Обєкти прикладної мікробіології Для промислового використання штам-продуцент

Обєкти прикладної мікробіології

Для промислового використання штам-продуцент повинен характеризуватися такими властивостями: n n n Здатність рости у чистій культурі (без фагів) і бути генетично стабільним. Безпечність для навколишнього середовища. Висока швидкість росту при масовому культивуванні та здатність синтезувати продукт у великій кількості за короткий термін. Цільовий продукт повинен легко виділятися Стійкість до можливих контамінантів.

Переваги використання мікроорганізмів як об’єктів біотехнології одного з найперспективніших напрямків промисловості 1. Пластичність метаболізму мікроорганізмів та їх здатність до адаптації. Лише мікроорганізми здатні змінювати напрямок метаболізму під впливом умов культивування або внаслідок штучної перебудови спадкових структур самої клітини. 2. Мікроорганізми у сотні разів продуктивніші за тваринами та рослинами, що обумовлює високий вихід цільового продукту. 3. Простота культивування мікроорганізмів, їх технологічність. 4. Різноманітні методи направленого створення штамів мікроорганізмів із заданими властивостями. 5. Низька вартість мікробіологічного виробництва (вихідним матеріалом мікробного синтезу може бути дешева та доступна сировина).

В прикладной мікробіології застосовують штами 4 х груп мікроорганізмів: Дріжджі: (Saccharomyces cerevisia , Candida ) Міцеліальні гриби: (Aspergillus, Penicillium, Rhizopus, Cephalosporium) Бактерії: грампозитивні організмі: аеробні спороутворюючі бактерії роду Bacillus, деякі корінеформні бактерії (Corynebacterium), грамнегативні бактерії оцтвокислі бактерії та види Xanthomonas. Актиномицеты(Streptomyces)

Продукти і продуценти, що їх утворюють Продукти Продуценти Харчові продукти, маринади, кисломолочні продукти. Оцет Leuconostoc, Pediooccus, Lactobacillus, Streptococcus, Acetobacter aceti Харчові та кормові добавки Глутамат, лізин та ін. Інозинова кислота і рибонуклеотиди. Вітаміни Corynebacterium glumaticum, Brevibacterium flavum, C. glumacum Різні бактерії, наприклад Propionobscterium freudenreichii subsp. shemanii Ферменти (протеаз, аамілази, глюкозоізомераза, пеніцилінацилаза Bacillus licheniformis, B. amyloliquefaciens, B. licheniformis, Actinohlanes missoriensis, Streptomyces sp. , Escherichia coli Розчинники Етанол п-Бутанол, ацетон Молочна кислота Zymomonas mobilis Clostridium acetobutylicum Lactobacillus sp Полісахариди Ксантан. Декстран. Альгінати. Xanthamonas campestris, Leuconostoc mesenteroides. Azotobacter vinelandii Бактерійні та ентомопатогенні препарати. Добрива. Різні види роду Rhizobium Bacillus thuringiensis

Bacillus spp.

Lactobacillus spp. Lactobacillus bulgaricus

Для скерування метаболізму мікроорганізмів у потрібне русло використовують два підходи: генетичний, який базується на використанні мутагенезу і фізіологічний (створення оптимальних для росту умов культивування). Використання фізіологічного підходу можливе лише за умови точних відомостей про фізіологічну роль відповідного процесу для продуцента, шлях синтезу метаболіту й оптимальні умови його синтезу.

Усі мікробіологічні процеси за характером росту продуцентів поділяють на дві групи. 1)Продуценти, синтез цінного метаболіту яких пов'язаний з ростом продуцента. Для мікроорганізмів першої групи підбирають умови, оптимальні для росту культури 2) Продуценти, синтез цінного метаболіту яких не пов'язаний із процесами росту культури. Визначення оптимальних умов їх залежить від фази росту мікробів, у якій відбувається максимальне накопичення певного продукту.

У мікробіологічних виробництвах застосовують: - природні штами мікроорганізмів (здебільшого для виробництва біомаси, бактерійних добрив і біоінсектицидів) ; - штами, змінені в результаті мутагенезу; - штами, одержані методами генної та клітинної інженерії.

Методи селекції промислових штамів мікроорганізмів Селекція (з лат. selectio) означає добір. Для спрямованої селекції високопродуктивних штамів, які використовуються у промисловості, важливе значення має дослідження генома мікроорганізмів, принципів його організації та функціонування. Головним завданням селекційної роботи є реорганізація генома мікробної клітини з переорієнтацією шляхів біосинтезу в потрібному напрямі.

