ОПТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ И СРЕДСТВА ЛАБОРАТОРНОГО АНАЛИЗА Общая характеристика и классификация оптических методов лабораторного анализа
Общая характеристика оптических методов лабораторного анализа Среди методов ЛА одно из главных мест занимают оптические методы. Эти методы позволяют создавать как сложные, высокоточные автоматизированные приборы, так и простые и дешевые приборы позволяющие измерять целый ряд важнейших показателей, характеризующих свойства, состав, концентрацию отдельных компонентов сложных субстратов и жидкостей. Оптические методы ЛА основаны на различных физико химических явлениях, возникающих при взаимодействии излучения оптического диапазона с исследуемым веществом. Спектральный диапазон современных оптических (фотометрических) приборов для ЛА, как правило, ограничивается диапазоном видимого света (VIS) и ближнего ультрафиолета (UV).
Свет, являясь одним из видов электромагнитного излучения, представляет собой электромагнитные волны, которые характеризуются амплитудами и пространственной ориентацией векторов напряженности электрического Е и магнитного H поля, частотой изменения величины векторов ν и соответствующей ей длиной волны λ. Электромагнитная волна распространяется со скоростью с (с=3× 108 м/с в вакууме). Частота и длина волны связаны зависимостью
Спектр электромагнитного излучения представлен на рисунке
Человеческий глаз способен воспринимать только малую часть всего спектра электромагнитных излучений – видимый свет, частота колебаний которого соответствует длинам волн от 380 нм до 750 нм. Цветовые зоны видимого спектра приведены в таблице Цвет Диапазон, нм Фиолетовый 390… 450 Синий 450… 480 Голубой 480… 510 Зеленый 510… 550 Желто зеленый 550… 585 Желтый 575… 585 Оранжевый 585… 620 Красный 620… 800
Кроме явлений, подтверждающих волновую природу электромагнитного излучения, известны и такие явления, связанные с распространением света, как поглощение и рассеяние. Они свидетельствуют о том, что свет это поток материальных частиц (корпускул), названных фотонами. Энергия светового потока (энергия фотонов) Е пропорциональна частоте электромагнитных колебаний: где h – постоянная Планка, равная 6, 624× 10 34 Дж·с. Из этого следует, что энергия излучения прямо пропорциональна его частоте и обратно пропорциональна длине волны.
Функцию распределения излучаемой электромагнитной энергии в зависимости от частоты или длины волны называют спектром излучения. Излучение энергии на одной частоте и соответствующей ей длине волны называется монохроматическим излучением. Прохождение потока электромагнитной энергии через какую либо жидкую среду сопровождается такими явлениями, как поглощение (уменьшение энергии потока), рассеяние, отражение, преломление, излучение и др.
Поток световой энергии, переносимый через единицу площади, называют интенсивностью потока световой энергии. На рисунке 22 показано изменение интенсивности потока световой энергии прохождении света через раствор (а) и дисперсную среду (б) с толщиной поглощающего слоя L. На рисунке приняты следующие обозначения: I 0 – интенсивность падающего потока световой энергии; Iот – интенсивность потока световой энергии, отраженной от стенки кюветы; Iп – интенсивность потока световой энергии, поглощенной окрашенным раствором; Iр – интенсивность потока световой энергии, рассеянного дисперсной средой; I – интенсивность потока световой энергии, прошедшего через слой исследуемого вещества.
Изменение интенсивности потока световой энергии прохождении света через раствор (а) и дисперсную среду (б) с толщиной поглощающего слоя L. I I 0 Iот Iот Iп L а Iр L б
Если не учитывать поглощение потока световой энергии стенками кюветы, то интенсивность падающего светового потока I 0 при прохождении кюветы с раствором и дисперсной средой разлагается на составляющие следующим образом: • I 0 =Iот + Iп + I – для раствора, • I 0 =Iот + Iп + Iр + I – для дисперсной среды. Интенсивность потока световой энергии, отраженной от стенки кюветы Iот обычно компенсируется или учитывается.
Классификация оптических методов лабораторного анализа Оптические (фотометрические) методы ЛА базируются на способности жидких сред (растворов) поглощать, рассеивать, отражать, преломлять, излучать свет в результате химической реакции. Методы абсорбциометрии, турбидиметрии и нефелометрии во многом схожи между собой, поэтому их приборная реализация выполняется с помощью идентичных схемных и конструктивных элементов, и часто измерения, основанные на этих методах, могут выполняться с помощью одного прибора.
Общим для этих анализаторов является принцип измерения относительного ослабления оптического излучения. Если это ослабление произошло в результате поглощения веществом части прошедшего через него оптического излучения, то мы имеем дело с абсорбциометрией. Этот метод применяется для анализа прозрачных растворов. При анализе мутных коллоидных растворов (эмульсий, взвесей) применяются методы турбидиметрии и нефелометрии. В первом из этих методов измеряется ослабление как вследствие поглощения оптического излучения веществом, так и в результате рассеяния излученного потока взвешенными частицами раствора, через который проходит излучение.
В методе нефелометрии измеряется ослабление из лучения, полученное только за счет рассеяния потока взвешенными частицами раствора. Если при абсорбциометрии и турбидиметрии источник и приемник излучения находятся на одной оси, то в нефелометрических анализаторах источник и приемник излучения располагаются под прямым углом друг к другу для исключения попадания на фотоприемник излучения, прошедшего через вещество. Таким образом, на фотоприемник попадает только та часть потока, которая отражена частицами, взвешенными в растворе. Абсорбциометрический анализатор, в котором используется излучение только в видимой области спектра, называется колориметрическим анализатором.
В конструкции большинства современных анализаторов мутности применяются детекторы как на проходящее, так и на рассеянное под различными углами к источнику излучение (не только 90° и 180°), а сами производители довольно свободно оперируют терминами «турбидиметр» , «нефелометр» «анализатор взвешенных частиц» . Иногда для наименования анализаторов мутности используется наиболее общий термин «мунтомер» .
Природа анализируемых взвешенных частиц, их размер и концентрации являются определяющими в выборе условий измерения и конструкции прибора. При измерении мутности существует около десятка единиц измерения, отличающиеся по стандартам, используемым для калибровки прибора; источникам излучения; схемам расположения и количеству детекторов. Наиболее широкое распространение получили шкалы на основе формазиновых стандартов. Уникальные свойства формазиновой суспензии, в первую очередь воспроизводимость и возможность длительного хранения, обеспечили ее широкое использование в качестве первичного стандарта для калибровки мутномеров. Обобщенное название единиц мутности на основе формазина – FTU (или ЕМФ – единицы мутности по формазину), которая фактически соответствует концентрации формазиновой суспензии, выраженной в мг/л.
Распространение получила NTU – единица мутности на основе формазина для нефелометрии (источник излучения – вольфрамовая лампа и детектор расположены под углом в 90°). Вторая группа единиц мутности – это единицы, выражающие концентрацию конкретных веществ. Для данных единиц кроме используемых стандартов не регламентируется ни тип источника, ни способ детектирования. В этой связи, практически невозможно обеспечить сравнимость результатов, полученных в одних единицах, но на приборах различных конструкций, за исключением точек калибровки.
