Общая биофизика. 2. Законы спектрофотометрии Ю. А. Владимиров

Общая биофизика. 2. Законы спектрофотометрии Ю. А. Владимиров и А. Н. Осипов 2012 г. © Ю. А. Владимиров. Несанкционированное распространение запрещено законом

Электронные уровни и переходы p* n p Возбужденное состояние p* p p* n p* p Основное состояние © Ю. А. Владимиров. Несанкционированное распространение запрещено законом n p Возбужденное состояние

Электронные переходы в пептидной связи s* . . n s s* p p* n s* n p* p* n p O s p C С С N H s © Ю. А. Владимиров. Несанкционированное распространение запрещено законом

p-электроны сопряженных двойных связей делокализованы –CH=CH– Делокализованные электроны находятся как бы в электронном ящике, длина которого тем больше, чем больше число сопряженных связей. n =1 n =2 © Ю. А. Владимиров. Несанкционированное распространение запрещено законом

Номенклатура соединений с двойными связями -С=С- 1 двойная связь - ены -С=С- 2 двойных связи - диены -С=С-С=С- 3 двойных связи - триены -С=С-С=…=С-С=С- много двойных связей - полиены © Ю. А. Владимиров. Несанкционированное распространение запрещено законом

Связь длины волны поглощения с числом сопряженных двойных связей Энергия электрона в потенциальном ящике равна: В нашем потенциальном ящике число электронов равно 2 N, где число сопряженных двойных связей N. Число занятых орбит равно N. Главное квантовое число верхней заполненной орбиты n. ВЗО=N. Главное квантовое число нижней свободной орбиты n. НСО=N +1. Энергия поглощаемого фотона равна разнице в энергиях этих орбит: © Ю. А. Владимиров. Несанкционированное распространение запрещено законом

Продолжаем вычисления Из предыдущего слайда: Где: Подставляем A и находим: При N>2: Теперь находим длину волны © Ю. А. Владимиров. Несанкционированное распространение запрещено законом

Зависимость положения максимума поглощения от числа сопряженных двойных связей в молекуле Каротиноиды (N = 11) Ретиналь (N =6) Триеновые коньюгаты (N = 3) Диеновые коньюгаты (N = 2) © Ю. А. Владимиров. Несанкционированное распространение запрещено законом

Спектры поглощения биологически-важных соединений D 1. 0 Окисленные фосфолипиды: диеновые коньюгаты (N = 2) Триеновые коньюгаты (N = 3) Ретиналь (N =6) 0. 8 Каротиноиды (N = 11) 0. 6 0. 4 фосфолипиды из мозга (N = l) 0. 2 0 200 300 400 © Ю. А. Владимиров. Несанкционированное распространение запрещено законом 500 нм

Зависимость положения максимума поглощения от числа сопряженных двойных связей в молекуле Максимум поглощения (нм) = 24, 38 N + 199, 17 N Максимум поглощения (опыт) Максимум поглощения (расчет) Диены 2 233 247, 9 Триены 3 275 272, 3 Ретиналь 6 345, 5 11 467, 4 Вещество Каротин Триптофан 4 Порфирин 8 275 и 292 © Ю. А. Владимиров. Несанкционированное распространение запрещено законом 296, 7 394, 2

Устройство спектрофотометра © Ю. А. Владимиров. Несанкционированное распространение запрещено законом

Спектрофотометр Прибор для измерения спектров поглощения Компьютер Вогнутые зеркала Лампа ФЭУ Mac. L ab Интерфейс Кювета Усилитель Монохроматор Дифракционная решетка © Ю. А. Владимиров. Несанкционированное распространение запрещено законом

Измерение поглощения в малых объемах с помощью волоконной оптики Лазер Измерительная ячейка Блок регистрации PM Mac. L ab ФЭУ Кювета © Ю. А. Владимиров. Несанкционированное распространение запрещено законом

Блок-схемы однолучевого (а) и двухлучевого (б) спектрофотометров © Ю. А. Владимиров. Несанкционированное распространение запрещено законом

Закон Бугера-Ламберта-Бэра © Ю. А. Владимиров. Несанкционированное распространение запрещено законом

Непосредственно фотометр измеряет интенсивности света (I 0 и I) Падающий свет Прошедший свет Кювета I 0 l Концентрация n, молекул / м 3 © Ю. А. Владимиров. Несанкционированное распространение запрещено законом I

Законы поглощения света Падающий свет Измеряемый свет A = - ln. T A = - Acl © Ю. А. Владимиров. Несанкционированное распространение запрещено законом

Найдем связь между I и I 0, n и l Кювета I 0 I S I- Интенсивность падающего света I 0 l- dl Интенсивность прошедшего света Длина кюветы n- Число молекул в единице объема S – Площадь сечения пучка © Ю. А. Владимиров. Несанкционированное распространение запрещено законом

