Окислительный стресс в мышечной ткани изучение посттрансляционных модификаций

Окислительный стресс в мышечной ткани: изучение посттрансляционных модификаций белков методами протеомики Н. В. Кулева. Кафедра биохимии СПб. ГУ

Возможные последствия окислительного стресса в клетке 1 • Необратимая модификация 2 • Обратимая модификация • Потеря функции белка • Регуляторный ответ +антиоксидант • Защита клеток от повреждения +антиоксидант • Повреждение клетки в результате потери редокс-гомеостаза

Превращение оксидантного сигнала в регуляторный ответ Ключом к превращению регуляторного сигнала в регуляторный ответ являются окислительные модификации белков, которые приводят к изменению их функций и их взаимодействий с другими белками. Здесь присутствуют все элементы регуляторной системы: чувствительность, специфичность, обратимость.

Сигнальная функция перекисного окисления липидов

Обратимые окислительные модификации тиолов цистеина

Окисление тиолов цистеина Модификация Следствие 1. Глутатионилирование актина Торможение полимеризации, защита цитоскелета 2. Образование дисульфидов у регуляторной субъединицы ПК А Активация ПК А 3. Образование дисульфидов у регуляторной субъединицы ПК G 1α Активация белка, связанного с релаксацией сосудов 4. Цистеинилирование ПК С Регуляция активности

Окисление аминокислот пролина (Pro), аргинина (Arg), лизина (Lys), треонина (Thr) в боковых цепях белков приводит к необратимой модификации - карбонилированию Pro Arg Lys Thr

Протеомика и окислительновосстановительная (редокс) сигнализация Биохимические методы для изучения редокссигнализации применимы только тогда, когда установлен редокс-чувствительный белок. Поэтому возникает необходимость глобально следить за всеми редокс-превращениями белков в клетке. Такой мониторинг в настоящее время возможен в связи с развитием протеомики.

Термин «ПРОТЕОМ» , обозначающий белковый комплемент генома (в английской транскрипции PROTEOME: entire PROTEin complement expressed by the gen. OME), впервые прозвучал в докладах Международной конференции “ 2 D-Electrophoresis: from Peptide Maps to Genomes” в Италии в 1994 г. Теперь термины «протеом» и «протеомика» стали общепринятыми. Cтратегию протеомных исследований для какого-либо объекта можно представить в виде ряда последовательно реализуемых этапов, ключевые позиции среди которых занимают метод двухмерного электрофореза белков, идентификация их с помощью масс-спектрометрии и построение компьютерных банков данных. Роль современной протеомики может быть определена как интегральный анализ функционального состояния генома на уровне белковых продуктов генной экспрессии, включающий их посттрансляционные модификации.

Профили экспрессии белка в мидиях, выдержанных в Ароклоре 1254 концентрации 10(В), 100(C) и 1000(D) мкг/литр(Rodriguez-Ortega et al. )

Общая схема реализации протеомного подхода Операция 1. Сбор и приготовление образцов 2. Краткое описание методических приемов Различные приемы солюбилизации белков изучаемого объекта. Использование мочевины, тиомочевины, CHAPS, сульфобетаина, тритона Х-114 и др. детергентов, а также различных ингибиторов протеиназ Фракционирование белков посредством двухмерного электрофореза 3. 4. II стадия – изоэлектрофокусирование на полиакриламидном геле. Использование различных вариантов иммобилинов, создающих на полосках полиакриламидного геля иммобилизованный градиент р. Н (IPG). II стадия – электрофорез разделенных изоэлектрофокусированием белков во II направлении на полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия. Детекция белков на двухмерной электрофореграмме Окраска белковых пятен Кумасси R 250, серебрением, Кумасси другими красителями или авторадиография Сопоставление двумерных белковых карт при различных воздействиях на объект исследования Использование компьютерного анализа изображений. Выявление изменений в белковых картах при воздействии токсикантов Идентификация белков, экспрессия которых изменилась под действием токсикантов Масс-спектрометрия трипсиновых гидролизатов вырезанных из геля и экстрагированных белковых пятен; Использование компьютерных баз данных в Интернете (Swiss-Prot, NCBI и др. ); Микросеквинирование; Swiss- Prot, NCBI и др. ); Микросеквинирование; Иммуноблоттинг 5.