Что касается значения термина «колориметрия» , то его основное значение – измерение цвета, т. е. количественное выражение спектрального состава излучений в видимой области. Для разграничения двух значений термина «колориметры» , колориметрические анализаторы состава часто называют концентрационными колориметрами, а также колориметрами жидкости. При фотометрировании прозрачных окрашенных растворов не слишком большой плотности концентрация анализируемого вещества и относительное ослабление потока излучения, прошедшего через раствор этого вещества, связаны определенной закономерной зависимостью, а именно – оптическая плотность раствора (D) прямо пропорциональна концентрации растворенного вещества.
Поскольку часто оптическая плотность не является конечным информативным сигналом анализатора, а претерпевает дальнейшее преобразование, выведено ее выражение через интенсивность выходных сигналов. Определено, что оптическая плотность равна логарифму отношения интенсивности потока излучения, вошедшего в раствор, к интенсивности потока излучения, вышедшего из раствора, или равна логарифму отношения соответствующих электрических сигналов, полученных в результате фотоэлектрического преобразования оптических сигналов. Отношение потока и соответственно электрического сигнала, вышедшего из раствора, к вошедшему в раствор, выраженное в процентах, получило название пропускания (Т). Таким образом, абсорбциометрические анализаторы имеют две шкалы – равномерную шкалу пропускания и логарифмическую шкалу оптических плотностей.
Хотя указанные соотношения выведены и, строго говоря, справедливы только для прозрачных окрашенных растворов, практически оказалось, что они с достаточной степенью точности могут быть распространены и на непрозрачные растворы, исследование которых осуществляется методами турбидиметрии и нефелометрии. Кроме или вместо градуировок в оптических единицах (Т) и (D), для медицинских целей выпускаются анализаторы, градуированные в единицах концентрации биологических веществ, например в концентрациях гемоглобина крови, билирубина, хо лестерина и др. Название таких анализаторов обычно образуется из названия анализируемого вещества, например гемоглобинометр, билирубинометр или более подробно – «визуальный колориметрический гемоглобинометр» , «фотоэлектрический колориметрический гемоглобинометр» .
Наряду с измерением статических показателей состава или состояния вещества для медицинских целей все большее значение приобретают методы исследования кинетики биологических процессов. Эта задача решается с помощью абсорбциометров с графической регистрацией процесса изменения оптической плотности объекта во времени. Еще более совершенными являются абсорбциометры, снабженные компьютерными устройствами, обеспечивающими автоматическое вычисление скорости реакции. .
Анализаторы со светофильтрами (фильтровые фотометры) – более приемлемы для рутинных анализов, хотя приносят большую пользу и в исследовательской работе. Они проще, дешевле и отвечают требованиям большинства массовых биохимических методик. Анализаторы с монохроматорами называются спектрофотометрическими, или спектрофотометрами.
Кроме перечисленных оптических методов, при ЛА нашли место и другие: • флуориметрический, основанный на излучении раствором световой энергии, вызванной световой энергией возбуждения; • хемилюминесцентный, основанный на излучении раствором световой энергии в результате химической реакцией; • поляриметрический, основанный на свойстве некоторых (оптически активных) веществ поворачивать плоскость поляризации проходящего через них поляризованного света; • рефлектометрический, заключающийся в измерении интенсивности светового потока, отраженного от окрашенной поверхности носителя (твердофазной среды), которая зависит от концентрации исследуемой жидкой пробы; • рефрактометрический, заключающийся в определении показателя преломления исследуемой среды; • методы пламенной фотометрии (атомно эмиссионная и атомно абсорбционная), основанные на исследовании образцов распыленных в пламени.
Фотоколориметры, фотометры, спектрофотометры В каждой биохимической методике, рассчитанной на оптические методы физико химического анализа, указывается определенный участок спектра, в котором должны производиться измерения. Выделение требуемого участка спектра осуществляется в оптических анализаторах либо с помощью сменных светофильтров, либо монохроматором; при этом должны быть также правильно выбраны источник и приемник излучения Приборы, предназначенные для определения количества окрашенного вещества путем измерения величин поглощения и пропускания в видимой части электромагнитного спектра, называются фотоколориметрами или фотоэлектроколориметорам (измеряют полихроматический световой поток в полосе 7 -12 нм, используют светофильтры).
Приборы с интерференционными фильтрами обычно называют фотометрами. Фотометры так же, как и колориметры, работают только на фиксированных длинах волн, при которых спектральные характеристики используемых фильтров имеют максимальные значения. (работают в УФ, ИК, и видимом свете). Анализаторы со светофильтрами (фильтровые фотометры) – более приемлемы для рутинных анализов, хотя могут применяться и в исследовательской работе. Они проще, дешевле и отвечают требованиям большинства массовых биохимических методик.
Спектрофотометры – оптические приборы , разделяющие световой поток на непрерывный спектр и позволяющие измерять его на любой длине волн в пределах оптического диапазона и ближнего УФ (200 … 380 нм). Основное отличие спектрофотометра от фотоколориметра состоит в возможности пропустить через исследуемый образец световой поток любой требуемой длины волны ( за счет монохроматора), проводить фотометрические измерения, сканируя (просматривая) весь диапазон длин волн.
Cтруктурная схема однолучевого фотоколориметра. От источника видимого света (1) световой поток проходит через полосовой светофильтр (2), пропускающий световой поток в полосе длин волн Δλ. Благодаря его избирательности, из всего излучаемого спектра вырезается область, близкая к длине волны, соответствующей максимальной величине поглощения исследуемого вещества. 1 Ф Ф 0 3 2 Δλ 4 Δλ
В результате на исследуемый образец падает световой поток, приближающийся к монохроматическому. Это является необходимым условием для действия закона светопропускания Бера. После прохождения через контейнер (кювету) с исследуемым образцом (3) световой поток, часть энергии которого была поглощена раствором, поступает на фотоприемник (4), который преобразует световой поток в электрический сигнал. Назначение остальных, не показанных на рисунке узлов – получение и представление окончательного результата в виде показания стрелочного или цифрового индикатора в единицах оптической плотности (поглощения), пропускания или непосредственно в единицах концентрации исследуемого вещества.
В однолучевых фотометрах (фотоколориметрах) анализируемую пробу и опорный раствор помещают на пути излучения последовательно и измеряют соотношение обоих потоков излучения. Эти приборы просты по конструкции, однако они предъявляют повышенные требования к стабильности источника излучения и приемника. В двухлучевых фотометрах анализируемая проба и опорный раствор постоянно находятся каждый в своем потоке излучения. Для таких приборов необходим делитель потоков излучения, а при использовании одного приемника необходима система модуляции для разделения электрических сигналов и оптическая система для соединения обоих потоков излучения. Двухлучевые фотометры применяют для измерений, требующих долговременную стабильность.
Обобщенная структурная схема одноканального колориметра 12 11 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Из светового потока, формируемого источником световой энергии –лампой накаливания (1), диафрагма (2) вырезает узкий луч, создавая как бы «точечный» источник света. Оптическая система (3) формирует параллельный поток световой энергии, который фильтруется полосовым фильтром (4). Фильтр пропускает световой поток с максимальной длиной волны X в диапазоне длин волн Δλ. Оптическая система (5) формирует световой поток таким образом, чтобы при минимально допустимом объеме исследуемого раствора и многократной установки кюветы (6) в кюветное отделение геометрия потока не изменилась. Это значит, что площадь и форма пятна, образуемого световым потоком на чувствительной площадке детектора – фотоприемника (7), остается постоянной и практически не зависит в заданных пределах от объема раствора в кювете и смены кюветы в кюветном отделении. Фотоприемник преобразует световую энергию в электрическую. Аналоговый сигнал в виде тока (напряжения) поступает на АЦП (8) и в цифровой форме и вводится в микро ЭВМ (9), которая пересчитывает цифровой код в единицы измеряемых параметров.
