Общие принципы прижизненного морфологического исследования ткани почек Морфология

Общие принципы прижизненного морфологического исследования ткани почек Морфология интактной почки

Задачи и сущность патологической анатомии « … патологическая анатомия не только наука о трупах лиц, погибших от болезней, она в то же время клиническая и экспериментальная наука; она внедряется в жизнь и принимает существенное участие в изучении измененной болезнью жизни» (Р. Вирхов, 1860).

n Связь клиники и патологической анатомии обусловлена неразрывным единством морфологических и функциональных процессов организма в норме и патологии.

n В настоящее время достижения современной биологии, обогащенной ультраструктурными исследованиями клетки и ее ферментных систем, современной генетики, иммуноморфологии и морфометрии привели к значительному усовершенствованию морфологических методов исследования, что позволило полностью устранить существовавшие ранее барьеры между функциональными и структурными проявлениями болезни. Поскольку никакие, даже ничтожные, функциональные изменения не происходят без соответствующего им морфологического субстрата.

n Неуклонное развитие и совершенствование клинической морфологии обусловлено прогрессирующим расширением сферы прижизненного морфологического исследования, что, в свою очередь, объясняется не только совершенствованием инструментальной медицинской техники, но и возрастающей хирургической активностью, широким внедрением в клинику эндоскопических методов и биопсии.

n От заключения клинического патолога зависит дальнейшая судьба больного. Это не только диагноз, но и объективная оценка (на основании повторных биопсий) клинического течения болезни, возможность выбора наиболее рационального лечения, оценка его эффективности, прогнозирование близких и отдаленных результатов лечения.

n n Современные урология и нефрология достигли больших успехов в значительной мере именно благодаря широкому внедрению прижизненного морфологического исследования. Это и исследование операционного материала, в том числе, интраоперационных биопсий, и материала, получаемого при эндоскопических исследованиях урогенитального тракта, и, конечно, пункционная биопсия почки.

Пункционная биопсия почек дает врачу возможность: n n n верифицировать диагноз определить распространенность и проследить динамику патологического процесса выявить иммунную природу заболевания распознать его этиологию и патогенез оценить функциональные возможности почек осуществлять контроль лечения пациентов

Показания к проведению нефробиопсии n n n диагностика паренхиматозных первичных и вторичных (при системных заболеваниях, амилоидозе, сахарном диабете) заболеваний почек установление причины ренальной острой почечной недостаточности диагностика хронической почечной недостаточности диагностика интерстициального заболевания почек исследование функции почек при артериальной гипертензии, гемолитико-уремическом синдроме и подагрической нефропатии

В последние десятилетия нефробиопсия стала широко использоваться для слежения за течением посттрансплантационного периода. Это позволило своевременно диагностировать такие осложнения, как острый канальцевый некроз (ишемический или лекарственный), острое или хроническое отторжение, сандиммуновую нефропатию, рецидив гломерулонефрита, гломерулонефрит de novo, пиелонефрит трансплантата. ’’

n n В России при имеющейся хронической почечной недостаточности считается оправданным проводить биопсию почки лишь на начальных этапах заболевания (до уровня креатинина крови 0, 3 ммоль/л). На более поздних стадиях возникают трудности, связанные с неэффективностью рентгенодиагностики, большой плотностью капсулы почки, что существенно усложняет биопсию и увеличивает риск осложнений. Тем не менее, за рубежом большинством врачей признается целесообразность проведения биопсии при хронической почечной недостаточности.

Проведение повторных биопсий целесообразно при: n n уточнении этиологии заболевания при нерепрезентативной первой биопсии или при явном несоответствии клинической и морфологической картины необходимости оценить течение нефропатии, динамику иммунологического состояния

Противопоказания к проведению биопсии – наличие у больного следующих патологических состояний: n n n геморрагического диатеза кист почек опухолей абсцессов единственной почки

Из возможных осложнений нефробиопсии в настоящее время остаются актуальны околопочечные гематомы n появление макрогематурии у пациента n

Методика изучения нефробиоптата

Полученный в столбик ткани переносят на предметное или часовое стекло в 10% раствор нейтрального формалина.

n Под малым увеличением микроскопа или под лупой клубочки выглядят маленькими сферами красного цвета, контрастирующими с окружающей бледной тканью. Мозговое вещество имеет вид продольно исчерченной ткани. Полученная при ошибочных пункциях жировая ткань отличается желто-белой окраской и равномерной гроздевидной структурой; мышечная же ткань состоит из буроватых волокон.

