ОСНОВНЫЕ ПРИНЦИПЫ ПИРОСЕКВЕНИРОВАНИЯ При изучении генетической

ОСНОВНЫЕ ПРИНЦИПЫ ПИРОСЕКВЕНИРОВАНИЯ

При изучении генетической предрасположенности к различным заболеваниям (бронхиальная астма, гипертония, инфаркт миокарда и др. ) объектом клинического исследования являются уже известные полиморфные участки в геноме человека (генетические полиморфизмы). Для детекции однонуклеотидных полиморфизмов используется широкий спектр молекулярно-биологических методов, основанных на ПЦР, в т. ч. и секвенирование

СЕКВЕНИРОВАНИЕ Секвенирование биополимеров (белков и нуклеиновых кислот — ДНК и РНК) — определение их первичной аминокислотной или нуклеотидной последовательности (от англ. sequence — последовательность). В результате получается линейное описание молекулы.

= пиросеквенирующий синтез = секвенирование путем синтеза Разработан Полом Нираном в Королевском техническом институте (Стокгольм, Швеция) в 1996 году. Основной принцип: в результате ферментативного превращения пирофосфата регистрируется хемолюминисцентный сигнал, а высвобождение пирофосфата происходит после встраивания необходимого нуклеотида

СХЕМА РЕАКЦИИ Прямой праймер для ПЦР ПИРОСЕКВЕНИРОВАНИЯ Биотинилированный праймер для ПЦР Уровень сигнала АТР Одноцепочечная ДНК матрицы биотинилированная Люциферин оксилюциферин АТР Время Свет детектируется спец камерой прибора Нуклеотидная последовательность Включение нуклеотидов

Наработка ампликона, содержащего изучаемый полиморфный генетический локус (выделение ДНК, ПЦР) При амплификации фрагмента ДНК один из праймеров должен быть связан с биотином 1. Прямой праймер для ПЦР Биотинилированный праймер для ПЦР

2. Пробоподготовка ампликона При помощи полуавтоматической вакуумнофильтрационной станции проводится денатурация ампликона и серия отмывок, в результате которых образуется одноцепочечный ДНК-фрагмент с биотином

Биотинилированная одноцепочечная ДНК Биотин Стрептавидин Продукт амплификации связывается с частицами сефарозы, покрытыми стрептавидином, для последующей очистки реакционной смеси Молекула сефарозы, покрытая стрептавидином

3. Добавление секвенирующего праймера, который отжигается в области анализируемого генетического локуса, образуя дуплекс ДНКматрица/секвенирующий праймер Секвенирующий праймер

1. К дуплексу ДНК-матрица/секвенирующий праймер добавляется смесь ферментов и смесь субстратов Ферменты: ДНК-полимераза, АТФсульфурилаза, люцифираза, апираза Субстраты: АТФ и люциферин

Свет детектируется специальной камерой пиросеквенатора и отбражается в виде пиков на графике (пирограмма). Высота пиков пропорциональна количеству нуклеотидов, встроившихся во вновь синтезированную, комплиментарную ДНКматрице, цепь ДНК