Детекция карбонилированных белков мидий Mytilus edulis, собранных на”чистом” и загрязненном участке(Mc. Donagh et al. 2005)

Обнаружение карбонилированных белков методом иммуноблоттинга Коричневое окрашивание +Н 2 О 2 +диаминобензидин Вторичные антитела (с пероксидазой хрена) Кроличьи антитела к ДНФГ Динитрофенилгидразин (ДНФГ) СО- группы белка

Пример MALDI масс-спектра триптического гидролизата белкового пятна

Протокол идентификации белка по данным масс-спектрометрического анализа Mascot Search Results Search title : E 1_MS. t 2 d - Spec. View. Database : Sprot 20031209 (138922 sequences; 51131444 residues)Taxonomy : Rattus (5687 sequences)Timestamp : 20 Apr 2007 at 07: 20: 36 GMTWarning : Modification Formylation (K. S. T. N-term) in the mod_file contains both residues and terminus. Top Score : 142 for Mixture 1, KCRM_RAT + ACTS_HUMAN Probability Based Mowse Score is -10*Log(P), where P is the probability that the observed match is a random event. Protein scores greater than 50 are significant (p<0. 05). Protein Summary Report Switch to Concise Protein Summary Report To create a bookmark for this report, right click this link: Protein Summary Report (E 1_MS. t 2 d - Spec. View) Index Accession Mass Score Description 1. Mixture 1 142 KCRM_RAT + ACTS_HUMAN 2. KCRM_RAT 42992 86 (P 00564) Creatine kinase, M chain (EC 2. 7. 3. 2) (MCK) 3. ACTS_HUMAN 42024 75 (P 02568) Actin, alpha skeletal muscle (Alpha-actin 1) 4. ACTC_HUMAN 41992 69 (P 04270) Actin, alpha cardiac 5. ACTA_HUMAN 41982 61 (P 03996) Actin, aortic smooth muscle (Alpha-actin 2) 6. ACTH_HUMAN 41850 49 (P 12718) Actin, gamma-enteric smooth muscle (Alpha-actin 3)

Мониторинг стресса, сопровождающегося окислением цистеина, методом диагонального электрофореза

REVERSIBLE AND IRREVERSIBLE MODIFICATIONS OF SKELETAL MUSCLE PROTEINS IN A RAT MODEL OF ACUTE OXIDATIVE STRESS. Maria Fedorova 1, Nadezhda Kuleva 2 and Ralf Hoffmann 1, * (BBA-Molecular Basis of Disease-V. 179, i. 12, p. 11851193, 2009) 1 Institute of Bioanalytical Chemistry, Center for Biotechnology and Biomedicine, Faculty of Chemistry and Mineralogy, Leipzig University, Deutscher Platz 5, 04103 Leipzig, Germany 2 St. Petersburg State University, Department of Biochemistry, Faculty of Biology and Soil Science, Universitetskaya nab. 7/9, 199034 St. Petersburg, Russia

Оксидативный стресс был вызван рентгеновским облучением крыс в дозе 5 Гр. Через 3, 9 и 24 часа после облучения крыс декапитировали, а мышцы задних конечностей измельчали и экстрагировали раствором высокой ионной силы. Затем белки осаждали ацетоном и растворяли в 2 м. М Трис-буфере р. Н 7. 5 с 0. 2 м. М хлоридом кальция. Нерастворившийся осадок удаляли центрифугированием. Концентрацию белка определяли методом Бредфорда. Актин осаждалили из мышечного экстракта посредством полимеризации при добавлении хлористого калия до 0. 1 М и хлористого магния до 2 м. М и центрифугирования в течение 2 час при 100 000 g пеллеты представляли собой фибриллярный (функциональный) актин.

Влияние облучения на перекисное окисление липидов

Пострадиационное изменение И экспрессии мышечных белков з

Пострадиационное изменение карбонилирования белков

Заключение по экспрессии и карбонилированию белков • 35 из 440 пятен изменяют свою • • интенсивность после облучения; Карбонилированию подвергаются 36 белков, из них 20 карбонилировано в контроле; По степени карбонилирования и количеству белка изменения различны, что показывает их зависимость от различных факторов: нейтрализации АФК, деградации и синтеза белка.