Современный стандарт морфологического анализа нефробиоптата q q исследование микропрепаратов в проходящем свете иммунофлуоресцентная микроскопия иммуногистохимическое исследование электронная микроскопия

n n n В связи с различной подготовкой к разным методам морфологического анализа разделение нефробиоптата должно происходить непосредственно после забора материала. При имеющихся возможностях проведения электронной микроскопии биоптата в капле 4% раствора глютаральдегида лезвием отсекают 3 -4 кусочка от коркового слоя объемом не более 1 мм 3 и немедленно погружают их в пробирку с раствором глютаральдегида. Остальную ткань погружают в 10% раствор нейтрального формалина для осуществления фиксации материала.

n n Фиксированный в 10% нейтральном формалине материал в дальнейшем подвергают обезвоживанию в спиртах восходящей крепости и заключают в парафин. Полученные парафиновые блоки могут храниться многие месяцы и годы. С парафиновых блоков на микротоме получают гистологические срезы, которые подвергают окрашиванию и исследуют под микроскопом.

n Для проведения иммунофлуоресцентных исследований берется, как правило, дополнительный столбик ткани, который помещают во влажную камеру, а после окончания биопсии сразу замораживают.

Окрашивание препаратов для светооптического исследования n n n гематоксилином и эозином пикрофуксином по ван Гизону нитратом серебра ШИК-реакция специфическое окрашивание на амилоид генциановым и метиловым фиолетовым или конго красным

Ткань почки, окрашенная гематоксилином и эозином

Ткань почки, окрашенная по ван Гизону

МОРФОЛОГИЯ ИНТАКТНОЙ ПОЧКИ

n n n Нефрон – это эпителиальная трубка, начинающаяся от почечного тельца (клубочка) и впадающая в собирательную трубочку. Стенка нефрона построена из однослойного эпителия, клетки которого (в зависимости от выполняемой функции) различны в разных отделах нефрона. В нефроне различают несколько отделов: капсула почечного тельца, окружающая капиллярный клубочек, проксимальный извитой и проксимальный прямой канальцы, тонкий каналец, дистальный прямой и дистальный извитой канальцы. Тонкий и дистальный прямой канальцы образуют нисходящую и восходящую часть петли Хенле. Дистальный прямой каналец возвращается к почечному тельцу и контактирует с ним; далее он переходит в дистальный извитой, впадающий в собирательную трубочку.

Нефрон – структурно-функциональная единица почки

Типы нефронов: n n корковые (кортикальные)нефроны (80 -85%) почти целиком располагаются в корковом веществе, и лишь колена их петель находятся в наружной зоне мозгового вещества юкстамедуллярные нефроны – их почечные клубочки, проксимальные и дистальные отделы канальцев лежат в корковом веществе на границе с мозговым, тогда как петли глубоко уходят в мозговое вещество почки вплоть до верхушек пирамид

Корковый и юкстамедуллярный нефроны

Почечное тельце и фильтрация n Почечное тельце состоит из капиллярного клубочка (примерно 50 капиллярных петель) и его эпителиальной капсулы, являющейся началом нефрона. Область, где в тельце входит и приносящая и выходит выносящая артериолы, называют сосудистым полюсом.

Капсула клубочка

n Висцеральный листок капсулы покрывает снаружи петли капилляров клубочка и образован крупными эпителиальными клетками – подоцитами. От тел подоцитов отходит несколько отростков – цитотрабекул, от которых начинаются многочисленные малые отростки – педикулы (ножки). Эти отростки ветвятся, в результате на поверхности капилляра образуется лабиринт из щелей между ножками подоцитов прикрепляющихся к гломерулярной базальной мембране (ГБМ) – фильтрационные щели.

n Фильтрационные щели имеют ширину около 25 нм и затянуты щелевыми диафрагмами (сеть с ячейками размером около 10 нм). Щелевые диафрагмы содержат нефрин; в участках соединения диафрагм с плазмолеммой ножек подоцитов присутствует белок плотных контактов (ZO-1). Ножки подоцитов в широких пределах изменяют свой диаметр, что сказывается на ширине фильтрационных щелей. Через эти щели могут проходить молекулы веществ с массой не более 50 к. Да.

Фильтрационный барьер: n n n эндотелиальные клетки капилляров (цитоплазма которых имеет многочисленные поры) базальная мембрана фильтрационные щели между ножками подоцитов

Базальная мембрана n n n имеет толщину около 300 нм является образованием, общим для подоцитов и эндотелия капилляров формируется, в основном, за счет синтетической деятельности подоцитов в базальной мембране различают три слоя: внутренний, центральный и наружный ее основу составляет мелкоячеистая сеть, образованная молекулами коллагена IV типа, ламинина отрицательно заряженные молекулы гепарансульфата, присутствующие в составе протеогликанов базальной мембраны, препятствуют прохождению сквозь нее анионных белков плазмы: вещества с молекулярной массой до 10 к. Д проходят через базальную мембрану свободно, а более 50 к. Д – в ничтожных количествах

Капиллярные петли связаны между собой мезангием. n Внутренний листок капсулы не покрывает полностью каждый отдельный капилляр клубочка. Между капиллярами, не имеющими в таких местах общей с эпителием базальной мембраны, располагаются клетки отростчатой формы – мезангиальные клетки, окруженные основным веществом – мезангиальным матриксом.

