Орындаған Зулхарнаева І М Кенхан А Т Тексерген

Орындаған: Зулхарнаева І. М Кенхан А. Т. Тексерген: Алтыбаева Н. А

Жоспар: ПТР әдісінің негізі, тарихы ПТР-ды талдаудың кезеңдері A. Сынама материалынан ДНҚ-ны бөліп алу B. ДНҚ-на тән фрагментті амплификациялау C. Амплификация өнімдерін детекторлау. 1. ПТР шынайы уақытта. Қолданылған әдебиеттер тізімі

Полимеразалық тізбекті реакция (ПТР) – биологиялық сынамадағы нуклеин қышқылдарының белгілі-бір фрагментінің аз ғана концентрациясын көбейтуге мүмкіндік беретін молекулалық биологияның экспериментальдық әдісі. Яғни, бірнеше сағат ішінде ДНҚ- ның кез келген бөлшектерін миллиондаған дана күйінде көбейтуге мүмкіндік береді. ПТР ДНҚ-ны амплификациялауда ғана емес, сондай-ақ нуклеин қышқылдарымен әртүрлі манипуляция жасауға (мутацияға кіріспе, ДНҚ фрагменттерін көбейту және т. б. ) мүмкіндік береді және биологиялық медициналық практикада кеңінен қолданылады, мысалы, әртүрлі ауруларды анықтауда (тұқым қуалайтын, жұқпалы аурулар), әкелікті анықтау, гендерді клондауда, жаңа гендерді бөліп алуда кеңінен қолданылады. .

Муллис Кэри Бэнкс (Kary Banks Mullis, 28 желтоқсан 1944 жылы туған, Ленуар, Солтүстік Каролина, АҚШ) — американдық биохимик. Берклидегі Калифорния университетінде докторлық дәрежесін алды. 1983 жылы полимеразды тізбекті реакция әдісін әзірледі, ғалымдар оның көмегімен гендегі нуклеотидтердің тәртібін анықтады, ДНҚ үлгілері бойынша адамдардың ұқсастығы үшін генді дактилосткопияны қолданды, эволюция мен медициналық диагноз қоюды зерттеді. Атақ әкелген зерттеулерін Муллис Cetus корпорациясында өткізді, кейінірек еркін кеңесші болды. 1993 жылы Нобель сыйлығын Майкл Смитпен (1932 жылы туылған) бөлісті. Муллис өзінің еркін жеке стилімен, пікірімен және мақалаларымен танымал, мақалаларында беделді адамдармен санаспайды, мәселен, Dancing Naked in the Mind Field ( «Танцующий обнаженным в поле разума» , 1998) еңбегі.

ПТР әдісі белгілі ДНҚ фрагментін in vitro жағдайында ферменттердің қатысуымен бірнеше қайтара таңдамалы түрде көшіруге негізделген. ПТР зерттеушіге қажетті талаптарға сайкес келетін ДНҚ бөліктері зерттеліп отырған материалда болса ғана жүзеге асады. ПТР тірі организмдерде жүзеге асатын ДНҚ амплификациясынан (репликация) ерекшелігі ДНҚ-ның қысқа тізбекті үзінділері көшіріледі. Қалыпты ПТР-процессінде ДНҚ үзінділерінің ұзындығы 3000 жұп нуклеотидті құрайды. Әртүрлі полимеразалық қоспалардың көмегімен және әртүрлі қоспалардың көмегімен белгілі бір жағдайларда ПТР-фрагменттерінің ұзындығы 20 -40 мың жұп нуклеотидке дейін жетуі мүмкін.

