Оптические методы анализа А А Ганеев Санкт-Петербургский государственный

Оптические методы анализа А. А. Ганеев Санкт-Петербургский государственный университет Химический факультет Санкт-Петербург

Аналитические спектрометры От источника до сигнала Источник Х а р а к т р е р и с т и к и Спектральный диапазон Постоянный или переменный Однородность, диаметр Фокусирующая система Полное или селективное пропускание Совместимость с остальными частями спектрометра Выбор компонент Выбор материалов Спектрометр Спектральный диапазон Дисперсия, разрешение Моно- или полихроматор Выбор диспергирующего элементаt Выбор размеров оптические каналы Детектор С накоплением или непрерывный Цифровой или аналоговый Постоянная времени Фотопластинки ФЭУ диоды, CCD, CID О с н о в н ы е

Спектральный диапазон Фокусирующая система в значительной степени определяется источником Спектральный диапазон размеры Конденсор <180 nm >400 nm Азот или вакуум воздух Mg. F 2 кварц Сухой воздух Промежуточное изображение стекло Световоды Однородность доступ Цилиндрическ ие линзы

Призмы Используются в спектрографах с фиксированным углом и фотографическим детектором Не используются с электронными детекторами Новое применение призм – разделение порядков в CCD спектрометрах

Световоды

Дифракционные решетки l Плоские i i’ Прозрачные l Сферические i’ i Отражающие фазовые, Эшелле

Разрешение Дисперсия обратная • • линейная Реальное разрешение спектрометра определяется: – Шириной щели – Изображение входной щели на выходной – Разрешением решетки – Линейной дисперсией – Шириной линии излучения В большинстве спектрометров ширина линии не влияет на разрешение спектрометра

Фазовая отражательная решетка При малых углах , уравнение решетки принимает вид: – 2 d. Sin = m Порядок дифракции, в котором должна наблюдаться максимальная интенсивность для длины волны 0: m = 2 d. Sin / 0 Решетки с большим m называются решетками Эшелле. В этом случае дисперсия пропорциональна m.

Разрешение Недостаточное Удовлетворительное J( ) = int K(y- ) F(y)dy хорошее

Схема Fastie-Ebert • Уравнение решетки • Превращается в • Обратная дисперсия

Схема Черни-Турнера (Czerny-Turner) Схема Черни-Турнера подобна схеме Фасти. Эберта, но более удобна в настройке.

Схема Черни-Турнера • Эта схема существует во многих вариантах. • Может быть использована в компактных CCD спектрометрах • В коммерческих версиях фокальная длина 1 – 2 м.

Схема Пашена-Рунге Решетка l l Фиксированная вогнутая решетка Подвижная входная щель i’ 1 Нулевой Неподвижные выходные порядок щели или маски Радиус решетки равен двум радиусам круга Роланда i Line Круг Роланда Line Нормаль к решетке

Некоторые характеристики полихроматоров Фокальная длина: 500 -1200 mm Входная щель: 10 - 30 µm Выходная щель: 20 - 50 µm Решетка: 1200 à 4800 штр/мм è обратная дисперсия: от 0, 1 до 0, 8 nm/mm è теоретическое разрешение (k = 1) : 120000 до 360000 è реальное разрешение от 10 до 40 pm

Спектрометры со скрещенной дисперсией CCD матрица

Детекторы излучения Один очень эффективный детектор, но сигнал от него недоступен Michael W. Davidson : National High Magnetic Field Laboratory, The Florida State University, USA

ФЭУ

Характеристики ФЭУ

Детекторы с зарядовой связью Charge Coupled Device (CCD) • Разработаны в 1960 Bell Labs. • Используются в больших количествах • « дешевые» • медленные • Вычитание шума E Зона проводимости Примесные уровни h Валентная зона Донорный Акцепторный

Детектор с Зарядовой Связью (CCD) схема образования переноса заряда в ПЗС матрице

