ОНКОМИР РАК И МИКРОРНК Н Н Колесников

ОНКОМИР РАК И МИКРОРНК Н. Н. Колесников Институт молекулярной и клеточной биологии СО РАН, Новосибирск 2013

История открытия и развития исследований по микро. РНК

Функция микро. РНК – контроль и регуляция экспрессии белок кодирующих генов • • Микро. РНК – негативный регулятор экпрессии генов на посттранкрипционном уровне Один белок кодирующий ген может регулироваться десятками разных микро. РНК Одна микро. РНК может регулировать работу более сотни разных генов Микро. РНК как онкогены и супрессоры опухолей

Циркулирующие микро. РНК в плазме/сыворотке крови в составе экзосом, микровезикул и других комплексов • Стабильность • Селективная секреция • Регуляция процессов в микроокружении и в отдаленных тканях • Иммунномодуляция • Потенциальные маркеры ранней неинвазивной диагностики рака.

Выбранные ми. РНК ми. Р-21 – хронологически первая идентифицированная ми. РНК. Является сильным онкогеном. Её экспрессия увеличивается в большинстве солидных опухолей. Увеличивает пролиферативную и инвазивную активность опухолевых клеток. ми. Р-221, ми. Р-222 – онкогенные ми. РНК, индуцирующие ангиогенез и пролиферацию раковых клеток. ми. Р-155 – продемонстрировано участие этой ми. РНК в инициации как врожденного, так и адаптивного иммунных ответов, а также в развитии иммунной системы в целом. Некоторые работы свидетельствуют об участии ми. Р 155 в онкогенезе различной этиологии. ми. Р-205 – супрессор опухолевого роста, показано, что в случае некоторых видов опухолей ми. Р 205 индуцирует апоптоз и тормозит рост опухоли. Признаки раковой клетки: Автономия ростовых сигнальных путей : Самодостаточность в ростовых сигналах: раковые клетки продуцируют свои собственные ростовые сигналы и способны к пролиферации без внешних стимулов. Невосприимчивость к антиростовым сигналам: Раковые клетки уклоняются от воздействия антиростовых стоп-сигналов для того, чтобы пролиферировать. Избегание апоптоза: Опухолевые клетки уклоняются от апоптоза. Стабильный ангиогенез: Раковые клетки индуцируют и обеспечивают рост новых кровеносных сосудов. Неограниченный потенциал репликации: ДНК опухолевых клеток может воспроизводиться неограниченное число раз. Инвазия в другие ткани и метастазирование: Опухолевая масса порождает клетки-первопроходцы, колонизирующих места в организме с неограниченным питанием и пространством.

ОНКОМИР. Микро. РНК в канцерогенезе • • • Общие цели: - изучение роли микро. РНК в молекулярных механизмах в норме и при нарушениях нормальной физиологии клеток, лежащих в основе разных патологических состояний. - установление диагностической значимости профилей микро. РНК ассоциированных с онкологическими заболеваниями. - создание новых методов диагностики, контроля лечения и прогноза онкологических заболеваний человека. - разработка подходов создания комбинированной диагностики онкологических патологий с использованием платформ микро. РНК и соматических мутаций. Задача № 1. Определить вариацию уровней экспрессии микро. РНК в разных гистопатологических типах опухолей щитовидной и молочной желез, головного мозга сравнительно с условно нормальными клетками. Задача № 2. Установить диагностические значения в норме и при патологии. Задача № 3. Отличать состояния «рак» и «отсутствие рака» Задача № 4. Выявить маркеры, связанные с риском злокачественной трансформации

Методический подход определения уровня экспрессии микро. РНК в раковых клетках vs прилежащих нормальных клеток у одного пациента. mi. R-155 Условная норма mi. R-205 mi. R-21 mi. R-222 U 6 Схема детекции ми. РНК с помощью обратной транскрипции и ПЦР в реальном времени Опухоль vs Норма опухоль 2^(-dd. Ct) mi. R-155 0, 933033 mi. R-205 1, 310393 mi. R-21 1 mi. R-221 0, 521233 mi. R-222 0, 473029 7

Разработка подходов и создание прообраза диагностической панели на основе микро. РНК. • ПРИМЕНЕНИЕ диагностической панели на основе микро. РНК • Ранняя диагностика • Определение гистотипа опухоли, стадии развития, потенциала к метастазированию • Контроль эффекта терапевтического воздействия (химио и радиотерапия) • Прогностическое значение выживаемости • Потенциальная терапия