Калибровочные коэффициенты, полученные в процессе калибровки прибора, хранятся в памяти микро ЭВМ. Данные по калибровочным растворам, необходимые для градуировки прибора, вводятся с пульта оператора (10). Результаты измерения выдаются на цифровой индикатор (11), интерфейс связи с внешней ЭВМ или регистрирующее устройство (12). Калибровочные и исследуемые растворы подаются в кюветы, которые оператором вставляются и вынимаются из кюветного отделения. Полосовой светофильтр, соответствующий методике проведения конкретного исследования, устанавливается вручную. Прибор имеет два режима работы: режим калибровки (градуировки); режим анализа. В режиме калибровки (предшествует анализу) оператор с пульта вводит нормированные значения, приписанные данному калибровочному раствору, последовательно подает в кюветное отделение калибровочные растворы и проводит измерения. В режиме анализа оператор устанавливает в кюветное отделение кювету с исследуемым раствором и проводит измерение. Если у прибора отсутствует режим автоматической калибровки, то оператор строит градуировочный график зависимости оптической плотности и нормированных значений, приписанных калибровочным растворам.
Структурная схема однолучевого спектрофотометра. (2) монохроматор 1 Ф Ф 0 3 2 Δλ 4 Δλ
Принцип работы спектрофотометра. Полихроматический свет от источника (1) проходит через монохроматор (2), который разлагает белый свет на цветовые компоненты. Монохроматическое излучение с дискретным интервалом в несколько нанометров проходит через ту часть прибора, где располагается образец с исследуемой пробой (3) и попадает на фотоприемник (4).
Спектрофотометр UV/VIS (ультрафиолет + видимый свет) имеет два источника света: для видимого участка спектра и источник ультрафиолета – от 100 до 390 нм. Источником видимого света служит вольфрамовая, как правило, галогенная лампа, дающая постоянный поток света в диапазоне 380 … 950 нм, являясь стабильным и долговечным источником световой энергии со средним сроком службы более 500 ч. В качестве источника УФ используются водородные или дейтериевые лампы. Ультрафиолетовые лампы, содержащие дейтерий, имеют высокую интенсивность излучаемого потока и непрерывный спектр в диапазоне от 200 до 360 нм.
Обобщенная структурная схема спектрофотометра. 2 13 4 12 3 1 6 5 7 8 9 10 11
Поворотный отражатель (2) направляет поток света от одного из источников (1 или 3), через оптическую систему (4) на входную щель монохроматора 5. С выхода монохроматора поступает монохроматический поток световой энергии с определенной длиной волны λ. Оптическая система (6) формирует световой поток таким образом, чтобы при минимально допустимом объеме исследуемого раствора и многократной установке кюветы (7) в кюветное отделение геометрия потока не изменилась. Далее принцип работы и устройство спектрофотометра аналогичны принципу работы и устройству одноканального колориметра. Фотоприемник – 8, АЦП – 9, микро ЭВМ – 10, пульт оператора – 11, индикатор – 12, интерфейс связи с ПК – 13.
Функциональная схема монохроматора с призмой 3 2 4 5 1 F 1 7 F 22 6
Щель (2), на которую падает полихроматический поток световой энергии от источника излучения (1), находится в фокальной плоскости линзы (3). Эта часть прибора называется коллиматором. Выходящий из коллиматора параллельный поток световой энергии падает на призму (4). Вследствие дисперсии (обусловленной зависимостью показателя преломления от длины волны) свет различных длин волн выходит из призмы под разными углами. Если в фокальной плоскости линзы объектива (5) поставить экран (6), то линза сфокусирует параллельные потоки энергии для различных длин волн в разных местах экрана. Поворачивая призму (4), можно просканировать через щель (7) монохроматические потоки энергии во всем спектре излучения.
Часто в качестве диспергирующего элемента используется дифракционная решетка, которая представляет собой стеклянную или металлическую пластину, на которой нанесены параллельные одинаковые штрихи, расположенные на строго одинаковых расстояниях друг от друга. На рисунке показана дифракционная решетка, состоящая из чередующихся параллельных другу щелей одинаковой ширины «b» , расположенных на одинаковом расстоянии «а» друг от друга. Сумма «а+b=d» является периодом этой структуры и называется постоянной решетки.
дифракционная решетка 6 2 3 4 5 P 1 P
Полихроматический поток световой энергии от источника излучения (1) через входную щель (2) линзой объектива (3) трансформируется в параллельный поток, который проходит через щели дифракционной решетки (4). В каждой точке на экране (6), расположенном в фокальной плоскости линзы объектива (5), соберутся те лучи, которые до линзы были параллельными между собой и распространялись под определенным углом Q к направлению падающей волны. Поэтому освещенность в точке Р на экране определяется результатом интерференции вторичных волн, распространяющихся как от разных участков одной щели, так и от разных щелей. Существует направление, распространяясь по которому, вторичные волны от всех щелей будут приходить в точку Р в одной фазе и усиливать друга, и другое – когда волны не совпадают по фазе и ослабляют друга. Таким образом, на экране наблюдается чередование светлых и темных полос. Условие формирования максимумов от дифракционной решетки, то есть когда волны усиливают друга при интерференции, наблюдается тогда, когда разность хода равна целому числу волн. Если на решетку падает свет разных длин волн, то максимумы для различных длин волн располагаются под различными углами Q к первоначальному направлению распространения света. Поэтому дифракционная решетка разлагает полихроматический свет в дифракционный спектр и употребляется как диспергирующий прибор
Преимущество дифракционных решеток состоит в том, что они обеспечивают линейную дисперсию света на всем диапазоне видимого и УФ спектров, недостаток – высокая стоимость по сравнению с призмами и светофильтрами. Одной из самых важных характеристик монохроматоров является полоса пропускания, уменьшение которой влечет за собой повышение разрешающей способности спектрофотометра. Интерференционные фильтры дают полосу пропускания в диапазоне 6… 20 нм, призмы и дифракционные решетки дают более узкую полосу – менее 5 нм, а следовательно, и большую «чистоту» (монохромность) света, падающего на кювету с образцом.
Детекторы. Применение кремниевых фотодиодных матриц в современных моделях спектрофотометров позволяет повысить характеристики точности и быстродействия, расширить возможности выбора полос пропускания. Использование в спектрофотометрах излучения в УФ диапазоне накладывает повышенные требования на чувствительность детектора. При этом предпочтение, как правило, отдается фотоумножителям как более чувствительным вариантам построения детектора. В отношении считывающих или выходных устройств спектрофотометров обычно выдвигаются более высокие требования по сравнению с требованиями к аналогичным устройствам фотоколориметров или фотометров (дисплеи, записывающие устройства, интерфейсы). Это связано, прежде всего, с задачами построения спектров, их анализа и наглядного представления, документирования и архивирования результатов.