Участие модифицированных белков в метаболизме углеводов

Карбонилирование и полимеризация актина Время после облучения (ч) Уровень карбонилирования (мкмоль/г) Степень полимеризации (%) 0 4. 1 100 3 4. 1 78 9 13. 9 33 24 19. 8 66

Идентификация межбелковых дисульфидов после облучения

Proteins identified in spots 1 to 14 of the diagonal SDS-PAGE by peptide mass fingerprints (PMF) and tandem mass spectrometry (MS/MS). Samples were digested with trypsin and analyzed on a MALDI-TOF/TOF-MS. Scores provided by MASCOT for the PMF and the resulting sequences and the sequences identified by MS/MS. Spot N Identified protein Swiss-Prot number Mass (No. of Cysresidues) Mascot score 1 Myosin regulatory light chain 2, skeletal muscle isoform P 04466 18838 (2) 47 2 Myosin light chain 1, skeletal muscle isoform P 02600 20548 (2) 91 3 Myosin light chain 1, slowtwitch muscle B/ventricular isoform P 16409 22025 (2) 51 4 Triosophosphate isomerase P 48500 26773 (5) 43 5 Creatin kinase, M chain kinase, P 00564 43018 (5) 6 Tropomyosin 1 alpha chain P 04692 32675 (2) Peptides matched by PMF Sequence coverage MS/MS position in sequence (MH+) 46% 32 -41 (1192. 63) 91 -105 (1560. 8) 118 -130 (1652. 85) 70% 65 -75 (1200. 71) 120 -132 (1484. 65) 133 -148 (1722. 86) 45% 87 -99 (1396. 72) 20 -38 (1782. 90) 12 60% 161 -175 (1602. 98) 34 -53 (2206. 25) 45 11 35% 139 -148 (1187. 56) 224 -236 (1643. 8) 66 11 34% 168 -178 (1314. 73) 92 -105 (1727. 81) 9 16 7

Продолжение таблицы 7 Actin P 68136 41816 (5) 87 15 37% 362 -374 (1500. 7) 241 -256 (1790. 86) 8 Creatin kinase M chain P 00564 43018 (5) 89 20 44% 157 -170 (1507. 7) 321 -341 (1993. 01) 9 Beta-enolase P 15429 46829 (6) 72 12 27% 413 -426 (1475. 69) 33 -50 (1804. 86) 254 -269 (1837. 88) 10 Phosphoglucomutase-1 P 38652 61234 (5) 93 14 29% 9 -23 (1618. 86) 278 -293 (1652. 68) 371 -387 (1864. 92) 11 Serum albumin precursor P 02770 68674 (35) 77 20 34% 422 -434 (1465. 7) 585 -602 (1948. 8) 12 Phosphoenolpyruvate carboxykinase P 07379 76314 (13) 49 12 18% 462 -471 (1014. 7) 525 -535 (1309. 6) 15 -28 (1540. 9)

Уровень карбонилирования на диагональной электрофореграмме

Сопоставление данных по карбонилированию и дисульфидам • Наибольшее карбонилирование обнаружено в • пятнах на диагонали: пятна № 7 и 8 (актин и креатинкиназа); Образование S-S-связей (левая часть рисунка) уменьшает карбонилирование соответствующих белков, т. е. защищает их от необратимой модификации (регуляторная роль);

Identification of Cysteine, Methionine and Tryptophan Residues of Actin Oxidized In vivo during Oxidative Stress Maria Fedorova, Nadezda Kuleva, and Ralf Hoffmann J. Proteomics Res. , 2010(in press). Среди пяти цистеинов актина Cys-239 и Cys-259 были окислены до сульфеновой кислоты (Cys-SOH), сульфиновой кислоты (Cys-SO 2 H) и сульфоновой кислоты (Cys-SO 3 H), и их количество увеличивалось со временем после облучения. Содержание метионинсульфоксида также увеличивалось для 15 из 16 метиониновых остатков. Наибольшее содержание сульфоксида оказалось в Met-44, Met-47, Met-256. Имеют ли эти остатки регуляторное значение, пока не ясно.

Окисленные остатки в аминокислотной цепи актина

Institute of Bioanalytical Chemistry, Center for Biotechnology and Biomedicine, Faculty of Chemistry and Mineralogy, Leipzig University, Deutscher Platz 5, 04103 Leipzig, Germany