Всего - 70 Всего - 77 Всего - 183

Микро. РНК при папиллярном раке и коллоидном узле щитовидной железы Уровень экспрессии, усл. единицы Сравнение уровней экспрессии микро. РНК при папиллярном раке и коллоидном узле 50 45 40 35 Коллоидный узел 30 Папиллярный рак 25 20 15 10 5 0 mi. R-21 mi. R-222 mi. R-155 mi. R-205 микро. РНК 10

Микро. РНК при фолликулярной аденоме и фолликулярном раке 60 40 Фолликулярная аденома 20 Фолликулярный рак 0 mi. R 21 mi. R 222 mi. R 155 mi. R 205 -20 11

Глиомы

Мир-21 в доброкачественных и злокачественных опухолях ГМ, ЩЖ и МЖ

Мир-205 в доброкачественных и злокачественных опухолях ГМ, ЩЖ и МЖ

Микро. РНК в доброкачественных и злокачественных опухолях ГМ, ЩЖ и МЖ

При объединении классов «аденома» и «ОПП» точность метода C 4. 5 была значительно увеличена. Заболевание чувствительность Матрица несоответствий специфичность общая точно сть ОПП/аденома 0. 975 0. 962 0. 970 карцинома 0. 962 0. 975 0. 970 ОПП/аденом а карцинома Общая ошибка 0. 030 Общая ошибка при кроссвалидации 0. 133 ОПП/аденома карцинома 39 1 1 25

РЕЗЮМЕ. Микро. РНК в диагностике опухолей Создан прообраз платформы на основе микро. РНК для диагностики онкологических заболеваний, что позволит: • Дифференцировать доброкачественные опухоли от злокачественных новообразований • Контролировать эффект терапевтического воздействия (лучевая и химиотерапия) • Выявлять различные патоморфологические типы опухолей • Разработать алгоритмы ранней диагностики онкологических заболеваний • ПРИМЕНЕНИЕ • Ранняя диагностика • Определение гистотипа опухоли, стадии развития, потенциала к метастазированию • Контроль эффекта терапевтического воздействия (химио и радиотерапия) • Прогностическое значение выживаемости • Потенциальная терапия

Создание панелей для диагностики онкологических заболеваний человека на основе молекулярных маркеров - микро. РНК и соматических мутаций УЧАСТНИКИ ПРОЕКТА: • • • • Титов Сергей Евгеньевич - Вектор-Бест, ИМКБ СО РАН, Веряскина Юлия Андреевна - ИМКБ СО РАН Ахмерова Лариса Григорьевна - ИМКБ СО РАН Иванов Михаил Константинович – Вектор-Бест Жимулев Игорь Федорович - ИМКБ СО РАН Гуляева Людмила Федоровна - ИМББ СО РАМН Деменков Павел Сергеевич - ИЦи. Г СО РАН Шевченко Сергей Петрович - МБУЗ № 1 Карпинская Елена Владимировна - МБУЗ № 1 Козлов Вадим Викторович - НООД Войцицский Владимир Евгеньевич - НООД Сидоров Сергей Васильевич - МБУЗ № 1 Ступак Вячеслав Владимирович - ФГБУ НИИТО Лехнер Андрей Вячеславович - ФГБУ НИИТО Садовой Михаил Анатольевич - ФГБУ НИИТО • При поддержке фирмы БИОРАД Сибирское отделение

Анти-Ми. Р- терапия Nanoparticle-based therapy in an in vivo micro. RNA-155 (mi. R-155)-dependent mouse model of lymphoma (Babar et al. , PNAS, June 8, 2012) Регрессия лимфомы после доставки уникальных наночастиц с анти-ми. Р-155 в лимфоциты

• Благодарю за внимание.

dual function: as oncogene or tumor-suppressor

Гипотезы 1+2

Создание панелей для диагностики онкологических заболеваний человека на основе молекулярных маркеров - микро. РНК и соматических мутаций в онкогенах • • • • Н. Н. Колесников, С. Е. Титов, Е. В. Карпинская, C. П. Шевченко, Ю. А. Веряскина, Л. Г. Ахмерова, М. К. Иванов , Л. Ф. Гуляева , В. В. Ступак, А. В. Лехнер, М. А. Садовой , В. В. Козлов, С. В. Сидоров, И. Ф. Жимулев • ИМКБ СО РАН, Институт молекулярной и клеточной биологии СО РАН; • ЗАО «Вектор-Бест» ; • Городская клиническая больница № 1 г. Новосибирска; • ИМББ СО РАН, Институт молекулярной биологии и биофизики СО РАН; • Новосибирский НИИ травматологии и ортопедии Минздравсоцразвития РФ • Новосибирский онкологический диспансер