Реакция компоненттері: • Амплификациялауға қажет ДНҚ фрагменті бар – ДНҚ марица; • Қажетті ДНҚ фрагментінің әртүрлі ұштарына комплементарлы – екі праймер; • Полимеразалық реакцияларды катализдейтін термотұрақты фермент – ДНҚполимераза; ПТР-ді жүзеге асыру үшін қажетті ДНҚ-полимераза жоғары температурада да өзінің активтілігін сақтап қалуы керек. ПТР-ге қажетті ДНҚ полимеразалар термофильді бактериалардан бөлініп алынған: Thermus aquaticus (Taqполимераза), Pyrococcus furiosus (Pfu-полимераза), Pyrococcus woesei (Pwoполимераза) және т. б. • Дезоксирибонуклеозидтрифосфаттар (d. ATP, d. GTP, d. CTP, d. TTP); • Полимеразаның жұмысына қажетті Mg 2+ ионы. • Реакцияға қажетті жағдайларды (р. Н, ерітіндінің иондық күші) қамтамасыз ететін – буфер ерітіндісі. Құрамында тұздар мен бұқаның қан сарысу альбумині болады. Сондай-ақ ПТР реакцияларының ингибиторлары ретінде пирофосфаттар қолданылуы мүмкін.

Лабораторяда ПТР-анализі үш кезеңнен тұрады: • Сынама материалынан ДНҚ-ны бөліп алу • ДНҚ-на тән фрагментті амплификациялау • Амплификация өнімдерін детекторлау.

1. ДНҚ бөліп алу Торшалық материалдың еруі ПТР реакциясын ингибирлейтін заттардан тазарту(полисахаридтер, майлар, белоктар және т. б) ПТР ингибиторларынан бос және ары қарай амплификацияға дайын таза ДНҚ препаратын алу

- ДНҚ-матрица - ДНҚ немесе бастапқы арнайы фрагменті бар бөлігі; - праймерлер - синтетикалық олигонуклеотидтер (16 -30 нуклеотидті жұптар), матрицалық ДНҚ-ның комплементарлық аумақтары, арасында бір ізділігі бар-нысана (ДНҚ арнайы фрагменті); - ДНҚ арнайы фрагменті және праймерлер, амплификация жүргізген кезде оларды таңдау маңызды рөл атқарады және талдаудың сапасына әсер етеді; - дезоксинуклеотидтрифосфаттар қоспасы (д. НТФ) – төрт д. НТФ қоспасынан тұрады, жаңа комплементарлық ДНҚ тізбегінің синтезі үшін материал болып табылады; - Taq-полимераза ферменті –жылуға тұрақты ДНҚ-полимераза, праимер тізбегінің ұзартылуын катализдейді кейін ары қарай ДНҚ синтездейтін нуклеотидті негіздер өсіп келе жатқан тізбекке жалғасып қосылады; - буфер-ерітінді, құрамында ПТР қолайлы жағдай жасайтын және р. Нтың тұрақты мәнімен аниондар және катиондардың концентрациясы.

2. ДНҚ-на тән фрагменттердің амплификациясы. Амплификацияның әрбір айналымы үш кезеңнен тұрады, әр түрлі температуралық тәртіптерде өтетін 1 кезең. ДНҚ денатурациясы (Екі иірілімнің тарамдалуы). 20 -40 с уақытта 93 -95 °С температурада болады. 2 кезең. Праимерлердің (күйдіру) қосылуы. ДНҚ-ның арнайы аумағы шекараларында қарама-қарсы тізбектерінде комплементарлық жалғасуы болады. Праимерлердің әрбір жұбы үшін күйдірудің өз температурасы бар, оның мәндері 50 -65 °С интервалда болады. Күйдірудің уақыты - 20 -60 с. 3 кезең. ДНК тізбегін салып бітіру. ДНҚ тізбегінің комплементарлық салып бітіру 5'-соңынан 3'-соңына тізбектерінің қарама-қарсы бағытқа праимерлердің қосылуының бөліктерінен басталады.

