Оптичні біосенсори Рачков О Е Biosensor це

Оптичні біосенсори Рачков О. Е.

Biosensor– це a compact analytical device що Біосенсор - is компактний аналітичний прилад, сполучає специфічний біологічний чутливий матеріал incorporating a biological or biologically-derived та фізичний перетворювач, який трансформує sensing element either integrated within or intimately біохімічний процес в електричний сигнал associated with a physical transducer. Electrons Ions Gases Heat Light Mass Species to be detected Sensitive layer Electronics Transducer Electrical signal

Classification of biosensors Electrical signal Interaction Bioselective Product Transducer membrane PC or recorder Analyte Catalytic Cells Tissues Enzymes Bio-mimics Optical Noncatalytic Antibodies Receptors Nucleic acids Acoustic Calorimetric Nanomechanical Electrochemical

Principles of the electrochemical transduction based on Glucose oxidase -D-Glucose + H 2 O + O 2 GOD D-glucono- -lactone + H 2 O 2 + 2 H + + 2 e - Gluconic acid residue + H+ I Amperometric electrodes p. H ISFETs (Potentiometric method) G Conductometric electrodes

Частота, Гц Спектр електромагнітних хвиль Довжина хвилі

Оптичні явища, на яких базуються оптичні біосенсори A – відбиття (reflection), B – заломлення (refraction), C – поглинання (absorption), D – випромінювання (emission)

Питання 1 Які біосенсори називають оптичними? На яких оптичних явищах можуть базуватися оптичні біосенсори?

Оптичні біосенсори 1. Поглинання світла 2. Люмінесценція (випромінювання) 3. Поверхневий плазмонний резонанс (заломлення і відбиття)

I 0 I Джерело світла Зразок Закон Ламберта-Бугера-Бера A = – lg (I/I 0 ) = C l Детектор

Схема будови спектрофотометричних біосенсорів (a) Instrumental setup. (b) Optical fiber probe for layered biosensor: 1 - threaded retainer, 2 - sealing rings, 3 - biosensing layers (left to right: immobilized enzyme membrane, indicator sol–gel film, supporting glass disk), 4 - probe tip, 5 - multi-element optical fiber David J. Monk, David R. Walt Anal Bioanal Chem (2004) 379: 931– 945

The extinction coefficients (ε) of gold nanoparticles with different core sizes and capping ligands

Спектрофотометричний нанобіосенсор на основі наночастинок золота

Переваги Стійкість до електричних та електромагнітних перешкод Завдяки низьким втратам при передачі сигналу по оптичним волокнам можливо спостерігати за процесом на великій відстані Недоліки Обмежений динамічний діапазон – звичайно 102 у порівнянні 106 – 1012 для деяких електрохімічних сенсорів В зв’язку з прямою залежністю сигналу від довжини пробігу світла через зразок (Закон Ламберта-Бугера-Бера) обмеження мініатюризації сенсора

Питання 2 Закон Ламберта-Бугера-Бера. Поясніть, які фактори і як саме можуть впливати на величину відгуку спектрофотометричного сенсора.

Оптичні біосенсори 1. Поглинання світла 2. Люмінесценція (випромінювання) 3. Поверхневий плазмонний резонанс (заломлення і відбиття)

Спектр флуоресценції у порівнянні зі спектром світла, що її збуджує, характеризується більш низькою енергією і, відповідно, більшою довжиною хвиль. Різниця між максимумами піка збудження та піка випромінювання називається зсувом Стокса.

Схеми вимірювання поглинання світла Джерело світла Детектор Зразок флуоресценції Детектор

Detection format using fluorophores Schematic description of DNA sequence detection by means of a DNA chip array technique. (a) DNA probes immobilized on chip. (b) Hybridization of tagged sample (black spheres represent the tag, usually biotin). (c) Detection by mostly optical recognition of the tag (yellow spheres represent the fluorophore). Schematic description of a ‘sandwich’ immunoassay: (a) antibody is immobilized on a support; (b) analyte is caught bythe antibody; (c) analyte is detected with a second labelled antibody.

Fiber Optic Biosensor with Free Intercalating Dye

Використання органічних флуорофорів Переваги Стійкість до електричних та електромагнітних перешкод Висока чутливість Недоліки Photobleaching – поступове вицвітання, втрата флуорофором здатності до випромінювання світла В більшості випадків процедура введення флуоресцентної мітки вимагає часу, кваліфікації та коштів

Спектр флуоресценції Cd. Se QDs залежить від їх розміру.

Поглинання та випромінювання світла Квантовими точками

Photostability of Qdots a Comparison of the staining efficiency of Annexin V functionalized Qdots (staining achieved in one step using 2 n. M of Qdots and 4 n. M of biotinylated Annexin V, red), FITC-Annexin V (0. 5% v/v, green) and Alexa Fluor 647 -Annexin V (0. 5% v/v, pink). b (a) Light microscope pictures and pictures taken at T = 0, 500, 1000, 1500 s. (b) Intensity variation as a function of time for the three staining agents conjugated to Annexin V, FITC, Alexa Fluor 647 and Qdots. Intensity values expressed as relative values I/I 0, where I 0 is the intensity measured at the first irradiation of the sample

Порівняння розмірів QDs та деяких білків X. Michalet, F. F. Pinaud, L. A. Bentolila et al. , “Quantum dots for live cells, in vivo imaging, and diagnostics, ” Science (2005) 307, pp. 538– 544