Операционный материал Опухолевые и нормальные ткани были получены от 183 пациентов с различными типами новообразований щитовидной железы: Основные классы опухолей и опухолеподобных заболеваний щитовидной железы. (в соответствии с международной гистологической классификацией ВОЗ 2 -го пересмотра (1988 гг. ). 1. 1. 1. Фолликулярная аденома ФА 77 1. 2. 1. Фолликулярная карцинома ФК 7 1. 2. 2. Папиллярная карцинома ПК 61 1. 2. 3. Медуллярная карцинома МК 3 1. 2. 4. Анапластическая карцинома АК 2 7. Опухолеподобные поражения ОПП 33 Всего - 183

микро. РНК в опухолях молочной железы Фиброаденома 16 Инвазивный протоковый рак 61 Всего 77 Веряскина и др. , 2012, Колесников и др. , 2013

Опухоли головного мозга проанализированные по 7 ми. РНК в зависимости от их гистотипа (Колесников и др. , 2013) Гистоструктура Число слу чае в % Степень злокачественн ости (Grade)* Глиобластома 10 14. 3 Астроцитомы 15 21. 4 пилоцитарная (1) I диффузная (4) II анапластическая (10) III IV Эпендимома 1 1. 4 I Медуллобластома 2 2. 8 IV Менингиома 26 37. 1 I Невринома 4 5. 7 I Метастаз карциномы 7 10. 0 Прочие 5 7. 1 Всего 70 100

Микро. РНК как биомаркеры. Анализ операционного материала с предоставленным гистологическим заключением • Микро. РНК в опухолях ЩЖ • Микро. РНК в опухолях МЖ • Микро. РНК в опухолях головного мозга • • • Проанализировано: ЩЖ – 183 образца, МЖ – 77 образцов, ОГМ – 70 образцов Всего - 330

Главные признаки раковой клетки. • • • • • Автономия ростовых сигнальных путей : Самодостаточность в ростовых сигналах: раковые клетки продуцируют свои собственные ростовые сигналы и способны к пролиферации без внешних стимулов. Невосприимчивость к антиростовым сигналам: Раковые клетки уклоняются от воздействия антиростовых стоп-сигналов для того, чтобы пролиферировать. Избегание апоптоза: Опухолевые клетки уклоняются от апоптоза ( программированной клеточной смерти) и увеличиваются в числе. Стабильный ангиогенез: Раковые клетки индуцируют и обеспечивают рост новых кровеносных сосудов Неограниченный потенциал репликации: ДНК опухолевых клеток может воспроизводиться неограниченное число раз. Инвазия в другие ткани и метастазирование: Опухолевая масса порождает клетки-первопроходцы, колонизирующих места в организме с неограниченным питанием и пространством. 4 Дополнения к признакам раковой клетки: + дерегуляция энергетики клетки + избегание воздействия иммунной системы + хромосомные нарушения и нестабильность ДНК + воспалительные процессы Cell, January, 2000, March, 2011, Douglas Hanahan and Robert Weinberg.

Попарное сравнение двух групп образцов с помощью U-критерия Манна-Уитни Изменение уровня ми. РНК при патологии по отношению к контролю 40 35 узлы рак 30 25 20 15 10 5 0 -5 ми. Р 21 ми. Р 222 ми. Р 155 ми. Р 205 -10 Медиана, 0. 25 -квантиль/0. 75 -квантиль U Размер выборки p Узлы Рак ми. Р-21 Группа 1: Узлы/Группа 2: Рак 59, 5 0, 000258 15 26 ми. Р-221 22 0, 000003 15 26 ми. Р-222 31 0, 00001 15 26 ми. Р-155 125, 5 0, 438922 13 23 ми. Р-205 167 0, 680952 14 26

Изменение уровня экспрессии пяти микро. РНК в разных гитопатологических типах опухолей ЩЖ

Мир-221 в доброкачественных и злокачественных опухолях ГМ, ЩЖ и МЖ

Мир-222 в доброкачественных и злокачественных опухолях ГМ, ЩЖ и МЖ

Мир-155 в доброкачественных и злокачественных опухолях ГМ, ЩЖ и МЖ

Мир-205 в доброкачественных и злокачественных опухолях ГМ, ЩЖ и МЖ