Квантовая эффективность диодов

В любом стационарном состоянии общая энергия молекулы складывается из электронной, колебательной и вращательной энергий: Eм = Eэл + Eкол + Eвр Еэл >> Екол >> Е вр 1 e. V < Еэл < 5 e. V - Видимая и УФ области спектра 10 -2 e. V < Екол < 10 -1 e. V - ИК 10 -5 e. V < Евр < 10 -3 e. V - ИК

Синглетное и триплетное состояния В синглетном состоянии спины электронов, занимающих одну и ту же орбиталь, антипараллельны В триплетном состоянии спины возбужденного электрона и электрона, оставшегося в основном состоянии, параллельны ¨В любом стационарном состоянии общая энергия молекулы складывается из электронной, колебательной и вращательной энергий. ¨Наибольший вклад в величину вносит электронная состаляющая от 1 до 5 э. В. ¨Разность энергий молекулы в электронновозбужденном и основном состоянии соответствует энергии поглощаемых квантов ЭМИ в видимой и ультрафиолетовой области спектра. ¨Энергия колебательных переходов : 10 -2 ÷ 10 -1 э. В, а вращательных : 10 -5 ÷ 10 -3 э. В, что попадает в диапазон длин волн инфракрасного излучения, соответственно в его ближнюю и дальнюю область.

Электронные состояния молекул возникающие из электронных состояний атомов Состояние изолированного атома Состояние молекулы

Переходы в молекулах Наиболее устойчивым состоянием молекул является синглетное. Это состояние соответствует суммарному спину, равному нулю. В синглетном состоянии спины электронов, занимающих одну и ту же орбиталь, антипараллельны Электронные переходы без изменения спина называют синглет-синглетными. Например, случай перехода из основного состояния в возбужденное при поглощении или при флуоресценции. Возможен случай, когда спины возбужденного электрона и электрона, оставшегося в основном состоянии, параллельны: Суммарный спин при этом равен 1. Этот случай соответствует триплетному состоянию молекулы. Время жизни триплетного состояния сравнительно велико - от 10 -2 до 100 сек.

Переходы в молекулах Каждому из электронных состояний молекулы: So, S 1, S 2 и T 1, Т 2, Т 3 и т. д. соответствует “n” колебательных подуровней: o, 1, 2, 3, …, n; в свою очередь каждому колебательному – “m” вращательных. ¨Переход молекулы на один из более высоких уровней может произойти только в том случае, если энергия фотонов падающего излучения равна энергии перехода с уровня So на более высокий уровень или подуровень синглетного состояния. ¨Если переход заканчивается на каком-либо колебательном подуровне возбужденного уровня S 1, то молекула очень быстро (~ 10 -13 с) переходит на уровень S 1 с выделением избыточной энергии в форме тепла.

Переходы в молекулах Молекула в возбужденном состоянии S 1 может расходовать оставшуюся энергию возбуждения по одному из трех механизмов: передать ее другой химической частице при столкновении (колебательная релаксация) или испустить ее в виде кванта ЭМИ (флуоресценция). ¨При определенных условиях молекула может перейти на какой-либо подуровень триплетного уровня, обладающий почти такой же энергией (интеркомбинационная конверсия); затем возможно испускание квантов, которое называется фосфоресценцией. ¨Флуоресценция и фосфоресценция вместе называются люминисценцией.

Переходы в молекулах Полосы в спектре флуоресценции сдвинуты в область больших длин волн по сравнению с полосами в спектрах поглощения тех же молекул. (Закон Стокса и Ломмеля). Спектр люминесценции симметричен спектру поглощения (правило зеркальной симметрии Левшина).

Поглощение в растворах Это соотношение известно как закон Бугера-Ламберта-Бера, являющийся основным законом светопоглощения. где A - параметр, называемый оптической плотностью поглощающей среды. Важнейшей характеристикой светопоглощающих веществ является молярный коэффициент поглощения. A = при с = 1 моль. л-1 и l = 1 см, т. е. молярный коэффициент поглощения представляет собой оптическую плотность 1 М раствора светопоглощающего вещества, помещенного в кювету с толщиной слоя 1 см. Молярный коэффициент поглощения зависит от длины волны поглощаемого света, температуры раствора, природы растворенного вещества. Значения даже наиболее интенсивно окрашенных соединений, как правило, не превышают 105.