• Спектрофотометры с фотодиодной решеткой. Особым типом спектрофотометров являются приборы с фотодиодной решеткой или матрицей (PDA). Здесь свет от источника направляется непосредственно на образец и уже после этого – на дифракционную решетку, которая проецирует разложенный по поддиапазонам свет на фотодиодную матрицу (решетку). Матрица содержит набор фотодиодных датчиков, преобразующих световую энергию в электрические импульсы. Поэтому любой диапазон длин волн при подобной конструкции спектрофотометра дает свой «отклик» практически мгновенно, а не последовательно, как это имеет место в традиционной спектрофотометрии. Электрические импульсы с фотодиодов обычно обрабатываются микрокомпьютером с выводом результатов на дисплей. В зависимости от используемого для работы диапазона волн используются дейтериевая и/или вольфрамовая лампы. Количество фотодиодов определяет разрешающую способность спектрофотометрического прибора. Применение фотодиодной матрицы является важным элементом проведения динамических исследований, что позволяет одновременно производить замеры исследуемого субстрата и образующегося в ходе реакции продукта при различных длинах волн. Использование данного подхода обеспечивает высокое быстродействие при работе спектрофотометра в режиме сканирования: менее 1 с на диапазон сканирования.
Характеристики абсорбциометрических приборов Основное назначение современных абсорбциометрических приборов – определение концентрации растворов с исследуемым веществом посредством сравнения величин поглощения или пропускания световой энергии исследуемого раствора известной концентрации. В настоящее время на рынке фотометрических приборов и в практических лабораториях можно встретить большое разнообразие различных по конструкции и характеристикам колориметров, фотометров и спектрофотометров. Приборы могут отличаться: • по форме представления информации (в единицах светопропускания, в единицах оптической плотности, в единицах концентрации или любых других значениях, по которым произведена калибровка); • по способу построения и хранения калибровочных значений (автоматическое, ручное, длительное или краткосрочное); • по способу подачи в прибор исследуемого раствора (проточная кювета, коммутируемая кювета, кюветы специальной конструкции, например, 96 луночный планшет и т. д. ); • по конструкции оптической системы (одноканальные и многоканальные); • по виду источника излучения световой энергии (разнообразные лампы накаливания с телом накала из вольфрама, импульсные, газоразрядные лампы, светодиоды, лазеры). Существуют и другие отличительные признаки, так или иначе влияющие на параметры и эксплуатационные характеристики приборов. • Рассмотрим основные параметры и характеристики колориметров.
Спектральный диапазон. В большинстве случаев фотометры (колориметры) работают в спектральном диапазоне 340 … 700 нм. Диапазон работы спектрофотометров, как правило, значительно шире (200 … 950 нм). Так как фотометры, в отличие от спектрофотометров, формируют заданную длину волны дискретно с помощью полосовых фильтров, то каждому фотометру придается набор светофильтров. Светофильтр аттестуется длиной волны, соответствующей максимуму пропускания, и полушириной полосы пропускания. Если область максимального поглощения света исследуемым раствором достаточно широка и значительно больше полосы пропускания фильтра, то влияние изменения полосы пропускания на точность измерения сказывается меньше, чем для случая, характеризуемого узкой областью поглощения света раствором.
Динамический диапазон измерения. Энергия светового потока, прошедшая через раствор, измеряется с помощью фотоприемников, при этом сила тока (напряжение), возникающего в фотоприемнике, прямо пропорциональна интенсивности светового потока, падающего на фотоприемник. Измеряя значения возникающих фототоков для случая пропускания исследуемого раствора и раствора сравнения (нулевого раствора), а затем логарифмируя отношение этих величин, приборы выдают значение оптической плотности (D) в Беллах (Б). Измерение оптической плотности в современных колориметрах лежит в диапазоне от 0 до 2, 0 Б. Имеются приборы с диапазоном измерения до 3 и более Белл, однако метрологическая оценка такого диапазона весьма проблематична. Диапазон измерения может быть представлен и диапазоном светопропускания. Диапазону оптических плотностей от 0 до 2 соответствует диапазон по светопропусканию от 100 до 1%.
Максимальный и минимальный объем исследуемого раствора. Максимальный объем определяется объемом измерительной кюветы, а минимальный допустимый объем раствора, при котором еще возможно получение гарантированных результатов измерений, определяется, помимо конструкции кюветы, возможностью приемно усилительного тракта прибора. Современные фотометрические приборы могут работать с минимальными объемами раствора в диапазоне 10… 500 мкл.
Градуировка прибора. Процесс приготовления набора стандартных растворов и задания им нормированной характеристики (величины концентрации раствора) есть процесс калибровки растворов (меры), по которым производится в дальнейшем градуировка прибора. Многие современные приборы имеют в своем составе вычислительные средства, которые позволяют автоматизировать процесс построения градуировочных характеристик. Считается достаточным, если прибор позволяет работать с 4 мя стандартными растворами различной концентрации. Тем не менее, имеются приборы, позволяющие при построении градуировочной характеристики обрабатывать результаты измерений 24 растворов и хранить несколько градуировочных характеристик одновременно. Приборы более высокого класса, имеющие энергонезависимое запоминающее устройство, позволяют сохранять информацию, в том числе и градуировочные характеристики, в течение длительного времени (нескольких месяцев) даже при отключении прибора от сети.
Способы отображения и регистрации информации. В общем случае фотометры могут выдавать информацию в светопропускании, в оптической плотности, в единицах концентрации исследуемых растворов или в тех единицах, в которых указаны значения калибровочных (стандартных) растворов. В качестве отображения информации в приборах используются стрелочные, цифровые и алфавитно цифровые индикаторы. Информация регистрируется принтерами самых различных конструкций. Большинство приборов имеет связь с внешней ЭВМ, чаще всего через стандартный интерфейс RS 232 C. Конкретные значения упомянутых выше и других параметров можно проследить по представленным ниже примерам абсорбциометрических приборов, содержащим данные о характеристиках конкретных моделей.
Примеры фотометров и спектрофотометров Микропланшетный фотометр Stat Fax 2100 фирмы AWERENES TECHNOLOGY INC, США (рисунок 30). Светофильтры: стандартный набор 405, 450, 490, 630 нм дополнительно 340 и 545 нм полуширина пропускания 10 нм Линейный диапазон 0, 2… 3, 0 ЕОП (А) Фотометрическая точность ± 1 % и выше Стабильность (дрейф, не более) 0, 005 А за 8 ч. Контейнер для образцов – 96 луночный планшет Время считывания 2 мин на 1 планшет. Память на 50 программ. Масса 13, 7 кг. Самодиагностика, несколько режимов калибровки, вычитание фона, выборочная обработка планшета, отметки об отклонениях от нормы и т. п.
Программированный полуавтоматический фотометр 5010, фирмы Roche Boehringer Mannheim, Австрия Методы анализа: конечная точка, кинетика, фиксированное время, абслютные измерения, турбидиметрия. Открытая система для любых реактивов. Эффективная система температурного регулирования, не требующая внешнего термостата. Прибор запоминает калибровочные кривые каждого теста и введенные коэффициенты. Программное обеспечение для нелинейных калибровок. Двойной контроль количества реакционной смеси. Встроенный матричный принтер, возможно подключение к внешнему компьютеру и принтеру.