Розрізняють мутації цитоплазматичні та ядерні, чи хромосомні. Хромосомні мутації можна розділити на 3 основні типи: 1 - зміни числа хромосом; 2 - зміни числа і порядку розміщення генів (перебудови хромосом або структурні зміни); 3 - зміни індивідуальних генів (внутрішньогенні зміни). У селекції мікроорганізмів основне значення мають останні два типи мутацій.

Мутагенез Существует еще один тип наследственной изменчивости - изменения, возниющие у прокариот в результате РЕКОМБИНАЦИИ генетического материала, при которой происходит частичное объединение геномов двух клеток. РЕКОМБИНАЦИЯ бактерий (ре- + лат. combino связывать, сочетать) - обмен участками бактериальных хромосом в результате конъюгации, трансформации или трансдукции, приводящий к появлению бактериальных клеток с новым сочетанием генов. Конъюгация - направленный перенос генетического материала от клетки-донора в клетку-реципиент; необходим непосредственный контакт между клетками. Как правило, в клетку-реципиент переносится только часть генетического материала клетки-донора → образуется неполная зигота, или мерозигота (содержит часть генома донора и полный геном клетки-реципиента). Участки перенесенной от донора ДНК находят гомологичные участки в молекуле ДНК реципиента, между которыми происходит генетический обмен. Рекомбинация между гомологичными (А) и негомологичными (Б) фрагментами ДНК

Трансформация бактерий - перенос ДНК, выделенной из одних клеток, в другие; не требуется непосредственного контакта между двумя клетками. Способность ДНК проникать в клетку-реципиент зависит как от природы самой ДНК, так и от физиологического состояния клетки-реципиента. Трансформирующей ДНК могут быть только высокомолекулярные двухцепочечные фрагменты, при этом проникать в бактериальную клетку может ДНК, выделенная из разных биологических источников, но включаться в геном - только ДНК с определенной степенью гомологичности. Трансдукция - перенос генов из одной бактериальной клетки в другую с помощью умеренных фагов; возможна, если в процессе размножения фага одна из частиц случайно захватит фрагмент бактериальной хромосомы, как правило, содержащий очень небольшое число генов. Когда фаговая частица заражает бактерию-реципиент, бактериальная ДНК проникает в клетку таким же путем, как и фаговая. Между трансдуцированной бактериальной ДНК и гомологичным участком бактериальной хромосомы может произойти обмен → возникновение рекомбинанты, несущей небольшую часть генетического материала клетки-донора.

Еще один путь переноса генетического материала у прокариот осуществляется с помощью ПЛАЗМИД определенного типа, обладающих генами, обеспечивающими эту возможность: Ø перенос собственного генетического материала; Ø перенос хромосомных генов, плазмид, не обладающих способностью к самостоятельному переносу; Ø передачу транспозонов из плазмиды в хромосому или другую плазмиду. Плазмидам и другим нехромосомным генетическим элементам принадлежит основная роль в передаче генетической информации "по горизонтали". Т. к. ДНК плазмиды и бактериальной клетки не имеют одинаковых нуклеотидных последовательностей, т. е. не являются гомологичными, рекомбинация между ними происходит не по механизму обмена, а по механизму встраивания. Рекомбинации такого типа происходят также с участием транспозонов и IS-элементов при их перемещении (транспозиции) в пределах хромосомы. Встраивание плазмид и мигрирующих элементов помимо того, что приводит к введению в хромосому дополнительного генетического материала, может вызывать перестройку бактериального генома.

n Біологічними мутагенами є фаг , інсерційні елементи (ISелементи), транспозони (Тп). Вони інтегруються в хромосому і спричиняють мутації типу інсерцій. їхня інтеграція в реплікони здійснюється незалежно від системи загальної (гомологічної) рекомбінації клітин, що вимагає гомології у рекомбінуючих структур.

Результати мутацій можуть проявлятися в різних змінах метаболізму клітини: 1. підвищення рівня синтезу біосинтетичних ферментів чи їх активності (наприклад, мутанти з порушеною структурою білкарепресора чи алостеричною нечутливістю); 2. блокування подальшого внутрішньоклітинного перетворення метаболіту; 3. блокування деградації продукту; 4. забезпечення ефективної екстракції продукту з клітини; 5. посилення позитивної регуляції синтезу продукту тощо.

Ступінчастий добір включає етапи мутагенезу, а також виділення спонтанних мутантів. Основними етапами селекції промислових штамів мікроорганізмів при використанні індукованого мутагенезу та ступінчастого добору є: n вибір об'єкта; n підготовка об'єкта до селекції; n вибір мутагену і проведення мутагенезу; n вибір методу селекції мутантів; n перевірка властивостей відібраного штаму Цю послідовність етапів можна повторювати аж до отримання шуканого результату.