Принцип аддитивности

Рамановская спектроскопия ¨Неупругое рассеяние излучения было предсказано Смекалом в 1923 году. ¨Впервые наблюдалось в 1928 г. C. V. Raman and K. S. Krishnan. Независимо неупругое рассеяние излучения наблюдалось Григорием Ландсбергом и Леонидом Мандельштамом. ¨Частота излучения (солнечного) менялась при прохождении через «закрещенный» фильтр.

Рамановская спектроскопия

Рамановский спектрометр

Лидары

Что может Рамановская спектроскопия? Детектировать органические молекулы в диапазоне частот 500 -2000 cm-1. Другой вариант использования определение изменений в химических соединениях. Контролировать состав анестезирующих газов во время операции. Определять состав самых различных материалов. Определять ориентацию кристаллов. Проводить неинвазивный мониторинг биологических проб.

Рамановская микроскопия позволяет исследовать: Живые клетки Полимеры Керамику Минералы Протеины При сканировании вблизи Рамановского сдвига можно контролировать распределение, например, холистирола в маленьком объеме (варианты «прямое изображение» ).

Определение распределения компонент в пробе

Контроль состава жидкости с помощью световода

TERS – Tip Enhanced Raman Scattering Гигантское усиление комбинационного рассеяния

Рамановская микроскопия сверхвысокого разрешения

Рамановская спектроскопия пропускания Основана на диффузном рассеянии в мутных жидкостях или твердых веществах. Позволяет контролировать состав таблеток в фармацевтике. Нечувствительна в качеству поверхности. Это аналитический метод, позволяющий построить градуировочные зависимости для компонентов, входящих в состав таблеток. Используется для анализа процессов в тканях груди.

Ульрафиолетовая Резонансная Рамановская спектроскопия ¨В большинстве биологических систем (в первую очередь протеины и ДНК) в ультрафиолете реализуются условия резонансного Рамановского рассеяния. ¨Эффективна при исследовании больших молекул, для которых присутствует большое количество компонент в обычном Рамановском спектре. Используется при анализе целлюлозыю

Импульсная Рамановская спектроскопия с временным разрешением ¨Эффективна для исследования быстропротекающих процессов ¨Один лазер переводит молекулу в возбужденное состояние, второй используется для формирования Рамановского рассеяния.

Рамановское рассеяние усиленное на поверхности Surface Enhanced Raman Scattering (SERS) Raman ¨Рамановское рассеяние соединения. помещенного на поверхность металла усиливается на 3 -6 порядков. ¨Наибольший эффект наблюдается на Ag, несколько меньший на Au и Cu. На 3 порядка усиливается рамановский сигнал в присутствии частиц Ni, Zn. O, In. As, Cd. Te, Zn. S, Ga. As, Pb. S, Ti. O 2. ¨Когда длина волны падающего излучения близка к плазменной длине волны в металле электроны проводимости на поверхности металла возбуждаются в поверхностное возбужденное состояние называемое плазмоном. ¨Колебательные моды молекул, находящихся на поверхности, резко усиливаются. ¨Вторая причина усиления интенсивности – формирование комплекса передающего заряд от поверхности к анализируемой молекуле. Электронные переходы этих комплексов находятся в видимой области спектра. ¨Эффект впервые был открыт на пиридине. Большое усиление наблюдается на кислород и азот содержащей ароматике. ¨Излучение должно быть в резонансе с плазменной длиной волны в металле. Для частиц серебра 5 мкм - = 382 нм. = 650 нм для Cu и Au. ¨Пределы обнаружения в растворах порядка 10 -6 Моль. ¨Для полуколичественного определения белков используют коллоидное серебро.

