Определение чувствительности к АМП Для чего определять

Определение чувствительности к АМП

Для чего определять чувствительность? • Количественная оценка действия антибиотика • Интерпретация результатов – Микробиологическая: обладает ли штамм приобретенной устойчивостью? – Клиническая: будет ли лечение эффективным?

Национальные комитеты, занимающиеся вопросами определения чувствительности Комитет Страна BSAC Великобритания CA-SFM Франция CRG Нидерланды DIN Германия NWGA Норвегия SRGA Швеция CLSI (NCCLS) США Нет комитета РФ EUCAST (Европа) 3

Методика тестированияруководства 1. Национальные – BSAC, SFM, SRG, DIN, SRGA 2. Общеевропейские – EUCAST (www. eucast. org) 3. США – CLSI 4. Российская Федерация – МУК 4. 12. 189004, 2004 г (NSSLS) 5

Оценка результатов определения чувствительности к АМП Отнести штамм к категории (S, I, R) • – основано на сравнении полученных2. Основано на сравнении результатов тестирования с существующими утвержденными «пограничными значениями» (clinical breakpoints) Вероятный механизм резистентности? (подтверждающие тесты, ПЦР…) Провести экспертную оценку результатов Основана на знании механизмов резистентности и на результатах клинических исследований 6

• Изучение механизмов резистентности к АМП (в частности, молекулярно-генетические) обычно проводят в специализированных лабораториях • Различные механизмы резистентности приводят к различным фенотипам резистентности • Знания этих фенотипов могут быть полезны микробиологам: – для дифференциации штаммов во время вспышки – в отслеживании определенного фенотипа для поиска его источника (селекция путем использования или неиспользования антибиотиков в медицине и ветеринарии)

Основная характеристика антимикробной активности • Единственным достоверным критерием оценки чувствительности является значение МИКнаименьшая концентрация антибиотика (из серии разведений, подавляющая рост микроорганизма: 0. 002, 0. 004, 0. 008, 0. 015, 0. 03, 0. 06, 0. 12, 0. 25, 0. 5, 1, 2, 4, 8, 16, 32, 64, 128, 256, 512 • Все остальные фенотипические методы (дискодиффузионный, градиентные тесты, автоматизированные системы) так или иначе соотносятся с МИК ( «откалиброваны» по отношению к МИК)

Методы определения чувствительности к АМП • Фенотипические методы: основаны на измерении пограничных значений (MИК или диаметр ингибиции зоны роста) – Определение МИК (в бульоне, в агаре, E-тест, M. I. C. E. ), дискодиффузионный (BSAC, CA-SFM, CLSI, SRGA), автоматизированные системы (viteks, phoenixes, microscans) – Прогнозируют чувствительность и резистентность – Количественные • Генотипические методы: основаны на выявлении генов резистентности или их продуктов mec. A, van. B, …. PBP 2, … детекция бета-лактамаз …. – Прогнозируют резистентность, но не чувствительность – Не количественные • Дедукция – «экспертные правила» – Если есть ген mec. A, считать устойчивым ко всем бета-лактамам – Если продукция БЛРС, считать устойчивым к бета-лактамам – или нет!? – Некоторые правила прогнозируют чувствительность, другие – резистентность – Не количественные

Фенотипические методы определения чувствительности • Серийных разведений - определение МИК – В агаре – В бульоне – эталонный метод для большинства микроорганизмов • Макровариант • Микровариант – По количеству концентраций » «Длинный ряд» » По пограничным концентрациям – По способу регистрации роста » Визуально » Спектрофотометрически » По ферментативной активности • Диффузионные – Диско-диффузионный – Е-тест – определение МИК

Методы определения МИК Разведения в агаре Разведения в бульоне Микрометод разведения в бульоне Градиентный тест Bio. Merieux, Oxoid 11

Коммерческие тест-системы, основанные на серийных разведениях 1. Исключение трудоемких этапов 2. Обеспечение стандартных условий тестирования: • питательных сред • растворов антибиотиков 3. Длительные сроки хранения

E. coli – несколько антибиотиков Метод микроразведений в бульоне

Диско-диффузионный метод измерение зон ингибиции роста 14

Закономерности диффузии антибиотиков из дисков Антибиотик диффундирует в агар и создает градиент концентрации, коррелирующей с МПК

Этапы диско-диффузионного метода 1. Приготовление питательной среды: обязательно - агар Мюллера-Хинтон (для прихотливых м/о – добавление крови и др. (состав, р. Н, толщина) 2. Приготовление инокулюма 0, 5 Mc. Farland – 108 КОЕмл (м. б. другой) 3. Посев на чашки 4. Наложение дисков (содержание препарата в диске, хранение…) 5. Инкубация +35 о. С 6. Правило 15 -15 -15 Стандартизация!!! 16