Förster

Glutamate nanosensor (a) Model of the glutamate sensor, as displayed on the cell surface. The two lobes of the glutamate-binding protein YBEJ are shown in green, with glutamate (red) in the central binding pocket. The fluorescent proteins ECFP (blue) and Venus (yellow) are fused to one of the lobes. Upon binding glutamate the two lobes close relative to each other, which alters the FRET efficiency between the two fluorescent proteins and signals that binding has occurred. (b) Model of the linear gene-fusion of YBEJ, flanked by the two fluorescent proteins and locations of the leader and transmembrane domain sequences. (c) Confocal image of hippocampal neurons expressing the 600 n. M affinity surface-localized glutamate nanosensor. The fluorescence is highest at the plasma membrane. (d) Hippocampal cells counterstained with FM-64 (red) to show the locations of synapses.

Питання 3 Що таке люмінесценція? Що її може викликати? Види люмінесценції.

Питання 4 Поясніть (зі схемою), що таке FRET.

Питання 5 Назвіть основні переваги та недоліки використання органічних флуорофорів та напівпровідникових квантових точок.

Оптичні біосенсори 1. Поглинання світла 2. Люмінесценція (випромінювання) 3. Поверхневий плазмонний резонанс (заломлення і відбиття)

Поверхневий плазмонний резонанс На його використанні був розвинений біосенсорний метод, що дозволяє детектувати нативні біомакромолекули та взаємодії між ними у режимі реального часу і без застосування будь-яких молекулярних міток. Порівнюючи цей метод з електрохімічними, можна сказати, що для такого детектування не потрібні зміни електропровідності або p. H середовища, не потрібні речовини, що можуть бути окислені або відновлені при відповідному електричному потенціалі. Тобто даний метод значно більш універсальний і більше підходить для вирішення багатьох завданнь біохімії, молекулярної біології та біотехнології.

Плазмон — це квазічастинка, якою описуються колективні коливання електронного газу та узгоджене розповсюдження повздовжньої електромагнітної хвилі Плазмони визначають оптичні властивості металів Частота коливань називається плазмонною частотою

Повне Внутрішнє Відбиття (Total Internal Reflection) n 2 n 1 90° cr sin / sin = n 2 / n 1 при = cr = 90° при > cr > 90°

Повне Внутрішнє Відбиття

Зникаюче поле dp ~ ½

Вільні електрони Плазмон Поверхневим плазмонним резонансом називається збудження поверхневого плазмону (поверхневої електромагнітної хвилі) в тонкому шарі металу під дією зникаючого поля в умовах повного внутрішнього відбиття.

Умова виникнення Поверхневого Плазмонного Резонансу

Криві ППР

ППР сенсор

www. biacore. com

Інститут фізики напівпровідників ім. В. Є. Лашкарьова НАН України Easy to use Flexible in application High sensitivity

Переваги Дозволяє детектувати широке коло нативних біомакромолекул та взаємодії між ними та з іншими речовинами у режимі реального часу і без застосування будь-яких молекулярних міток Висока чутливість Недоліки Потребує відносно складного обладнання Деяке обмеження в напрямку мініатюризації таких біосенсорів

From Wikipedia Сенсоры на основе поверхностного плазмонного резонанса представляют собой сенсорный чип, который состоит из пластиковой кассеты, несущей стеклянную тарелку, одна сторона которой покрыта микроскопическим слоем золота. Эта сторона взаимодействует с оптической распознающей аппаратурой прибора. Противоположная сторона тарелки соединяется с жидкостной проточной системой. Растворенные в жидкости реагенты могут непосредственно контактировать с поверхностью тарелки. Эта сторона стеклянного сенсорного чипа может быть различными путями модифицирована, позволяя легко присоединять интересующие молекулы. Обычно она покрыта карбоксиметилдекстраном или подобным веществом. Surface plasmon resonance sensors operate using a sensor chip consisting of a plastic cassette supporting a glass plate, one side of which is coated with a microscopic layer of gold. This side contacts the optical detection apparatus of the instrument. The opposite side is then contacted with a microfluidic flow system. The contact with the flow system creates channels across which reagents can be passed in solution. This side of the glass sensor chip can be modified in a number of ways, to allow easy attachment of molecules of interest. Normally it is coated in carboxymethyl dextran or similar compound.

Питання 6 Поясніть (зі схемою), що таке повне внутрішнє відбиття.

Питання 7 Поняття про зникаюче поле (evanescent field). На яку глибину (приблизно) проникають в менш оптично густе середовище „зникаючі” хвилі при повному внутрішньому відбитті?

Питання 8 Що таке поверхневий плазмонний резонанс? Принцип роботи біосенсора ППР.

Біосенсор - це автономний інтегральний аналітичний прилад, який забезпечує кількісний чи напівкількісний аналіз, з використанням біологічного розпізнавального елементу, що знаходиться у прямому контакті з фізичним перетворювачем D. R. Thévenot, K. Toth, R. A. Durst, G. S. Wilson. Electrochemical biosensors: recommended definitions and classification. Pure Appl. Chem. , 1999, V. 71, P. 23332348. Взаємодія Перетворювач Аналіз даних Електрични й сигнал Продукт Електроніка

Дякую за увагу!