Вынужденное Рамановское рассеяние ¨Интенсивность излучения, требуемая для получения заметного усиления так высока (108 вт/см 2), что требуются импульсные твердотельные или эксимерные лазеры. ¨Интенсивность вынужденного комбинационного рассеяния на 5 -1 0 порядков выше интенсивности спонтанного комбинационного рассеяния. ¨При анализе биопроб отпадает необходимость в использовании флуоресцирующих меток.

Вынужденное Рамановское рассеяние

Рамановская микроскопия

Лидары Озонный лидар дифференциального поглощения OLS-100 Таблица. Длины волн трех первых стоксовых компонент H 2 и D 2, при использовании в качестве накачки излучения эксимерных лазеров. Лазер λ, нм H 2 (4156 см-1) D 2 (2986 см-1) S 1 нм S 2 нм S 3 нм S 1 нм S 2 нм Xe. Cl 308. 0 353. 2 414. 0 500. 0 339. 2 377. 4 425. 4 Kr. F 248. 6 277. 2 313. 3 360. 2 268. 5 291. 9 319. 8 Типичные лидарные сигналы. Время накопления 20 минут. Измеренный профиль концентрации озона, Москва, январь 2007. Оптимальные пары длин волн для зондиро Длины волн, нм Источник излучения 0 -3 277. 2 – 313. 3 Kr. F+H 2 3 - 12 291. 9 – 313. 3 Kr. F+H 2+D 2 12 - 45 308. 0 – 353. 2 Xe. Cl+H 2 Диапазон высот, км

Лидары Спектральная зависимость сечения поглощения озона Высотный профиль озона, полученный при накоплении 10. 000 лазерных импульсов. Измерение проводилось на длинах волн 277 - 308 нм и 292 - 308 нм.

Гибридные лидары Используются методы: аэрозольного рассеяния лазерно-индуцированной флуоресценции Рамановского рассеяния дифференциального поглощения и рассеяния как на колебательно-вращательных переходах, так и на электронных переходах. допплеровский лидар

Лидары для определения SO 2

Лидары. Пределы обнаружения

Многоволновой рамановский лидар MRL-400 В рамановском лидаре производится одновременная регистрация сигнала упругого рассеяния, а также рамановского сигнала рассеяния азота. Как следствие, становится возможным вычисление коэффициентов обратного рассеяния и экстинкции аэрозоля для различных длин волн с высокой точностью. Вычисленные коэффициенты используются для определения микрофизических параметров аэрозоля (радиуса, концентрации, показателя преломления) путем решения соответствующей обратной задачи.

Многоволновой рамановский лидар MRL-400 Каналы упругого рассеяния 355, 532, 1064 нм Каналы рамановского рассеяния азота 387, 608 нм Канал рамановского рассеяния водяного пара 408 нм Деполяризационный канал 355 нм

Флуоресцентные лидары Анализ пленок по поверхности морей, озер и океанов Анализ состояний растительности по флуоресценции хлорофилла

ИК-спектроскопия на основе диодных лазеров

Фурье спектрометр

Принципы частотной модуляции диодных лазеров с низкой (несколько к. Гц) и высокой (100 МГц) частотами

ИК-спектроскопия на основе диодных лазеров

Определение метана и формальдегида

Использование частично разрешенных компонентов вращательной структуры электронного перехода (Определение бензола)

УФ-спектр бензола в газовой фазе в области 220 – 270 нм UV-VIS Spectrophotometer TU-1901

Блок-схема и вид экспериментальной установки для оптимизации величины магнитного поля Зависимости аналитического сигнала (пропорционального дифференциальному сечению поглощения) молекул бензола и атомов ртути

Сигналы анализатора РА-915+ при введении бензола в поток воздуха

Градуировочный график зависимости аналитического сигнала от концентрации бензола

Измерение концентрации бензола (800 мг/м 3) в газе

Измерение низкой концентрации (30 нг/м 3) ртути в газе с высоким содержанием ( 800 мг/м 3) бензола

Сигнал от бензола в воздухе вблизи АЗС ПДКм. р. = 15 мг/м 3 (4, 8 ppm) ПДКс. с. = 5 мг/м 3 (1, 6 ppm)