Методи селекції мутантів 1. Метод відбитків (реплік) для виділення ауксотрофних мутантів на мінімальному середовищі 2. Виділення стійких мутантів до В лікувальних препаратів або до дії бактеріофагів (висіванні чутливих клітин на середовище, яке містить антибактерійний агент). 3. Пеніциліновий метод виділення мутантів

Метод реплик n

Генетичне конструювання промислових штамів – сукупність прийомів, за допомогою яких свідомо змінюють генетичну програму об'єкта. Розрізняють 1)генетичне конструювання іп vivo, що включає одержання та виділення мутантів і використання різних способів обміну спадковою інформацією живих мікробних клітин (метод гібридизації) 2) генетичне конструювання in vitro, яке базується на використанні генної інженерії, що передбачає маніпуляції з виділеної із організмів ДНК.

Генетична інженерія Сутність – фрагментування молекул ДНК у певних ділянках і створення нових рекомбінантих молекл ДНК in vitro. Мета – виробництво методами мікробіологічного синтезу білків людини, важливих для медіцини чи білків сільськогосподарських тварин для ветеринарії.

Роботи в області генетичної інженерії включають чотири основних етапи: 1. Одержання індивідуальних генів чи фрагментів ДНК 2. 2. Вбудовування гену у генетичний елемент (вектор), здатний до реплікації 3. 3. Перенос вектора у реципієнтну клітину 4. 4. Селекція клонів з рекомбінантними молекулами ДНК

Необходимо: 1)вектор – небольшая молекула ДНК, способная к автономной репликации в определенном микроорганизмебактериофаг или плазмида; 2) рестриктазы –узнают и расщепляют разные нуклеотидные последовательности; 3) эффективный способ введения векторной и рекомбинантной ДНК в микроорганизм – трансформация; 4) для оптимальной экспрессии – правильный выбор реципиентной клетки, которая должна обеспечить стабильность чужеродной м. РНК и минимальную деградацию белкового продукта.

З Схема одержання мультиплазмідного штаму Р. риtіdа.

Методом клонування можна змінити метаболізм клітин мікроорганізмів, наприклад: 1. Звилася можливість фіксації азоту шляхом введення генів, що обумовлюють здатність до азотфіксації у геном бактерій, які не мали цієї здатності. 2. Підвищено швидкість росту Methylophilus methylotrophus - продуцентів білка на метанолі - шляхом введення у їхній геном гена з Е. сoli, що синтезує глутаматдегідрогеназу і забезпечує більш високу конверсію субстрату. 3. Клоновано ген а-амілази термофілу Bacillus licheniformis у геном В. subtilis. 4. За допомогою переносу природних плазмід одержано штам Pseudomonas putida, здатний утилізувати більшість основних вуглеводнів нафти.

Існує три різні джерела молекул ДНК, які використовують у генній інженерії: 1)фрагменти генетичного матеріалу, виділені з різних організмів; 2)двониткові ДНК, одержані на основі однониткової ДНК комплементарної м. РНК еукаріотичних організмів; 3)хімічно-, або ферментативно синтезовані гени.

Генетичне конструювання біотехнологічних штамів мікроорганізмів іп vivo включає одержання та виділення мутантів і використання різних способів обміну спадковою інформацією живих мікробних клітин, здійснюють методом злиття протопластів, або гібридизації клітин

Перспективи методу злиття протопластів: 1. можливість схрещування філогенетично віддалених форм живого; 2. одержання асиметричних гібридів, що несуть повний набір генів одного з батьків і частковий набір іншого; 3. гібридизацію клітин, що несуть різні програми розвитку, - злиття клітин різних тканин або органів, злиття нормальних клітин із клітинами зі зміненою внаслідок злоякісного переродження програмою розвитку. У цьому випадку утворюються так звані гібридомні клітини.

Методи зберігання промислових культур Основне завдання зберігання промислових культур — підтримка їх життєздатності, збереження стабільності таксономічно важливих ознак і властивостей. Проблема тривалого зберігання мікроорганізмів полягає у створенні умов, які забезпечать клітинам перехід у стан анабіозу, тобто сповільнять процеси обміну речовин.

Методи зберігання 1)періодичні пересіви (субкультивування), 2)зберігання при низьких та ультранизьких температурах, 3)висушування (просте і ліофілізоване) 4)зберігання під мінеральною олією.

Схема ліофільного висушування культур мікроорганізмів в одинарних ампулах: 1 - вакуумний манометр; 2 - вакуумний насос; 3 - конденсор; 4 - резервуар зі сухим льодом; 5 - ампули зі зразком; б- сталева посудина з сухим ль