгo шиpoкoгo pядa иccлeдoвaний: в физиoлoгии,

Новое в организации пространства клеточной лаборатории - автоматизированные системы для наращивания клеточных линий Соединяют в себе функционал ламинарного шкафа + инкубатора + микроскопа для наращивания клеточных культур в автоматическом режиме Автоматизирует • одновременное наращивание нескольких десятков клеточных линий с разными протоколами культивирования, для исследований и скрининга • наращивание аутологических клеточных продуктов от нескольких десятков пациентов • пересев и сбор клеток в асептических условиях без риска перезаражения • транзиторную трансфекцию • одновременную инкубацию нескольких сотен культуральных планшетов / флаконов • подсчет количества и жизнеспособности клеток • работу с многослойными флаконами • рассев клеток в планшеты для последующего скрининга Востребованы: • • • в сложных программах культивирования клеточных линий в онкологических программах, при исследовании стволовых клеток, при изучении токсичности разрабатываемых фармпрепаратов (преклинические испытания) в наработке клинического материала при проведении III фазы клинических исследований в коммерческом производстве аутологических продуктов клеточной терапии

Основные этапы работы в клеточной лаборатории I Работа в клеточной лаборатории состоит из следующих основных этапов Забор крови, тканей, костного мозга, биологических жидкостей II Выделение, культивирование, дифференцировка клеток III IV Замораживание, хранение и витрификация клеточных культур Научные исследования в области генетики, иммунологии, протеомики, физиологии, эмбриологии

Оборудование для оснащения клеточных лабораторий ЭТАП I – забор материала и пробоподготовка Системы забора крови Гомогенизаторы тканей Центрифуги Холодильники Стерилизаторы Фильтрационные системы

Оборудование для оснащения клеточных лабораторий ЭТАП II – выделение, рассев, дифференцировка, наращивание первичных культур и линий клеток Ламинарные шкафы (II класса биологической защиты ) СО 2 инкубаторы Холодильники Центрифуги ультрацентрифуги Инвертированные микроскопы Счетчики клеток Культуральный пластик, среды, расходные материалы Автоматизированные системы для выделения/ наращивания клеток

Оборудование для оснащения клеточных лабораторий ЭТАП III – научные исследования Системы наблюдения за живыми клетками в культуре Микроскопы исследовательского класса с манипуляторами Системы сверхточной лазерной микродиссекции Программнотехнические комплексы для автоматизации научных исследований в области генетики

Оборудование для оснащения клеточных лабораторий ЭТАП IV – замораживание и хранение Криозамораживатели Криохранилища Сосуды Дьюара Морозильники низкотемпературные

Оборудование для оснащения клеточных лабораторий ЭТАП III – научные исследования Программно-технические комплексы для автоматизации научных исследований биологических объектов в области генетики Выполняют задачи • автоматического выделения ДНК/РНК из различных образцов • проведения оценки качества образцов нуклеиновых кислот • проведения ПЦР • изучения генетических полиморфизмов • генетической трансформации и изучения функций генов • снятия изображений и анализа данных

Оборудование для оснащения клеточных лабораторий ЭТАП III – научные исследования Цитометр Ny. ONE и Cellavista (Synentec Gmb. H, Германия) Возможности применения: • Клонирование единичной клетки • Анализ слияния • Подсчет клеток • Анализ клеточной пролиферации • Тест на жизнеспособность клеток • Оптимизация культуральной среды • Эффективность трансфекции • Определение CD маркеров, антител, секреции клетки Используется для проведения научных и скрининговых исследований : в научно-исследовательских лабораториях (стволовых клеток, онкологии, токсикологии) в лабораториях клеточной терапии в лабораториях онкологических клиник ( при создании противоопухолевых дендритных вакцин) в лабораториях ЭКО (контроль развития эмбрионов) в лабораториях регенеративной медицины в фармакологических лабораториях.