Клубочек. Окраска гематоксилином и эозином х 1000

Функции мезангия: n n n обеспечивает механическую поддержку капилляров клетки мезангия обладают сократительной способностью, регулируя величину просвета капилляров и, таким образом, регулируя уровень фильтрации мезангиальные клетки имеют рецепторы ангиотензина II и вазопрессина мезангиальные клетки выполняют макрофагальную функцию мезангиоциты синтезируют макромолекулы межклеточного вещества и фактор активации тромбоцитов (PAF)

n Мезангиальный матрикс имеет ряд схожих с базальными мембранами субстанций. Его так и называют – «материал, подобный базальной мембране» . Связь между мезангием, эндотелием и базальной мембраной очень тесная. Это способствует транспорту веществ из капиллярных петель в мезангий, обеспечивает осуществление мезангием активного фагоцитоза.

Проксимальный каналец

n В проксимальном канальце происходит активная реабсорбция ионов натрия и хлора, воды, практически всей глюкозы и всего отфильтрованного в почечных тельцах белка, а также фосфатов. Патология проксимальных канальцев обуславливает такие заболевания, как гипофосфатемия, гипофосфатемический рахит, в том числе сопровождаемый гипокальциурией, гипофосфатемическая болезнь костей (все наследуемый дефект реабсорбции фосфатов), также наследственно обусловленные глюкозурию и цистинурию с образованием мочевых камней.

Петля Хенле

n n Тонкий отдел петли (нисходящий). Стенка канальца в этом отделе нефрона представлена плоскими эпителиальными клетками неправильной формы с немногочисленными микроворсинками. Эти клетки участвуют в реабсорбции воды. Толстый отдел петли – восходящий (или дистальный прямой каналец) образован кубическим эпителием. Клетки имеют немногочисленные короткие микроворсинки. В этом отделе происходит реабсорбция ионов Na+ и Cl-. В то же время, стенка канальца непроницаема для воды, которая остается в канальце. Это приводит к тому, что моча в толстом отделе становится более гипотонической, но зато увеличивается гипертоничность окружающих тканей, и, в том числе, в артериальных vasa rectae, гипертоническая кровь которых направляется к почечным сосочкам.

Дистальный извитой каналец

n По своей структуре дистальный извитой каналец – это тот же толстый отдел петли Хенле. Здесь в результате очередного обмена ионами между фильтратом в просвете канальца и окружающей тканью происходит закисление мочи. Клетки дистальных извитых канальцев – мишени альдостерона. Альдостерон усиливает реабсорбцию ионов Na+, что, в конечном итоге, способствует увеличению АД.

Собирательные трубочки

n В собирательных трубочках происходит завершающий этап реабсорбции воды и концентрирования мочи. Клетки собирательных трубочек – мишень вазопрессина. Вазопрессин способствует задержке в организме воды, уменьшению диуреза и, как следствие, увеличению АД.

n Стенка собирательных протоков образована цилиндрическим эпителием. Большинство его клеток относится к светлому (главному) типу. Встречаются и темные (вставочные) клетки. Эпителий собирательных протоков переходит в эпителий, выстилающий сосочек.

Юкстагломерулярный комплекс

Плотное пятно n Плотное пятно образовано клетками дистального извитого канальца в области его перегиба между приносящей и выносящей артериолами клубочка. Клетки плотного пятна имеют сравнительно большую высоту, ядра смещены к основанию клеток. Эти клетки тесно контактируют с юкстагломерулярными и юкставаскулярными клетками, поскольку в этом участке канальца отсутствует базальная мембрана.

Юкстагломерулярные клетки n n n видоизмененные гладкомышечные клетки средней оболочки приносящей артериолы имеют полигональную форму и округлое, а не вытянутое, как у гладкомышечной клетки, ядро в цитоплазме отсутствуют характерные для гладкомышечных клеток филаменты, но имеется большое количество как отдельных, так и образующих агрегаты секреторных гранул, содержащих ренин

Юкставаскулярные клетки (клетки Гормагтига)

Юкставаскулярные клетки n Юкставаскулярные клетки (клетки Гормагтига) образуют скопление (полюсную подушку) между плотным пятном и клубочком в углублении между приносящей и выносящей артериолами. Для этих клеток характерны неправильная форма, бледное ядро, филаменты в цитоплазме и длинные отростки. К настоящему времени функция клеток остается неустановленной. Считают, что клетки полюсной подушки содержат ангиотензиназу А. По некоторым данным, юкставаскулярные клетки могут участвовать в синтезе ренина при истощении юкстагломерулярных клеток.