Автоматизированный фотометр CORMAY MULTI фирмы Cormay Diagnostuka S. A. , Польша Фотометр спроектирован для малых и средних лабораторий. Монохроматор с интерференционными фильтрами в диапазоне 340… 700 нм. Проточная кювета объемом 18 мкл, стандартные открытые 10× 10 мм или круглые (диаметром 12 мм и высотой 75 мм) измерительные пробирки. Объем пробы на исследование: 100… 5 000 мкл. Диапазон измерения поглощения: 0, 2… 2, 200 А. Диапазон линейности: до 2, 200 А. Воспроизводимость результатов: менее 0, 5% (до 0, 2 А) и менее 0, 2% до 2, 00 А. Термостатирование: 23… 40°С, точность 0, 2°С. Кинетика, конечная точка, фиксированное время, дифференционные измерения. Жидкокристаллический дисплей 4× 20 символов. Масса: 9, 5 кг.
Аналитические фотометры серии BTS фирмы Bio. Sistems, Испания. Серия аналитических фотометров BTS (BTS 305, BTS 310 и BTS 320) – характерные для современного уровня развития фотометрической аппаратуры приборы. Фотометры имеют монохроматор на интерференциионных светофильтрах. В качестве источника света применяется галогеновая лампа. Встроенный термопринтер: 40 знаков/с, ширина бумаги – 80 мм. Жидкокристаллический дисплей – 4 строки по 40 знаков. Дополнительное оборудование: периферийный термостат на 20 ячеек, дозирующие устройства (пипетки с переменным объемом), погружные мешалки. Для подключения ПК встроен интерфейс RS 232 C.
Спектрофотометры СФ-1000 СФ-2000, СФ-56 (ООО НТЦЭ г. Санкт Петербург) – российские высокотехнологичные изделия, объединившие последние достижения в области оптики, электроники, точной механики и алгоритмизации вычислительных процессов. Приборы вобрали в себя все лучшее, что было в предыдущих моделях марки «СФ» , выпущенных ЛОМО, и приобрели новые преимущества, ставшими возможными на современном этапе развития теории и практики оптики и электроники. Применение оригинальной оптической схемы и современные электронные компоненты позволили сделать приборы компактным, точным и быстродействующим.
Спектрофотометр СФ-56 – это сканирующий спектрофотометр высокого класса. Прибор оснащен автоматизированным кюветным отделением на 6 образцов, что делает поточные измерения быстрыми и комфортными. Прибор оснащается четырьмя вариантами держателей образцов. Спектрофотометр СФ 56 работает под управлением персонального компьютера, как и все спектральные приборы высокого класса. ПО СФ 56 является полноценным приложением Windows и имеет интуитивно понятный интерфейс. Сохранение результатов производится в формате файловой структуры Windows, есть всплывающие подсказки и встроенная система помощи. СФ 56 оснащен автоматической процедурой начального самотестирования, которая определяет работоспособность прибора при каждом включении. Результаты тестирования в наглядном виде отображаются на экране компьютера. Также ПО имеет систему пошагового тестирования работоспособности прибора. В управляющей программе предусмотрены различные режимы работы: сканирование, поточечное определение оптической плотности/пропускания, получение кинетических кривых, определение концентраций. В любом режиме измерительная процедура на СФ 56 может быть легко настроена под запросы пользователя (можно гибко управлять включением источников излучения, выбирать ширину щели, шаг дискретизации, тип автоматического подбора экспозиции, работать при ручном и автоматическом типе перемещения кювет).
Спектрофотометр СФ-2000 имеет спектральную ширину щели 1 нм, что означает фиксацию практически любой полосы спектра без искажений. Имеет высокую степень автоматизации. Измерение темновых токов (установка нуля), измерение эталона и нескольких образцов производятся автоматически по одной команде. В стандартную комплектацию входит автосемплер на 10 кювет. СФ 2000 работает под управлением ПК, что значительно расширяет возможности настройки прибора и обработки результатов. Высокоскоростной интерфейс связи с компьютером (USB) обеспечивает быстрый двунаправленный обмен данными, повышая комфортность работы оператора. Программа управления СФ 2000 обеспечивает интерфейс общения оператора с прибором как на этапе настройки и измерения, так и на этапе обработки данных и сохранения результатов. Спектрофотометры СФ 2000 являются одними из самых быстродействующих спектрофотометров, время сканирования всего диапазона от 190 до 1100 нм – всего 6 с. Сниженные требования к количеству пробы. СФ 2000 может работать с микрокюветами, но даже при использовании обычных кювет с длиной оптического пути 10 мм минимально необходимое количество пробы составляет всего 1 мл.
СФ-1000 – это спектрофотометр, работающий в диапазоне от 315 до 1000 нм (можно одновременно выполнить измерение на 6 длинах волн). СФ 1000 – полностью автономный прибор, имеет встроенный специализированный процессор, дисплей и клавиатуру. Все команды задаются со встроенной клавиатуры, последовательность работы тщательно продумана, все процедуры меню оптимизированы. Информация выводится на жидкокристаллический дисплей, обеспечивающий легкое чтение элементов меню, параметров настройки, а также полученных результатов: как числовых значений, так и графических представлений – градуировочных линий и спектров. Все это гарантирует, что освоение нового прибора будет легким, а каждодневная работа на нем приятной и быстрой. Режимы измерения СФ: пропускание, оптическая плотность, концентрации Прибор предоставляет возможность разрабатывать собственные методики определения концентраций на основе градуировочного графика. Объем встроенной памяти достаточен для сохранения большого количества методик и результатов измерений. Встроенный микропроцессор обеспечит высокую скорость работы.
Нефелометрические методы и средства лабораторного анализа В методе нефелометрии измеряется ослабление излучения, полученное только за счет рассеяния потока взвешенными частицами раствора. Этот вид исследования проводится с целью определения концентрации, размера и формы диспергированных частиц в дисперсных средах. Аппаратура для нефелометрических исследований представляет собой специализированные спектрофотометры для измерения интенсивности рассеянного света под углом к направлению падающего на раствор светового потока. Первым способность частиц рассеивать свет описал Дж. Рэлей более 100 лет тому назад. Важная в прикладном плане суть этого явления заключается в том, что интенсивность и направление светового потока, рассеянного гомогенной взвесью частиц, зависят от размера частиц.
На рисунке показаны два наиболее значимых случая рассеяния света. Рэлеевское, или симметричное, рассеяние имеет место, когда размер частиц не превышает 0, 1 от длины волны – случай «а» . Частицы больших размеров рассеивают свет неравномерно. Когда размер (d) приблизительно равен длине волны светового потока, вперед (по направлению потока) рассеивается больше света, чем в обратном направлении – случай «б» . d ≈λ d<0, 1λ I 0 а б
Приборы, предназначенные для нефелометрических исследований, называются нефелометрами. Длины волн, используемые в большинстве нефелометров, находятся в диапазоне 340– 650 нм. Если учесть, что системы антиген-антитело содержат гетерогенные популяции частиц с размерами от 250 до 1500 нм, а используемые в аппаратуре длины волн – величины того же порядка, что и размеры исследуемых частиц, большая часть света будет рассеиваться под углом 90°. Поэтому, хотя для измерения рассеивания света датчики могут быть установлены под углом от 5° до 90°, наилучшие характеристики по чувствительности при нефелометрических измерениях будут достигнуты, если измерять интенсивность света, рассеянного под углом 90°.