ДНҚ жаңа тізбектерін синтездеу үшін материал ретінде ерітіндіге қосылатын дезоксинуклеотидтрифосфаттар (д. НТФ) қолданылады. Синтез процесі ферментпен катализденеді – жылуға тұрақты ДНҚ-полимераза (Taqполимеразамен) және 70 -72 °С температурада өтеді. Синтездің өту уақыты - 20 -40 с. Ізделген ДНҚ фрагменттерінің сипаттамаларының көшірмелерінің саны жеткілікті болуы үшін амплификацияны 20 -40 айналымдардан өткізеді. Амплификацияның бірінші айналымында пайда болған ДНҚ-ның жаңа тізбектері екінші тізбекке матрица ретінде қызмет атқарады, сонымен қатар ампликон деп аталатын, ДНҚ-ның бастапқы арнайы фрагменті пайда болады. Амплификацияның келесі айналымдарында ампликондар жаңа тізбектердің синтез үшін матрица қызметін атқарады Осылайша, 2 n формуласы бойынша дайындалған ерітіндіде ампликондар жиналады, мұндағы n - амлификации айналымдардың саны. Сондықтан, егер бастапқы ерітіндіде тек қана бір ДНҚ-ның екі тізбекті молекула болса, 35 айналымдарда ерітіндіде теория тұрғысынан 30 млрд ампликон молекулалары жинақталуы тиіс. Агароздық гелде электрофорез әдісімен фрагментті көз мөлшерімен анықтауға осындай мөлшер жеткілікті.

Экспоненталық жинақтау өнім Амплификациялар

3. Амплификация өнімдерін детекторлау. Осы кезеңде оларды идентификациялау мақсатында ПТР өнімдерінің қоспасын талдау жүргізіледі. Әр түрлі әдістер қолданылады, соның ішінде: - агарозды гелдегі көлденең электрофорездің классикалық әдісі; - полиакриламидті гелдегі тік электрофорездің әдісі; - гибридизациондық зондтардың әдісі; - ПТР «шынайы уақытта » .

Агарозды гелдегі көлденең электрофорездің классикалық әдісі. Бүгінгі күнде ДНК молекулаларының мөлшері бойынша бөлінуіне негізделген электрофорездің әдісі кең қолданылады. Бұл үшін арнайы ДНҚ бояуы қосылған агарозды электрофорез буферінде балқытылғаннан кейін салқындатылған агарозды гель пластиналарын, мысалы бромды этидия, ДНҚ-ның қостізбекті фрагменттерімен мықты қосылыстар түзетін пластина дайындайды. Гелге құйған кезде тарақшалар көмегімен арнайы ұяшықтар жасайды, кейін оларға амплификация өнімдерін құяды. Гель пластинасын көлденең гелэлектрофорез арнайы аппаратына орналастырады және тұрақты кернеулер көзін қосады. Теріс оқталған ДНҚ гелде «минустан» « плюсқа» қозғала бастайды. Сонымен қатар ДНҚ-ның қысқа молекулалары тез қозғалады, ұзындарға қарағанда, ал бірдей мөлшердегі молекулалар бірдей жылдамдықпен қозғалады. Гелдегі ДНҚ қозғалыс жылдамдығына агароз концентрациясы, электр өрістерінің кернеуі, температура, электрофорез буферінің құрамы және аздаған дәрежеде ДНҚ құрамы ықпал етеді. 10 минуттан 1 сағатқа дейін жалғасатын электрофорез аяқталғаннан кейін, гелді ультракүлгін диапазонда (254 -310 нм) сәуле шығаратын трансиллюминатор сүзгішіне орналастырады. ДНҚ-ның 260 нм аумағындағы жұтатын ультракүлгін энергисы, бояғыш молекулаларына беріледі де көрінетін сары-қызыл спектр аумағында оларды флуоресценциялануға мәжбүрлейді, осыдан агарозды гелде амплификациялық қоспаның электрофорездік ажыратудан кейін, жарық беріп тұрған жолақтар түрінде оларды тіркеуге мүмкіндік береді