Приготовление инокулюма Взять несколько морфологически сходных изолированных колоний с неселективной среды Суспендировать в физ. р-ре с помощью петли или ватного стерильного тампона

Инокулюм – 0, 5 Мак. Фарланд Довести мутность инокулюма до 0, 5 МФ: добавляя физ. раствор или культуру Сравнивать мутность с эталоном или измеряя на приборе. 18

Нанесение инокулюма на чашку Смочить ватный тампон в инокулюме, отжать о стенку пробирки, нанести в трех направлениях на чашку Инокуляция в течение 15 мин

Наложение дисков на чашку Хранение дисков – при 4 -8 о. С в контейнере с влагопоглотителем, в защищенном от света месте Перед нанесением – подержать при комнатной температуре Не использовать просроченные диски! Нанесение – вручную или диспенсер В течение 15 мин после инокуляции чашки Диски не ближе 3 см друг от друга, чтобы зоны не перекрывались Не передвигать!

Рост должен быть сливной, не должны быть видны изолированные колонии Правильный посев Не правильный посев!

Е-тест Аналогично тестированию диско-диффузионным методом. Вместо диска с антибиотиком используют полоску Е-теста, содержащую градиент концентраций антибиотика от максимальной к минимальной.

Учет результата Е-теста В месте пересечения эллипсовидной зоны подавления роста с полоской Е-теста получают значение МИК

Внутренний контроль качества • Интегральный контроль (все условия тестирования) • • • E. coli ATCC 25922, P. aeruginosa ATCC 27853 S. aureus ATCC 25923 E. faecalis ATCC 29212 S. pneumoniae ATCC 49619 H. influenzae ATCC 49247 или ATCC 10211, N. gonorrhoeae ATCC 49226 E. coli ATCC 25 922 K. pneumoniae АТСС 700603 (продукция БЛРС) 24

Категории - Чувствительный штамм - S рост подавляется in vitro при концентрациях АМП, создающихся в органах и тканях при рекомендуемых режимах дозирования препарата; высокая вероятность успешного этиотропного лечения - Штамм с промежуточный чувствительностью - I рост подавляется in vitro при более высоких концентрациях АМП, чем для чувствительного штамма, но в пределах, достижимых при рекомендованных режимах дозирования; лечение м. б. эффективно при использовании повышенных доз или при локализации инфекции в местах с повышенной концентрацией АМП (например, МВП) - Устойчивый (резистентный) –R рост in vitro не подавляется при концентрациях АМП, которые создаются в организме человека при рекомендованных режимах дозирования; штамм обладает механизмами резистентности; лечение инфекции, скорее всего, будет неэффективно 25

Оценка результатов определения чувствительности к АМП Отнести штамм к категории (S, I, R) • – основано на сравнении полученных2. Основано на сравнении результатов тестирования с существующими утвержденными «пограничными значениями» (clinical breakpoints) Вероятный механизм резистентности? (подтверждающие тесты, ПЦР…) Провести экспертную оценку результатов Основана на знании механизмов резистентности и на результатах клинических исследований 26

Автоматизированные системы сводят к минимуму «человеческий фактор» , дает экспертную оценку результатов - Phoenix, BD - Vitek 2, BM - Microscan, Siemens 27

Сдерживание резистентности в стационаре Микробиолог Клинический фармаколог СИСТЕМА ИНФЕКЦИОННОГО КОНТРОЛЯ ИК Лечащий врач Эпидемиолог

Пути решения проблемы резистентности в стационарах • Микробиологический мониторинг за возбудителями и чувствительностью к АМП • Контроль за использованием антибиотиков в стационаре, снижение частоты их нерационального применения ограничивают появление, селекцию и распространение резистентных штаммов микроорганизмов. • Строгое соблюдение основных мероприятий инфекционного контроля - обработка рук и объектов окружающей среды стационара, для того чтобы предотвратить распространение резистентных микроорганизмов , которые могут появляться в стационаре или поступать вместе с новыми пациентами. • Быстрое выявление и изоляция источника резистентных штаммов, которыми могут быть персонал и пациенты (уже находящиеся в стационаре и вновь поступающие )

Проблемы в лабораторной диагностике патогенных энтеробактерий Эшерихиозы Егорова С. А. Санкт-Петербургский НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Пастера

Возбудители острых кишечных инфекций Патогенные энтеробактерии: - Сальмонеллы, включая возбудителя брюшного тифа - Шигеллы (шигеллезы, дизентерия) - Эшерихии (эшерихиозы дизентериеподобные, холероподобные и др. ) - Кампилобактеры (кампилобактериоз) - Clostridium difficile - Условно-патогенные микроорганизмы (энтеробактерии – клебсиеллы? , цитробактер? , протей, E. sakazakii) Вирусы • • Ротавирусы Норовирусы Астровирусы Аденовирусы