Интерстициальная (межуточная) ткань почки

Интерстиций n n в корковом веществе развит слабо и состоит из сетевидных тонких ретикулярных волокон, единичных фибробластов, макрофагов, реже – лимфоидных или плазматических клеток в мозговом веществе более широкий, ретикулярные волокна толще и расположены параллельно канальцам и сосудам, обнаруживаются особые интерстициальные клетки, продуцирующие простагландины; между почечными канальцами располагаются перитубулярные капилляры.

Принципы иммуногистохимического исследования тканей n Иммуногистохимия – один из методов окраски гистологических препаратов. Иммуногистохимические методы были предложены в середине ХХ века Coons et al. , 1941. Суть этих методов заключается в определении локализации антигенов с помощью специфических антител, то есть иммунологические реакции в этих методах перенесены на предметное стекло.

n n Структура Ig G такова, что молекула этого белка имеет два функционально различных участка, отвечающих за связывание с определенным антигеном, и потому может взаимодействовать с двумя антигенными детерминантами. В связи с особенностями строения молекулы Ig G именно этот иммуноглобулин используется для проведения иммуногистохимических реакций.

n Для визуализации мест взаимодействия антигена с антителом в ткани необходимо пометить антитела меткой, которая была бы видна под микроскопом. Для достижения этой цели существует несколько хорошо отработанных методов.

n n n Мечение антител электронно-непрозрачной меткой (ферритин, коллоидное золото) с последующей визуализацией места локализации антигена под электронным микроскопом. Это самый трудоемкий и дорогостоящий метод. Мечение антител флюорохромом. После образования комплекса «антиген-антитело» соответствующее место будет светиться при просмотре в ультрафиолетовом свете. Хотя этот метод имеет существенные недостатки, такие как трудность морфологического анализа (хорошо видна светящаяся клетка, но не видна сама гистологическая структура) и сложности, связанные с хранением препаратов. Поэтому данный метод также не получил широкого распространения. Мечение антител ферментами, после выявления активности которых становятся видны места локализации антигена. На этом принципе основаны иммуногистохимические методы.

Принцип метода n иммуногистохимическое окрашивание основано на взаимодействии фермента, которым помечены антитела, с субстратом и образовании окрашенного конечного продукта реакции

n В настоящее время в иммуногистохимии используют следующие ферменты: пероксидаза хрена, щелочная фосфатаза, глюкозооксидаза, бета-галактозидаза и уреаза. Однако широкое применение нашли только первые два из перечисленных.

Пероксидаза хрена n n Этот фермент выделен из корня хрена, он обладает способностью расщеплять перекись водорода. Метод выявления активности пероксидазы основан на окрашивании хромогена. Наиболее часто в качестве хромогена используется 3 -диаминобензидин тетрахлорид (ДАБ, DAB) – продукт реакции коричневого цвета, нерастворимый в органических растворителях.

Иммуногистохимическое окрашивание нефробиоптата (Ig. G, МПГН)

Прямой метод n n Этот метод подразумевает использование меченых первичных антител, то есть антител против определенного антигена, уже несущих на себе метку. Преимущество этого метода – быстрое получение результата. Недостаток – слабая интенсивность окраски.

Непрямые методы n Непрямые методы основаны на использовании немеченых первичных антител, которые после связывания с антигеном тканей сами станут антигеном для вторичных конъюгированных с ферментом антител.

Авидин-биотиновые методы n n n Биотин является низкомолекулярным витамином, который способен связываться в высокой пропорции с высокомолекулярными соединениями (Ig, пероксидаза хрена, щелочная фосфатаза). Авидин – это гликопротеин, получаемый из яичного белка. Авидин-биотиновые иммуногистохимические методы основаны на способности авидина или стрептавидина связываться с биотином, а биотина, в свою очередь, с иммуноглобулинами и ферментными маркерами. В качестве вторичных антител в этих методах используют биотинилированные антитела.

n На основе данного метода компанией DAKO (Дания) разработан высокочувствительный полный набор всех реагентов и буферных систем LSAB, в котором вторичные биотинилированные антитела реагируют как с моноклональными, так и с поликлональными (кроличьими) первичными антителами, а фермент конъюгирован со стрептавидином, который, в свою очередь, связывается с биотином вторичных антител.