Агароздық гелдегі ПТР өнімдерін электрофорездік ажырату

Тік электрофорездің әдісі. Көлденең электрофорез әдісінен айырмашылығы, осы жағдайда агарозды гелдердің орнына полнафиламидті гелдер пайдаланылады, ал амплификация өнімдерін ажырату тік электрофорез үшін арнайы камерада жүргізіледі. Полиакриламидті гелдегі электрофорез агарозды электрофорезбен салыстырғанда бойынша ДНҚ әртүрлі мөлшерлерінің молекулаларын дәлдікпен бір нуклеотидке дейін танып білуге мүмкіндік беретін қабілеттілігі бар. Гибридизациондық зондтардың әдісі. Детекторлаудың электрофорездік әдісі бірнеше кемшіліктерден тұрады, негізінен нашар сезімталдығы, бір амликондағы түрлі ДНҚ анықтау бойынша шектелуі және нәтижелерді субъективті есептеуі. Баламасы ретінде детекцияның гибридизациондық сызба-нұсқасы ұсынылған. ДНҚ фрагменттерінің амплификациясы арнайы олигонуклеотидті зондтармен гибридизирлену (қостізбекті кешендер құрайды- «гибридтер» ) нәтижесінде, бұл сызба-нұсқа пайда болады. Осындай кешендерді колориметрикалық және флуориметрикалық тіркеуге болады. Тәжірибеде иммуноферментті талдауға қолданылатынға ұқсас, микропланшетті форматты және детекция жүйесін жиі қолданылады. Иммуноферментті детекция жүйесімен гибридизациондық зондтардың әдісінің сезімталдығы (күріш көлденең электрофорездің әдісінің сезімталдығымен салыстырғанда шамамен 100 есе артады

Детекции әдістерінің салыстырмалы сезімталдығы

ПТР «шынайы уақытта» . Соңғы уақытта амплификация өнімдерінде детектрленетін ДНҚ мөлшерін бағалау үшін ПТР «шынайы уақытта» деп белгілі әдіс қолданылады. Осы детекция әдісінің мәні, амплификация өнімдерінің жиналу кинетикасын қадағалауға мүмкіндік беретін арнайы реагенттер және аспапты қамтамасыз ету болып табылады. «Шынайы уақытта» ПТР іске асыру үшін бірнеше нұсқалар бар, оның бір мәні келесі болып табылады. Құрамында ерекше реактивтермен белгіленген нуклеотидтер бар реакциялық қоспаға гибридизациондық зондтарды енгізеді, тек қана бос күйінде флуоресценциялауға қабілетті. Күйдіру кезеңінде ішкі ампликондары бар аумақтардың зондтарының гибридизациясы болады. ДНҚ-ның синтез үрдісінде Taq -полимераза өзінің экзонуклеазды белсенділігі күшімен зондтарды бұзады, осыдан ерітіндіге белгіленген нуклеотидтер түседі де флуоресценциялану басталады. Арнайы детектормен оn-line тәртіпте флуоресценция қарқынын бекітеді, оның мөлшері амплификация өнімдеріне сәйкес келеді. Керісінше, егер гибридизация болмаса, онда зонд бүтін болып қалады және оның құрамындағы нуклеотидтер флуоресценцияланбайды. Үлгілерді зерттеген уақытта тәжірибенің әрбір топтамасы, амплификациялардың қойылымы бақылаулармен (ДНҚ-ның 10 есе ажырату) қатар жүреді. Зерттелетін үлгідегі және бақылау пробиркаларындағы реакциялық қоспалардағы пайда болған бос нуклеотидтердің кинетикаларын салыстыру ДНҚ бақылау препараттарында ажыратылған диапазонда үлгідегі ДНҚ жарты сандық мөлшерін бағалауға мүмкіндік береді.

амплификатор

Қолданылған әдебиеттер: Д. В Ребриков «ПЦР в реальном времени» Н. С Абилаев «молекулалық биология және гентика» Интернет желісі: http: //kzdocs. docdat. com/ сайтынан