Эволюция спектра приоритетных и появление «новых» возбудителей пищевых заболеваний • начало 20 -го века - брюшной тиф, туберкулез, бруцеллез зоонозные стрептококковые инфекции, трихинеллез; • С 1940 -х до 1959 г. - S. aureus, Salmonella (вкл. Typhi и Paratyphi), Сl. botulinum (типы А и В), Shigella spp; • 1959 – 1970 гг. - Сl. perfringens, Bac. cereus, Vibrio cholerae (не-01), Сl. botulinum (тип Е, ботулизм младенцев), гепатит А; • 1971 – 1980 гг. – Vibrio parahaemolyticus, E. coli O 124: H 17, O 27: H 20, Vibrio vulnificus, Yersinia enterocolitica, Vibrio cholerae O 1, Campylobacter jejuni; • 1981 -2000 гг. – E. coli O 157: H 7, Listeria monocytogenes, S. Enteritidis, S. Typhimurium DT 104, Ent. sakazakii, норовирусы, прионы • • 2001 – 2010 гг. – вирус гепатита Е, высокопатогенные вирусы гриппа А/H 1 N 1 2011 г. - E. coli O 104: H 4

Динамика заболеваемости ОКИ установленной и неустановленной этиологии в С-Пб (1999 -2012 гг. , на 100 тыс. населения)

Структура ОКИ в Санкт-Петербурге в 2009 -2011 гг. и январе-апреле 2012 г. 2009 январь-апрель 2012

Структура ОКИ УЭ (%) 2009 2010 40 46 54 60 январь-апрель 2012 2011 ОКИ УЭ вирусной этиологии 29 38 62 71 ОКИ УЭ бактериальной этиологии

Нормативно – методические документы • 2. 5. Приказ Минздрава СССР от 24. 04. 1985 № 535 "Об унификации микробиологических (бактериологических) методов исследования, применяемых в клинико-диагностических лабораториях лечебнопрофилактических учреждений". • 2. 15. Методические указания «МУ № 04 -723/3 от 17. 12. 84 г «По микробиологической диагностике заболеваний, вызываемых энтеробактериями» . • 2. 7. Сан. Пи. Н 2. 3. 2. 1078 -01 "Гигиенические требования к безопасности и пищевой ценности пищевых продуктов". • 2. 12. МУК 4. 2. 2812 -11, Москва, 2011, «Методы выявления и идентификации патогенных бактерий – возбудителей инфекционных заболеваний с пищевым путем передачи в продуктах питания на основе ПЦР с гибридизационнофлуоресцентной детекцией» • 2. 13. МУ 1. 3. 2569 -09 «Организация работы лаборатории, использующих методы амплификации НК при работе с материалом, содержащим микроорганизмы I-IYгрупп патогенности» .

Возбудитель Среда обогащения Диф-диагностич. среды Оборудование Salmonella + ВСА, SS-агар, Хектоен-агар и др. +37 о. С Shigella spp. нет Среда Плоскирева, SS-агар +37 о. С Диареегенные эшерихии нет Эндо, Мак. Конки с сорбитом для О 157 +37 о. С Campylobacter spp. нет КА с селективными добавками АМП+ свежая цитратная кровь +42 о. С, +37 о. С, микроаэрофильные условия «холодовое обогащение» в пептоннокалиевой среде Эндо, Хиттингера, СБТС +4 о. С +26 о. С - Выявление токсина - ИФА, ПЦР Yersinia enterocolitica Cl. difficile Пищевые токсикоинфекции: нет Большое число разное Другие Enterobacteriacae нет Большое число разное S. aureus есть ЖСА +37 о. С B. cereus, vibrio//и др нет есть Различные режимы

Возбудители ОКЗ относятся к 17 семействам и 33 родам микроорганизмов Здравоохранение диагностирует небольшое число возбудителей – тех, которые способны к широкому эпидемическому распространению Патогенные энтеробактерии (Salmonella, Shigella, ЭПКП) – в обязательном порядке, остальные возбудители (Campylobacter, вирусы и др. )– клиницист должен отдельно указать в направлении

Эшерихиозы • объединяют большую группу заболеваний, вызываемых микроорганизмами рода Escherichia • Чаще протекают как ОКИ (диареегенные эшерихии) • Более редкие формы эшерихиозов с внекишечной локализацией или генерализованные, возникают чаще как внутрибольничные

Эшерихии вызывают Группа эшерихий (международный центр по эшерихиям) Инфекции 1. Диареегенные - Diarrheagenic E coli Кишечные инфекции 2. Внекишечные - Еxtraintestinal pathogenic E coli, в том числе: Инфекции внекишечной локализации: - Уропатогенные (Uropathogenic E coli) - вызывающие менингиты новорожденных (Newborn meningitic E coli) - ассоциированные с сепсисом (Septiceamia associated pathogenic E coli) менингит , сепсис, энцефалит, множественный неврит, пиелонефрит, цистит, холецистит, перитонит, аппендицит, панкреатит, пневмония, бронхиальная астма, назофарингит, отит, конъюнктивит, офтальмит, тиреоидит, пиемические, септикопиемические и токсикосептические осложнения; выделяются при раневых, а также ожоговых заболеваниях, у хирургических больных и при особых формах шизофрении.