РА-915+& РП-91 С, Полевые испытания, USA 2003

Спектрометрия ионной подвижности (Ion mobility spectrometry - IMS) Vd = K*E Время дрейфа 5 -20 мс для трубы 510 см. Для E < 1000 В/см K не зависит от E Для E > 1000 В/см K = f(E)

Спектрометрия ионной подвижности (Ion mobility spectrometry - IMS) Ионизация 1. Проба ионизуется в воздухе или азоте. 2. Для ионизации используются: - Радиоактивный распад 63 Ni - + 63 Cu - Коронный разряд - Электроспрей - Лазерная ионизация 3. 4. При увеличении концентрации М:

Спектрометрия ионной подвижности в асимметричном поле

Спектрометрия ионной подвижности в асимметричном поле Электроспрей с квадруполем

Спектрометрия ионной подвижности (Ion mobility spectrometry - IMS)

Полимеразная цепная реакция (ПЦР)

Полимеразная цепная реакция Температурный цикл Динамическая кривая ПЦР-РВ Градуировочная зависимость E = (10 -1/tg(α)-1)· 100% Зависимость количества ДНК (N) от числа проведенных термоциклов (n) α N=N 0(1+E)n, где E – эффективность амплификации, N 0 начальное содержание ДНК. 80

Термоциклирование

Методы флуоресцентного детектирования ПЦР

Конструкция микрочипа • Одноразовое использование • Удобство работы • Быстродействие и производительность • Технологичность изготовления • Теплопроводность материалов • Микрореакторы открытого типа Кремниевая пластина Алюминиевый микрочип 1 см Количество Материал Топология, Тепропроводнос микрочи столбцы×ряд микрореакторо ть, Вт/(м·K) в, шт па ы Кремний 149 Алюмини й 237 4× 4 8× 6 4× 6 5× 6 16 48 24 30 Объем микрореактора, мкл Размеры микрочипа Д×Ш×В, мм 2 1, 8 28× 24× 0, 4 28× 24× 0, 5 83

Микрочип для ПЦР

Модификация поверхности микрочипа • Гидрофильность поверхности • Предотвращение ингибирования ПЦР Кремниевый микрочип • Максимальная электронейтральность • Максимальная полярность группировок на поверхности Алюминиевый микрочип 1) Создание слоя оксида кремния 2) Модификация аналогично кремниевому микрочипу 1) Создание слоя оксида алю-миния 2) Обработка поливиниловым спиртом 85

Экспериментальная установка • Активное управление термоциклированием • Эпифлуоресцентная оптическая схема с переключением светодиодов Проведение экспрессного анализа методом мультиплексной ПЦР-РВ Схема экспериментальной установки Характеристики мультиплексной системы детектирования Канал детектировани я Возбужден ие, нм Флуоресценц ия, нм Краситель 1 480÷ 495 510÷ 530 5(6)карбоксифлуоресцеин 2 540÷ 560 580÷ 640 5(6)-карбокси-Х- 86

Мультиплексная ПЦР

Оптическая схема для мультиплексной ПЦР

Мультиплексная ПЦР в микрочипах • Снижение времени анализа • Информативность анализа • Сокращение времени проведения стадий денатурации ДНК (td) и элонгации (te) Высокая равномерность температуры Высокая скорость установления температурного равновесия Снижение времени элонгации Относительный Время пороговый цикл проведения (%) участка стадии длиной элонгации, с 600 п. о. 300 п. о. 40 100± 9 100± 2 20 95± 14 99± 2 15 74± 10 99± 2 Снижение времени элонгации Время Относительный проведени пороговый цикл я (%) участка длиной стадии элонгации, 102 п. о. 136 п. о. с 15 100± 1 100± 7 12. 5 100± 2 98± 8 10 97± 2 92± 11 Сокращение времени анализа при сохранении 95± 2 его 7. 5 90± 8 информативности возможно с использованием тест-систем с длинами амплифицируемых участков от 80 -150 п. о. 89