Направления прохождения потоков световой энергии, поясняющие принципы проведения нефелометрических исследований, показаны на рисунке. 1– источник световой энергии; 2 – полосовой фильтр; 3 – кювета; 4 – фотоприемник; Фо – падающий поток световой энергии; Фр – поток световой энергии, рассеянный жидкой дисперсной системой; Δλ полоса пропускания светофильтра. 1 2 Ф 0 3 Δλ Δλ Фр 4
Современные нефелометры Микропланшетный нефелометр Nepheloskan Ascent фирмы Lab. Sistems рассчитан на проведение анализов в стандартных 96 луночных планшетах и стрипах. В сочетании с программным обеспечением Ascent, на основе Windows™, он представляет собой чувствительный и высокопроизводительный инструмент для применения в различных областях медицины, в производстве и для научных исследований. Nepheloskan Ascent снабжен высокочувствительной оптической системой, изменение параметров интенсивности лампы и коэффициента усиления фотоумножителя может производиться непосредственно с помощью программного обеспечения. Скорость сканирования 96 луночного микропланшета составляет 25 с. С целью оптимизации процедуры смешивания реагентов и встряхивания реакционной смеси предусмотрена установка встроенного орбитального шейкера. Эффективная компьютерная программа Ascent облегчает модификацию аналитических протоколов. Это обеспечивает удобное программирование стадий анализа, а также легкость оперирования полученными результатами и составления отчетов. Nepheloskan Ascent является полностью открытой системой (адаптирован к реагентам различных производителей). Nepheloskan Ascent пригоден как для мелко и крупносерийных измерений с одинаковыми удобством и экономичностью. Система является в высокой степени экономичной по расходу антисыворотки (порядка 10… 20 мкл на одно измерение). В стандартном варианте предлагаются наборы для количественного определения диагностически значимых специфических белков.
Nepheloskan Ascent
Нефелометр Turbi. Direct (Tintometer Gmb. H, Германия) – высокоточный инструмент для лабораторного и мобильного использования. Мутность измеряется в соответствии с ИСО 7027 в нефелометрических единицах (рассеянный свет под прямым углом). ИК источник света допускает измерение окрашенных и неокрашенных образцов. Автоматический диапазон определения позволяет прямое измерение от 0, 01 до 1100 нефелометрических единиц, с точностью ± 2% до 500 и ± 3% для больших значений. Имеет большой графический дисплей. Удачный дизайн делают этот прибор очень легким в использовании.
Turbi. Direct
Турбидиметрические методы и средства лабораторного анализа • Турбидиметрический метод основан на измерении ослабления интенсивности потока световой энергии, прошедшего через дисперсную систему, как вследствие поглощения оптического излучения веществом, так и в результате рассеяния излученного по тока взвешенными частицами раствора. • Данный вид исследования мутных сред аналогичен колориметрическому методу, но в ряде случаев измерение может происходить в потоке «белого света» без применения полосовых фильтров. • С точки зрения чувствительности метода, в частности при определении концентрации иммуноглобулинов, сравнение нефелометрии и турбидиметрии оказывается в пользу нефелометрии, т. к. этот метод более чувствителен, когда небольшое количество взвешенных частиц приводит к заметному возрастанию сигнала при незначительном фоне.
• Преимущество турбидиметрического анализа заключается в том, что измерения могут быть выполнены практически на любом колориметре или фотометре (в отличие от нефелометрических исследований, для которых требуется специально спроектированный для этих исследований прибор — нефелометр). Повышение чувствительности турбидиметрических исследований может быть достигнуто за счет использования спектрофотометров с высококачественными детекторами.
Направления прохождения потоков световой энергии, поясняющие принципы проведения турбидиметрических исследований (1 – источник световой энергии (лампа накаливания, импульсная лампа); 2 – полосовой фильтр, в некоторых случаях фильтр отсутствует, и измерение проводится в «белом» свете; 3 – кювета; 4 – фотоприемник; Ф 0 – падающий поток световой энергии; Фр – поток световой энергии, рассеянный жидкой дисперсной системой; Ф – поток световой энергии, прошедший раствор; Δλ – полоса пропускания светофильтра). 1 Ф Ф 0 3 2 4 Δλ Δλ Фр
Основные компоненты, которые используются при построении нефелометрических и турбидиметрических приборов, похожи и включают источник света, фильтр и фокусирующую световой поток систему линз, кювету с образцом и детектор с устройствами отображения и регистрации результата. В качестве источника света обычно используются ртутные дуговые лампы, вольфрамо йодистые лампы и гелий неоновые лазеры. Лазеры излучают монохроматический свет, сконцентрированный в узкий и интенсивный луч. Однако лазеры очень дороги и могут излучать ограниченный набор фиксированых по частоте волн.
Модели современных турбидиметров Портативный микропроцессорный турбидиметр HI 93703, обеспечивающий лабораторную точность измерений и в полевых условиях. Источником излучения в этой модели является инфракрасный фотодиод, имеющий длительный срок службы и обеспечивающий постоянную интенсивность излучения в течении всего срока. Максимум испускания находится при 890 нм, что обеспечивает требуемую интенсивность рассеянного света даже в образцах с низкой мутностью, а также уменьшает мешающее влияние окраски растворов. Диапазон измерения 0. 00 … 50. 00 FTU / 50 … 1000 FTU, разрешение 0. 01/1 FTU, погрешность измерения ± 0. 5 FTU или ± 5% (наибольшая). Прибор предельно прост в эксплуатации. Все операции выполняются с помощью четырех кнопок. Сообщения о неисправностях отражаются в виде кодов ошибок на дисплее.
Турбидиметр HI 93703
Полуавтоматический анализатор–турбидиметр Behring Turbidimer концерна DADE–Behring (США, Германия) предназначен для определения специфических белков в сыворотке, моче и цереброспинальной жидкости. Производительность прибора от 20 до 50 тестов в час. Автоматическая обработка данных с выводом на печать. Возможность подключения к персональной ЭВМ через интерфейс RS 232.
Флуориметрические методы и средства лабораторного анализа Если световая энергия, поглощенная атомами или молекулами, отдается ими в виде светового же излучения, то такое явление называется флуоресценцией. Спектр излучения флуоресценции многих веществ носит избирательный характер. Как и в случае спектров поглощения, избирательность обусловлена структурой и составом излучающего вещества. Спектры излучения растворов при флуоресцентных измерениях состоят, как правило, из широкой полосы с максимумом при некоторой длине волны. Кроме веществ, дающих широкие полосы излучения, встречаются вещества с хорошо выраженной колебательной структурой спектра. Спектр излучения не зависит от длины волны возбуждающего света. Это правило показывает, что спектр флуоресценции характеризует исследуемое вещество и является основой для обнаружения и идентификации этих веществ. Вторым правилом является правило Стокса, согласно которому спектр флуоресценции и его максимум по сравнению со спектром абсорбции смещен в сторону больших длин волн.
Например, растворы, облученные световой энергией в ультрафиолетовом диапазоне, могут флуоресцировать любым светом, а растворы, флуоресценция которых возбуждается зеленым светом, не могут светиться фиолетовым и синим, а только желтым и красным, словом, таким светом, который соответствует большим длинам волн. Для большинства веществ кривые спектров излучения и поглощения перекрываются. Количественное преобразование возбуждающей энергии в энергию флуоресценции определяется выходом флуоресценции.