Классификация E. coli, вызывающих ОКИ (диареегенных эшерихий) 1. Энтеропатогенные E. coli 2. Энтеротоксигенные E. coli 3. Энтерогеморрагические E. coli 4. Энтероинвазивные E. coli 5. Энтероаггрегативные E. coli 6. Диффузно-адгерентные E. coli (EPEC), (ETEC), (EHEC), (EIEC), (EAg. EC), (DAEC). различаются по ключевым механизмам патогенеза и наличию специфических факторов вирулентности, делающих возможной реализацию этих механизмов

Как возбудители ОКИ E. coli разделяют на следующие группы: • Энтеропатогенные (EPEC) - ОКИ у детей раннего возраста • Энтероинвазивные (EIEC) – дизентериеподобные ОКИ у детей и взрослых • Энтеротоксигенные (ETEC) - холероподобные ОКИ у детей и взрослых • Энтерогеморрагические (EHEC) – гемоколиты с возможным развитием ГУС • Энтероаггрегативные (EAEC) и Диффузно-агрегативные (ДАЕС) ОКИ у больных с ослабленной иммунной системой

Серологическая характеристика E. coli • О-антиген, соматический, липополисахарид (серогруппа) • Н-антиген, жгутиковый, белок флагеллин (серотип) E. coli O 157: H 7 • К-антиген, капсульный, полисахарид • В одной О-серогруппе могут быть «патогенные» и «непатогенные» серотипы

Диареегенные E. coli • В список возбудителей ОКИ включены: - 43 О-серогруппы - 57 О-Н-вариантов (серотипов) • Список постоянно пополняется • в России пополняется очень медленно! За последние 10 лет – 2 возбудителя О 157 и О 104

Спектр выделяемых эшерихий

Распределение штаммов E. coli О 1 и E. coli О 144 по группам обследованных лиц в Санкт-Петербурге и Ленинградской области

Факторы вирулентности диареегенных эшерихий Токсины : термо лабильный стабильный ETEC EPEC EHEC еae Белок интимин (адгезия) Шигаподобные токсины Адгезины Инвазины agg. R, asp. U + + +/- + EIEC EAEC DAEC Адгезины afa, daa + + +

Диагностика эшерихиозов (дифференцировка патогенных эшерихий) • • • Выявление факторов вирулентности Детекция генов вирулентности Определение антигенных маркеров (серотипирование)

Группа энтерогеморрагических эшерихий (ЭГКП, EHEC, VTEC, STEC) E. coli, продуцирующие веротоксин (вероцитотоксин) или шига-подобный токсин и названы энтерогеморрагическими по способности вызывать гемоколиты у людей

Факторы вирулентности EHEC • Шига-подобный токсин – развитие гемолитикоуремического синдрома • Белок интимин (eae) – адгезия к клеткам кишечного эпителия В группе EHEC выделяют: типичные, классические EHEC (Шига-токсин + интимин) Не типичные EHEC (Шига-токсин продуцирующие E. coli - VTEC, STEC)