Оборудование для оснащения клеточных лабораторий ЭТАП III – научные исследования Цитометры JULI BR и JULI FL (Nano. En. Tek, Корея) Формат расходных материалов – слайды-камеры Возможности применения: • Визуализация живых клеток • Мониторинг роста клеток • Анализ клеточной миграции, слияния клеток • Контроль качества клеточной культуры • Развитие стволовых клеток • Оптимизация культуральной среды • Эффективность трансфекции • Все тесты проводятся in vivo • Целевая аудитория: научно-исследовательские лаборатории клеточной терапии лаборатории онкологических клиник токсикологические лаборатории

ЭТАП IV – замораживание и хранение Приборы для криоконсервации и криохранения. -- Программные замораживатели -- Клеточные криохранилища с функцией программного замораживания клеточного материала -- Автоматизированные хранилища биоматериала и проб нуклеиновых кислот (до -80 о. С) (Brooks/) -- Низкотемпературные холодильники для хранения биологического материала, (до -80 о. С) - Аппарат для подготовки стволовых клеток к криоконсервации Coolmix Расходные материалы - контейнеры для обработки и хранения замороженного клеточного материала Целевая аудитория: Клеточные лаборатории клеточной (аутологической/ донорской) терапии; клиники регенеративной медицины банки пуповинной крови; клеточные банки.

ЭТАП IV – замораживание и хранение Низкотемпературные хранилища Brooks Biostore II (-80°C). Brooks ‐ 80°C Bio. Store II — это автономная, полностью автоматизированная система хранения и извлечения образцов, способная поддерживать температуру биоматериала на заданном уровне в течение всего срока хранения. Система предназначена для хранения: -тканей, -плазмы, -сыворотки, -цельной крови, -нуклеиновых кислот, -фармсубстанций. Хранилище модульного типа вмещает от 1, 5 до 5, 5 млн. пробирок объемом 0, 5 мл. Целевая аудитория: -биобанки

Регенерация миокарда Пример актуального исследования, проводимого в клеточной лаборатории Клеточные процессы, связанные с регенерацией миокарда, долгое время считались невозможными. Однако недавно было установлено, что во всех возрастных периодах сердце содержит пул делящихся малодифференцированных клеток - предшественников кардиомиоцитов. В терминальной стадии ХСН, а также при острых состояниях миокарда, например при инфаркте, количество таких клеток значительно увеличивается. Эти клетки были названы резидентными кардиальными прогениторными клетками и охарактеризованы по экспрессируемым маркерным белкам.

Резидентные прогениторы кардиомиоцитов в эндомиокардиальном биоптате пациента с дилатационной кардиомиопатией. C-kit- маркер стволовых клеток наложение c-kit и Nkx 2. 5 (локализация на мембране) Nkx 2. 5 – маркер ранней окрашивание на DAPIдифференцировки кардиомиоцитов локализация клеточного ядра (локализация внутри ядра)

Регенерация миокарда Пример актуального исследования, проводимого в клеточной лаборатории Резидентные прогениторные клетки могут быть лучшими кандидатами для применения в клеточной терапии сердца, так как они являются тканеспецифичными, прекоммитированными и обладают большой способностью к дифференцировке. Получение резидентных прогениторов кардиомиоцитов из эндомиокардиальных биоптатов (ЭМБ) пациентов, их наращивание и дифференцировка в культуре дает возможность вводить эти клетки тем же пациентам, что поможет избежать побочных эффектов, связанных с использованием неаутологичных клеток. Дальнейшая дифференцировка этих клеток в зрелые кардиомиоциты могла бы привести к улучшению функциональных характеристик миокарда при развитии хронической сердечной недостаточности. (Фотографии были любезно предоставлены доктором О. В. Степановой, НИИКК, РКНПК, Москва. )

БЛАГОДАРЮ ЗА ВНИМАНИЕ! Руководитель отдела Научно-исследовательских биотехнологий Никоненко Татьяна Александровна, к. б. н.