Существуют понятия квантового и энергетического выходов. Квантовым выходом (Вкв) флуоресценции называется отношение числа излученных квантов (Nh) к числу поглощенных (Nn): Энергетическим выходом (Вэ) называется отношение излученной энергии (Еи) к энергии поглощенной (Еп):
Энергетический выход флуоресценции зависит от соотношения длин волн поглощения и излучения. Эта зависимость получила название закона С. И. Вавилова. Закон гласит, что энергетический выход флуоресценции увеличивается пропорционально возрастанию длины волны поглощения световой энергии до некоторой определенной длины волны, после чего энергетический выход начинает быстро уменьшаться. При этом квантовый выход остается постоянным в той же спектральной области, где энергетический выход пропорционален длине волны поглощения.
Интенсивность флуоресценции раствора (Фф) зависит от энергии светового потока (Фп), поглощенной раствором, и квантового выхода флуоресценции (Вкв) и определяется формулой: Учитывая закон Бугера–Ламберта–Бера, с некоторым приближением можно принять, что где Ф 0 – световой поток, поступающий в раствор; Кl – коэффициент поглощения на данной длине волны X, зависящий от природы растворенного вещества; С – концентрация флуоресцирующего вещества; 1 – толщина поглощающего слоя; Вкв – квантовый выход флюоресценции.
При больших разбавлениях раствора и поддержании постоянными значений Ф 0, Кl. l, Вкв, что вполне реально при проведении измерений, значение интенсивности флуоресценции будет пропорционально концентрации: где k – коэффициент пропорциональности. Следует отметить, что на пропорциональность концентрации раствора и интенсивность флуоресценции, помимо других физико химических факторов, влияет толщина флуоресцирующего слоя.
При малых концентрациях энергия возбуждающего света равномерно поглощается слоями флуоресцирующего раствора по всей его толщине, следовательно, и поток флуоресцирующего излучения, возникающего в единице объема раствора, будет пропорционален концентрации С по всему объему раствора. В случае больших концентраций происходит интенсивное поглощение энергии возбуждающего света первыми слоями раствора и нарушается равномерность поглощения энергии по всему объему раствора, что, естественно, ведет к изменению суммарного потока флуоресценции. Другая причина зависимости флуоресцирующей энергии от толщины слоя раствора заключается в том, что в ряде случаев спектры поглощения и флуоресценции одного и того же раствора перекрываются, и флуоресцирующая энергия на пути от глубинных слоев раствора к его поверхности частично поглощается самим раствором. Это явление носит название вторичного поглощения, или реабсорбции света.
Учитывая многочисленные физико химические факторы отклонения от пропорциональности энергии поглощения и энергии флуоресценции от концентрации исследуемого раствора, при практических определениях концентрации раствора по световой энергии требуется предварительное построение градуировочных кривых. Градуировочная кривая строится по результатам измерений флюоресценции растворов с известной концентрацией.
Направления потоков световой энергии при флуориметрии 1 Ф 0 3 2 Δλ 1 1 – источник световой энергии для возбуждения 2– полосовой фильтр, пропускающий поток световой энергии для возбуждения в полосе длин волн Δλ 1; 3 – кювета; 4 – полосовой фильтр, пропускающий поток излученной световой энергии в полосе Δλ 2; 5 – фотоприемник; Фо – падающий поток световой энергии в полосе Δλ 1 для возбуждения исследуемого раствора; Фи – поток световой энергии излучения, вызванный возбужденным исследуемым раствором с максимумом излучения λ 2 max; ΔФи – поток световой энергии излучения в полосе длин волн Δλ 2. Фи λ 2 max 4 ΔФи Δλ 2 5
Структурная схема одноканального флуориметра с импульсным источником возбуждения 18 19 20 21 22 17 16 15 12 14 13 2 3 4 5 1 6 7 8 9 10 11
Источником световой энергии возбуждения (1) является импульсная лампа. Диафрагма (2) ограничивает размеры светового потока. Оптическая система – конденсор (3) формирует параллельный поток световой энергии, которая фильтруется полосовым фильтром (4). Фильтр пропускает световой поток с максимальной длиной волны X в диапазоне длин волн ΔХ. Оптическая система (5) формирует световой поток таким образом, чтобы после прохождения через кювету (6) площадь и форма пятна, им образуемые на чувствительной площадке фотоприемника (7), были оптимальными. Фотоприемник трансформирует световую энергию в электрический сигнал, который усиливается усилителем (8). Находящийся в кювете (6) исследуемый или градуировочный раствор, поглотив часть энергии потока возбуждения, становится источником флуоресцентного излучения. Поток световой энергии излучения, пройдя диафрагму (13), оптическую систему (14), нейтральный ослабитель (15) и полосовой фильтр (16), попадает на фоточувствительную площадку фотоприемника (17), преобразуется в электрический сигнал и усиливается усилителем (18). Назначение диафрагмы (13), оптической системы (14) и полосового фильтра (16) аналогично назначению этих элементов в полосе возбуждения света. Нейтральный ослабитель (15) служит для ослабления энергии излучения большой мощности с целью возможности измерения этой энергии в данном диапазоне измерения.
Этой же цели служит автоматическая регулировка усиления усилителя (18). Через коммутатор (19) сигналы с усилителей (8) и (18) поочередно поступают на вход АЦП (20) и в виде цифрового кода поступают в микро ЭВМ (21), где происходит их обработка. Микро ЭВМ через интерфейсы связи (на схеме не показаны) управляет системой запуска импульсной лампы (12), выбором нужного диапазона измерения (коэффициента измерения усилителя) (18), системой индикации (9), регистрирующим устройством (11) и через пульт (10) обменивается информацией с оператором. Наряду с большими преимуществами применения импульсной газоразрядной лампы в фотометрии имеют место определенные трудности, связанные с нестабильностью световой энергии возбуждения, излучаемой лампой от вспышки к вспышке. Для учета нестабильности светового потока возбуждения в схеме поставлен фотоприемник (7), сигнал с которого пропорционален потоку возбуждения.
Одним из наиболее эффективных способов уменьшения влияния разброса энергии возбуждения и других случайных факторов является, как всегда, многократное измерение и усреднение результатов. В качестве фотоприемника энергии излучения чаще всего используют фотоэлектрические умножители (ФЭУ). Прибор имеет минимум два режима работы: режим градуировки; режим анализа. Режиму анализа должна предшествовать градуировка. В режиме градуировки оператор с пульта вводит нормированные значения, приданные данному калибровочному раствору, последовательно подает в кюветное отделение кювету с исследуемым раствором и проводит измерение.
Встроенная микро ЭВМ строит градуировочную характеристику прибора по измеренным прибором значениям флуоресценции и введенным оператором номинальным значениям концентрации калибровочных растворов. В режиме анализа прибор проводит измерение флуоресценции и по градуировочной характеристике пересчитывает результаты в единицы концентрации раствора. Одним из преимуществ флуориметрии является более высокая чувствительность, которая может на четыре порядка превышать чувствительность фотометрических методов. Это происходит потому, что в фотометрических методах для определения неизвестной концентрации анализируемого вещества в образце измеряется разность в поглощении между раствором, содержащим нулевую концентрацию анализируемого вещества (%Т= 100) и анализируемым образцом. В случае сильно разбавленных образцов (для которых, например, %Т= 98), небольшие отклонения в процессе измерения могут привести к большим относительным ошибкам в результатах. В случае флуориметрии, наоборот, осуществляется прямое измерение флуоресценции образца для определения неизвестной концентрации содержащегося в нем анализируемого вещества.