Серотипы энтерогеморрагических E. coli – EHEC, вызывающие ОКИ • О 1: Н-; O 1: H 20; O 2: H-; О 2: Н 5; О 2: Н 7; O 2: H 29; O 2: H 39; O 4: H-; О 4: Н 10; О 5: Н-; О 5: Н 16; О 6: Н 1; O 6: H 34; O 7: H 4; O 8: H 19; O 15: H-; O 15: H 27; O 18: H-; O 18: H 7; O 18: H 11; O 18: H? ; O 22: H 8; O 22: H 16; O 25: H-; O 26: H 11; O 26: H 32; O 38: H 21; O 39: H 4; O 40: H 8; O 43: H 2; O 45: H 2; O 46: H 31; O 46: H 38; O 46: H? ; O 48: H 21; O 49: H-; O 50: H 7; O 50: H-; O 55: H 7; O 55: H 10; O 65: H 16; O 69: H 11; O 74: H? ; O 76: H 19; O 76: H 25; O 76: H? ; O 80: H-; O 82: H 8; O 84: H 2; O 84: H-; O 84: H? ; O 91: H-; O 91: H 10; O 91: H 14; O 91: H 21; O 91: H 7; O 98: H 25; O 98: H-; O 101: H 19; O 103: H 2; O 103: H? ; O 103: H-; О 104: Н 4, O 111: H 2; O 111: H 8; O 111: H 11; O 111: H 30; O 111: H 34; O 111: H-; O 111: H? ; 112 ab: 2; O 113: H 2; O 113: H 14; O 113: H 7; O 113: H 21; O 113: H-; O 114: H 48; O 115: H 8; O 115: H 10; O 115: H 18; O 116: H 21; O 116: H-; O 117: H 4; O 118: H 12; O 118: H 16; O 118: H 30; O 118: H-; O 121: H 7; O 121: H 19; O 125: H-; O 125: H 8; O 126: H-; O 126: H 8; O 128: H 2; O 128: H 8; O 128: H 12; O 128: H 25; O 128: H-; O 157: H-; O 157: H 7; O 163: H 19; O 165: H 19; O 126: H 8; O 128: H 2; O 128: H 8; O 165: H 25; O 165: H-;

Энтерогеморрагические эшерихии E. coli O 157: H 7, О 26, O 55, О 111, О 113 и др. • Распространены повсеместно • В США входит в четверку часто выделяющихся (15 -18% гемоколитов) • В разных странах доля в этиологии ОКИ составляет от 0, 6 до 2, 4% • Среди гемоколитов – от 15 до 36% (данные Парижского института Пастера, результаты научных программ надзора и др. )

ЭГКП-инфекция • Клиническим проявлением инфекции возбудителей, входящих в группу ЭГКП является: • Гемоколит: диарея с кровью (от прожилок до +++) • Боли в животе • Тяжелое осложнение – гемолитико-уремический синдром (ГУС), грозящее развитием острой почечной недостаточности, может возникнуть уже после прекращения диареи.

Гемолитико-уремический синдром (ГУС, HUS) • Характерные симптомы: - Острая почечная недостаточность (уремия) - Гемолитическая анемия - Низкое число тромбоцитов (тромбоцитопения) • После ЭГКП-ОКИ –у 10% развивается ГУС; у 5% - летальность • ГУС может приводить к неврологическим осложнениям (судороги, инсульт, кома) у 25% пациентов

ВОЗ, 1998 г. ЭГКП-инфекция возникает как спорадические случаи и «время от времени» возникают вспышки. Некоторые из вспышек охватывают большое количество случаев заболевания Япония 1996 г. Вспышка связана с употреблением в пищу зараженных ростков редиса, входивших в школьные завтраки. Заболели 9 тысяч 451 человек

Энтерогеморрагические эшерихии Источники: • животные (КРС, свиньи, овцы, куры, индейки) – от 1 до 5% • Животные болеют? Только носители? • Человек (больной? носитель? )

Фекально-оральный механизм передачи Пути передачи: • Пищевой • Водный • Контактный (от человека к человеку через продукты и предметы быта, от животных)- редко

Основной путь передачи – пищевой • В зарегистрированных вспышках факторами передачи служили продукты животного происхождения, приготовленные из фарша (гамбургеры, бифштексы, ростбифы), прошедшие недостаточную термическую обработку, молоко • В Японии - морепродукты • все большее количество вспышек связано с употреблением в пищу фруктов и овощей (ростков, латука, капусты, салатов), заражение которых происходит, результате контакта с фекалиями домашних и диких животных на какой-либо стадии их культивирования или обработки.

О 104: Н 21 вспышка гемоколита в США (Мантана 1994 г. ) • Эпидемиологическое расследование показало, что фактором передачи послужило молоко одного производителя, которое было контаминировано возбудителем EHEC О 104: Н 21 после пастеризации • Авторы не исключают, что источниками этих штаммов были животные – коровы.

Вспышка E. coli O 104: H 4 в 2011 г. С 8 мая по 17 июля 2011 г. (70 дней) в двух европейских странах (Германия и Франция) были зарегистрированы вспышки ОКИ с пищевым путем передачи, обусловленные E. coli O 104: H 4 (E. coli O 104: К 9: H 4)

Вспышка E. coli O 104: H 4 в 2011 г. • По данным ВОЗ и Европейского Центра по Контролю за заболеваниями (ECDC) на 22. 07. 2011 г. общее число заболевших в Германии, Франции, в других странах Евросоюза и за его пределами достигло 4075 человек, из них 50 – со смертельным исходом

Вспышка E. coli O 104: H 4 в 2011 г. • Эпидемиологические данные свидетельствовали, что вспышку, возникшую в Германии, по эпидемиологическим параметрам можно трактовать как эпидемию. • Пик регистрации случаев заболеваний приходился на 22 мая, когда вспышка была официально зарегистрирована.

Вспышка в Германии в мае-июле 2011 г • Необычно большая вспышка необычно тяжелого «пищевого» заболевания, вызванная новым штаммом STEC E. coli O 104: H 4 • Среди заболевших необычайно много взрослых, особенно женщин • Высокий % тяжелых осложнений; гемолитико-уремический синдром (HUS) • ~23% случаев сопровождались HUS; обычно - не более 10% • 16 стран Европы и Северной Америки: 3983 случаев, 55 умерших (1. 4%) • HUS - 908, включая 37 умерших (4. 1%) • Без HUS - 3075, включая 18 умерших (0. 6%) • Германия • 2987 случаев EHEC-инфекции, включая 18 умерших • 855 случаев HUS, включая 35 умерших • Почти все заболевшие посещали или жили в Германии в течение инкубационного периода; или были другим образом связаны со вспышкой в Германии 15 случаев были частью группового заболевания (кластера) во Франции • 12 других европейских стран зарегистрировали: Австрия (1 HUS, 4 EHEC); Чешская республика (0, 1); Дания (10, 16); Греция (0, 1); Люксембург (1, 1); Нидерланды (4, 7); Норвегия (0, 1); Польша (2, 1); Испания (1, 1); Швеция (18, 35 (1 умерший)); Швейцария (0, 5); UK (3, 4) • Канада: 1 случай EHEC • США: 2 случая EHEC и 4 HUS (1 умерший)

Число случаев инфекции (ВОЗ, 7. 06. 11) Страна Число случаев ГУС Число случаев ЭГКП 689 (35%) 1959 Австрия 0 2 Дания 8 12 Испания 1 1 Люксембург 0 1 Нидерланды 4 2 Норвегия 0 1 Польша 2 0 Великобритания 3 8 Франция 0 2 Чешская республика 0 1 Швейцария 0 3 Швеция 15 31 Канада 0 1 США 3 1 Германия

Вспышка E. coli O 104: H 4 в 2011 г. • Большинство пациентов выздоравливали в течение 10 дней, но у некоторых пациентов болезнь принимала тяжелую форму с угрозой для жизни (развитие осложнений – ГУС или ТПП). • Ежедневно в отдельных регионах заболевало по несколько десятков человек. • Многие нуждались в интенсивной терапии

Возбудитель - EHEC О 104: Н 4 Факторы вирулентности: 1. Продукция Шига токсина 2 (ген stx 2 a- vtx 2 a) 2. Фактор адгезии -белок интимин (еае-ген)- отсутствует, 3. Энтерогемолизин (hly –ген) – отсутствует 4. Фактор адгезии Eagg. EC (aat. A, agg. R, aap), гены которых расположены на плазмиде вирулентности; Продукция БЛРС: CTX-M 1; CTX-M 15 типа, TEM резистентны к цефалоспоринам 3 поколения, стрептомицину, тетрациклину, ко-тримоксазолу, налидиксовой кислоте

Характеристика возбудителя E. coli О 104: Н 4 E. coli выделенные в Германии и Франции принадлежали к серогруппе О 104 (серотип О 104: Н 4) имели ген, кодирующий продукцию шига-токсина 2 (stx 2), характерного для EHEC. В отличие от типичных EHEC у них отсутствовали гены, ответственные за адгезию (eae и hly. А), эти свойства им обеспечивали гены, кодирующие факторы адгезии E. coli группы ЕАЕС (гены aat. A, agg. R, aap, agg. A и agg. C). Результаты молекулярно-генетических исследований показали, что «вспышечный» штамм по происхождению относится к группе энтероаггрегативных E. coli (EAEC) и получил способность продуцировать шига-токсин в результате интеграции бактериофага в бактериальный геном.

Вспышка E. coli O 104: H 4 в 2011 г. • Эпидрасследование, проведенное на основе когортного исследования, позволило ретроспективно с высокой степенью вероятности выявить фактор передачи в двух вспышках (Германии и Франции) – ростки фенугрека, которые применяли в качестве добавок к различным салатам. • Дальнейшее расследование показало, что вспышки в Германии и Франции связаны с одной партией семян фенугрека, поступившей из Египта от одного экспортера. (в 2010 г. Евросоюз импортировал из Египта около 49, 000 тонн различных семян).