Особым преимуществом флуориметрии является очень высокая специфичность определения. В случае фотометрии, в рабочей полосе частот помимо поглощения анализируемого вещества может присутствовать поглощение и других веществ. Следует иметь в виду, что лишь небольшое число веществ обладает способностью к флуоресценции. Таким образом, многие вещества, мешающие другу при одновременном присутствии в фотометрическом измерении, уже не могут помешать другу при измерении флуоресценции. Кроме того, вещества, имеющие сходные спектры возбуждения, могут иметь различные спектры испускания и наоборот. Следовательно, правильный выбор рабочих полос частот для двух волновых селекторов может обеспечить дополнительное подавление фонового сигнала. Совокупность этих свойств обеспечивает возможность флуориметрического определения пикограммовых количеств анализируемых веществ. Для предотвращения поглощения света флуоресценции другими молекулами при его прохождении через раствор, в измерениях используются сильно разбавленные образцы. Принципиальным недостатком флуориметрических методов является зависимость результатов измерений от температуры и
Примеры моделей флюориметров Портативный экспресс флуориметр RAMP® Clinical Reader (производство компании Response Biomedical Corp, Канада) предназначен для количественного определения миокардиальных маркеров: • тропонина I (до 32 нг/мл, чувствительность 0, 03 нг/мл), • миоглобина (до 400 нг/мл, чувствительность 2, 4 нг/мл), • креатинкиназы (до 80 нг/мл, чувствительность 2, 4 нг/мл). Прибор позволяет проводить анализ в автомобиле скорой помощи, в реанимационном отделении, в лаборатории, у постели пациента (до 100 тестов без перезарядки встроенного аккумулятора). Результаты исследований готовы в течение 15 минут от момента взятия пробы. Объем пробы – 70 мкл. В состав набора включено все необходимое для проведения анализа: индивидуальные тест системы, пробирки с буфером для разведения проб, наконечники, пипетка. Результаты анализа выводятся на ЖК дисплей и внешний принтер.
Портативный экспресс флуориметр RAMP® Clinical Reader
Флуориметр модели 6200 – недорогой надежный прибор с микропроцессорным управлением, обладает высокой чувствительностью и малым дрейфом. Выбор длины волны возбуждения – до 700 нм. Флуориметр 6200 – идеальный прибор для анализа образцов с известными флуоресцентными свойствами. Непревзойденная чувствительность и линейность достигается благодаря источнику света непрерывного спектра возбуждения (высокоинтенсивная ксеноновая лампа мощностью 75 Вт), применению неограниченного числа простых фильтров и стандартных таблиц. Датчик эмиссии – высокочувствительный ФЭУ. Сигналы эмиссии обрабатываются микропроцессором и выводятся на цифровой индикатор. Прибор имеет аналоговый, параллельный и последовательный (RS 232) вывод информации, что позволяет применять разнообразные программы обработки данных, вывод на ПК и печать.
Флуориметр модели 6200
Флюориметры серии Fluoroskan фирмы Labsystems Oy, Финляндия. Приборы используются при иммунологических, микробиологических и биохимических исследованиях. Более ранняя модель Fluoroskan II — высокочувствительный прибор, специально созданный для работы с 96 луночным планшетом. Прибор Fluoroscan Ascen рассчитан на считывание от 1 й микрокюветы до 96 луночного планшета. Время считывания планшета – 25 с. Возможны варианты использования прибора для считывания планшета с 384 ячейками и комплектования его устройствами пробоподготовки на борту: инкубатор и шейкер. Прибор совместим с робототехническими устройствами. Управляется с помощью специального программного обеспечения.
Анализатор биожидкостей флюоресцентнофотометрический «ФЛЮОРАТ– 02 АБФФ» , НПФ аналитического приборостроения «ЛЮМЭКС» (Санкт Петербург, Россия) «ФЛЮОРАТ– 02 АБФФ» предназначен для измерения оптического пропускания и флюоресценции, определения в крови белков, глюкозы, фенилаланина и проведения ИФА определения в моче белков, гормонов. Выпускается в комплекте с 13 светофильтрами: 270, 300, 316, 340, 410, 420, 470, 490, 515, 520, 545 и 590 нм.
Хемилюминесцентные методы и средства лабораторного анализа Особое место в люминесцентном анализе занимают хемилюминесцентные методы анализа. Обычно это реакции окисления, в ходе которых происходит возбуждение молекул продуктов реакции и выделение световой энергии (лучистая дезактивация) при возвращении их в основное состояние. Наиболее эффективно хемилюминесцентные вещества используются в качестве индикаторов. При титровании окрашенных и мутных сред их преимущество по сравнению с флуоресцентными индикаторами заключается в том, что нет необходимости прибегать к формированию светового потока возбуждения.
В аналитической практике нашли наибольшее применение такие хемилюминесцентные индикаторы, как люминол, люцегитин, лафин и силаксен. Частный случай хемилюминесценции – биолюминесценция, имеющая биологическую природу свечения. При биолюминесценции выделение световой энергии излучения происходит в результате окислительного процесса, катализируемого ферментами – люциферазами. Эти ферменты получают из биологических систем. Наиболее широко известны два типа люциферазы: светлячковая и бактериальная. Поскольку биологические катализаторы – ферменты, как правило, чрезвычайно избирательны, то биолюминесцентные методы очень специфичны. Как и большинство фотометрических методов, хемилюминесцентный анализ также требует градуировки.
Направление потоков световой энергии, поясняющих принцип хемилюминометрии. В кювете (1) находится исследуемая среда, излучающей световую энергию (поток Фи). Полосовой фильтр (2), пропускает поток излученной световой энергии в полосе длин волн Δλ (поток ΔФи), который попадает на фотоприемник (3). Фи 1 ΔФи 2 3 Δλ
Примеры люминометров Люминометр Luminoskan фирмы Labsystems Oy, Финляндия. Один из наиболее чувствительных и совершенных люминометров, из представленных на современном рынке лабораторных приборов. Он ориентирован на работу в планшетном формате. Хорошо зарекомендовал себя при определении АТФ. Чувствительность – от 0, 2 фмол АТФ. Обеспечена возможность работы с одним–четырьмя диспенсерами, термостатом и шейкером. Приспособлен для работы совместно с робототехническими устройствами.
Высокочувствительный люминометр LB 9507 фирмы Laboratorium Prof Dr Berthold (Германия) Автоматический люминометр LB 9507 имеет очень низкий уровень фона. Динамический диапазон расширен за счет специальной технологии подсчета фотонов и характеризуется высокой линейностью в пределах 5 декад. Вследствие ряда новых технических решений, чувствительность повышена на 30%. Реагентный инжектор выполнен из коррозийностойкого материала. Загрузка и разгрузка образца может производиться в процессе работы прибора в режиме измерения.
Скачать презентацию ОПТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ И СРЕДСТВА ЛАБОРАТОРНОГО АНАЛИЗА Общая характеристика
ОПТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ И СРЕДСТВА ЛАБОРАТОРНОГО.ppt