Другие названия фактора передачи • Пажитник сенной в виде пряности выступает в кухнях разных стран под различными именами: фенугрек, фенум-грек, фенигрекова трава, греческое сено, греческий козий трилистник, греческая сочевица, треуголка, верблюжья трава. • ШАМБАЛА - Излюбленное растение индийцев носит имя легендарной страны, в которой хранятся высшие тайны тантризма и буддизма, что призывает к уважительному и внимательному отношению к этому растению. • Однолетнее травянистое растение семейства бобовых. Стебель малоразветвленный, высотой 50 -60 см. Цветки мелкие, желтые. Семена ромбовидной формы, мелкие, длиной 4 мм, коричневожелтые. Плоды образуются в стручках треугольной формы, цвет, не более 20 штук в стручке. • В пищу используют листья и нежные стебли.

Фактор передачи • Пажитник – основной компонент смеси “карри”, входит в состав смесей «куркума» , «хмели-сунели» , «аджики» , «кленового сиропа» . • В США пажитником ароматизируют ром и кленовый напиток, иногда добавляют в тесто. • В Индии из обжаренных семян готовят суррогатный кофе. Из молодых растений готовят салат. • Семена проращивают для получения зеленых ростков, которые добавляют в салаты.

Фактор передачи • В Германии контаминированные ростки фенугрека поступили из сельскохозяйственного предприятия в Нижней Саксонии, что соответствует географическому распространению случаев заболеваний в Германии. E. coli O 104: Н 4 была выделена из ростков на этом предприятии. • В Германии при расследовании семейного очага ОКИ из сырых ростков фенугрека были выделены штаммы E. coli O 104: Н 4, идентичные возбудителю, вызвавшему заболевания. Эти ростки были пророщены в домашних условиях, из семян фенугрека, приобретенных в розничной сети. • Возникновение во Франции группового заболевания ОКИ с ГУС E. coli O 104: H 4 было также связано с употреблением проростков фенугрека

Мероприятия • Были реализованы меры по изъятию из продажи и уничтожению всех партий семян фенугрека, импортированных в период с 2009 по 2011 гг. , а также приостановлен импорт семян фенугрека и других семян из Египта до 31. 10. 2011 г.

Энтерогеморрагические эшерихии • Лабораторная диагностика EHEC – традиционная для энтеробактерий. Используется комплекс методов: • Бактериологический – выделение чистой культуры E. coli • Подтверждение, что эшерихия (культуральноферментативно, морфологически) - нормофлора !!! • Подтверждение О-группы (сыворотки к О антигену) • Обязательно подтвердить продукцию токсинов (иммунохроматографическим методом или мол-ген – ПЦР) Т. к. штаммы, не продуцирующие токсинов, не могут считаться достоверными возбудителями эшерихиозов у людей • Детекция генов EHEC в материале

Энтерогеморрагические эшерихии • Как определить продукцию шигаподобных токсинов? • ПЦР (наличие генов) –есть утвержденные праймеры • Культура клеток (Vero, He. La) • Экспериментальные модели (лабораторные животные) • Экспресс-метод (иммунохроматографические тесты) • Переслать в референс лаборатории НИИ страны • В России ЦНИИЭ • Исследования на продукцию Шига- токсина или кодирующих его генов, значительно улучшают лабораторную диагностику EHEC.

• Методы «классической» бактериологии, включая характеристику серогруппы и серотипа эшерихий, не позволяют проводить полноценную диагностику эшерихиозов. • Для обоснования этиологической значимости выделенных эшерихий необходимо выявление у них факторов вирулентности (факторов адгезии, токсинов, инвазинов) • Фенотипическое выявление факторов вирулентности: экспериментальные модели, иммунохроматографические тесты (шига-подобный токсин) • Внедрение молекулярно-генетических методов детекции факторов вирулентности позволяет подтвердить истинную патогенность штамма (ПЦР, ПЦР в реальном времени).

Молекулярно-генетические исследования • Эпидемиологический надзор, лабораторная диагностика и профилактика норовирусной инфекции. Методические указания МУ 3. 1. 1. 2969 -11 • Эпидемиологический надзор, лабораторная диагностика и профилактика ротавирусной инфекции. Методические указания МУ 3. 1. 1. 2957 -11 • Порядок применения молекулярно-генетических методов при обследовании очагов острых кишечных инфекций с групповой заболеваемостью. Методические указания МУК 4. 2. 2746 -10 • Методические указания по лабораторной диагностике заболеваний, вызываемых Escherichia coli, продуцирующих шига-токсины (STECкультуры), и обнаружению возбудителей STEC-инфекций в пищевых продуктах. Методические указания МУК 4. 2. 2963 -11

Выявление РНК и ДНК возбудителей ОКИ в объектах окружающей среды и клиническом материале методом ПЦР (Интерлабсервис) Мульти-детекция: • Ампли. Сенс® Shigella spp. и EIEC/Salmonella spp. /Campylobacter spp. -FL - 4 • Ампли. Сенс® Rotavirus/Norovirus/Astrovirus-FL - ротавирусов группы А (Rotavirus A), норовирусов 2 генотипа (Norovirus 2 генотип) -3 • "Ампли. Сенс® ОКИ скрин-FL «- Shigella spp. , EIEC, Salmonella spp. , Campylobacter spp. , Adenovirus F, Rotavirus A, Norovirus 2 генотип и Astrovirus – 8 Детекция отдельных возбудителей • • Ампли. Сенс Rotavirus-Eph Ампли. Сенс Norovirus 1, 2 genotypes-Eph Ампли. Сенс® Эшерихиозы-FL Ампли. Сенс® Yersinia enterocolitica / pseudotuberculosis-FL Ампли. Сенс® Shigella spp. и EIEC-Eph Ампли. Сенс Salmonella spp. -Eph Ампли. Сенс Clostridium difficile-EPh

Детекция патогенных микроорганизмов увеличилась в 12 раз ! Данные инфекционной больницы № 30 «Классическое» бактериологическое обследование 4, 6% Современная диагностика ОКИ Молекулярно-генетические методы 59%

Типирование микроорганизмов

• Типирование- выявление сходства и различия штаммов микроорганизмов одного вида • Генотипирование и молекулярное маркирование микроорганизмов основные методические направления современной молекулярной эпидемиологии и эпизоотологии.

Типирование. Фенотипические методы - биохимическое типирование по способности к утилизации определенных субстратов - гемолиз на плотных питательных средах с кровью - серотипирование по наличию общих антигенных детерминант (сальмонеллы, эшерихии, шигеллы) - типирование по спектру антибиотикорезистентности (по антибиотикограмме) - фаготипирование по чувствительности к бактериофагам - бактериоцинотипирование (для шигелл) - Мультилокусный электрофорез ферментов «домашнего хозяйства» - MLEE (multilocus enzyme electrophoresis) - Получение «карты» белковых масс или белкового спектра микроорганизма методом MALDI-TOF

Недостатки фенотипических методов типирования • Невозможность оценить эволюционные связи в бактериальной популяции • Трудоемкость, недостаточная воспроизводимость • Методы ориентированы на типирование микроорганизмов в пределах одного вида (фаготипирование стафилококков, серотипирование сальмонелл) • Фенотип не всегда соответствует генотипу • Одинаковый спектр резистентности может быть у штаммов не только одного, но и разных видов.

Молекулярно-генетическое типирование (генотипирование) Секвенирование ДНК Без секвенирования ДНК Секвенирование отдельных локусов ДНК: Мультилокусный анализ числа тандемных повторов (MLVA, multilocus variable number tandem repeat (VNTR) analysis) spa-типирование S. aureus – по гену белка А Гель-электрофорез в пульсирующем поле (PFGE, Pulse Field Gel Electrophoresis) Мультилокусное секвенирование (MLST, Multi Locus Sequence Typing) Анализ длин рестрикционных фрагментов (RFLP, restriction fragment length polymorphism) Мультилокусный анализ числа тандемных Метод ДНК-чипов (гибридизация ДНК повторов (MLVA, multilocus variable микроорганизма с специфичными ДНКnumber tandem repeat (VNTR) analysis) зондами) Полногеномное секвенирование ПЦР-фингерпринтинг (амплификация со случайными праймерами) Изучение рестрикционного профиля плазмид

Гель-электрофорез в пульсирующем поле (PFGE, Pulse Field Gel Electrophoresis) • Анализ всей ДНК микроорганизма • Разделяет фрагменты ДНК с высокой молекулярной массой, образующиеся при использовании редкощепящих рестриктаз • Высокая разрешающая способность • База данных Pulse. Net • Недостатки: высокая трудоемкость, высокая стандартизация всех процедур, сложности интерпретации результатов

Результаты генотипирования

Мультилокусный анализ числа тандемных повторов (MLVA, multilocus variable number tandem repeat (VNTR) analysis) • Выявление в геноме микроорганизма фрагментов ДНК, состоящих из повторяющихся нуклеотидных последовательностей (тандемных повторов) • Число таких повторов у разных штаммов одного вида может значительно варьировать. • Определение числа повторов: либо определяя размер таких фрагментов ДНК в электрофорезе, либо секвенируя последовательность ДНК. • Генотип – в виде цифровой комбинации (например, 2 -10 -4 -8 -7 -0) • Международная базы данных тандемных повторов

Мультилокусное секвенирование (MLST, Multi Locus Sequence Typing) • Секвенирование (определение нуклеотидной последовательности) генов «домашнего хозяйства» • Гены «домашнего хозяйства» 6 -7 генов, характерные для микроорганизмов данного вида; характеризуются медленным накоплением мутаций; селективно нейтральные • Генотип ( «сиквенс-тип» )- определяется по набору генов • База данных различных видов микроорганизмов