Поглощение фотонов согласно теории мишеней S I – d. I I dl n. Sdl = Число молекул в объеме S l s = Поперечное сечение поглощения одной мишени ns. Sdl = Сумма поперечных сечений мишеней nsn. Sdl /S = Доля поглощенного света = – d. I/I 0 © Ю. А. Владимиров. Несанкционированное распространение запрещено законом

Произведем интегрирование © Ю. А. Владимиров. Несанкционированное распространение запрещено законом

Коэффициент поглощения (Absorbency) – A Оптическая плотность (Optical Density) – D © Ю. А. Владимиров. Несанкционированное распространение запрещено законом

Задача Определить количество вещества (тетрациклина) в растворе объемом 25 мл, если при его фотометрировании при 380 нм и длине оптического пути 5 см раствор имел пропускание 50%. Для тетрациклина (380 нм)=102 л/моль см © Ю. А. Владимиров. Несанкционированное распространение запрещено законом

Решение © Ю. А. Владимиров. Несанкционированное распространение запрещено законом

Зависимость пропускания (T), коэффициента поглощения (1 - T) и оптической плотности (D) от концентрации (C) хромофора в растворе © Ю. А. Владимиров. Несанкционированное распространение запрещено законом

Многокомпонентные смеси Каждый вид частиц поглощает свет независимо! (в отсутствие химических реакций) Закон аддитивности оптических плотностей © Ю. А. Владимиров. Несанкционированное распространение запрещено законом

Количественный спектрофотометрический анализ смеси двух веществ: I, 2 -спектры компонентов; 3 спектр смеси Суммарный спектр поглощения (3) есть сумма спектров поглощения чистых веществ (1) и (2) © Ю. А. Владимиров. Несанкционированное распространение запрещено законом

I 0 I 2 I 0 I 1 © Ю. А. Владимиров. Несанкционированное распространение запрещено законом I 2

При поглощении света смесью веществ складываются оптические плотности, а не пропускания! Поэтому в количественном анализе используют именно оптические плотности. © Ю. А. Владимиров. Несанкционированное распространение запрещено законом

Выбранные две длины волны l 1 и l 2 должны быть такими, для которых молярные коэффициенты поглощения компонентов ( 1 l 1), ( 2 l 1) и ( 1 l 2), ( 2 l 2) различаются больше всего; это не всегда соответствует максимумам в спектре поглощения веществ © Ю. А. Владимиров. Несанкционированное распространение запрещено законом

Для двух разных длин волн получают систему из двух уравнений с двумя неизвестными, решив которую, находят обе концентрации © Ю. А. Владимиров. Несанкционированное распространение запрещено законом

Отклонения от закона Бугера-Ламберта-Бера 1. При работе с немонохроматическим излучением меняется значение коэффициента ε © Ю. А. Владимиров. Несанкционированное распространение запрещено законом

Иллюстрация к причине 1 ε (AF) = 1700 -1800 ε (BE) = 2300 ε (CD) = 2500 © Ю. А. Владимиров. Несанкционированное распространение запрещено законом

Отклонения от закона Бугера-Ламберта-Бера 2. При высоких концентрациях вещества возможно образование новых соединений в результате взаимодействия молекул друг с другом или растворителем © Ю. А. Владимиров. Несанкционированное распространение запрещено законом

Иллюстрация к причине 2 Cr 2 O 72 - + H 2 O = 2 H+ + 2 Cr. O 42 Оранжевый © Ю. А. Владимиров. Несанкционированное распространение запрещено законом Желтый

Эффект сита в суспензии эритроцитов 1 - спектр поглощения суспензии эритроцитов; 2 - тот же образец после гемолиза: А - прохождение пучка света через суспензию эритроцитов; Б - через гемолизат © Ю. А. Владимиров. Несанкционированное распространение запрещено законом

Отклонения от закона Бугера-Ламберта-Бера 3. Изменение показателя преломления растворов с разной концентрацией (истинное отклонение) 4. Рассеяние света: а) связанное с отражением от стенок кюветы и от поверхностей линз и призм б) истинное рассеяние света образцом © Ю. А. Владимиров. Несанкционированное распространение запрещено законом

Учет рассеяния 1. В спектрофотометрах используют специальные приемы: интегрирующая сфера Ульбрихта, направляющая практически полностью излучение на детектор 2. Рассеивающая пластинка, помещаемая непосредственно за кюветой 3. Введение поправки © Ю. А. Владимиров. Несанкционированное распространение запрещено законом

Введение поправки на рассеяние 1. Поглощение и рассеяние считаем независимыми процессами, тогда А = Аs + Аa 2. Известно, что в отсутствие поглощения Аs = a/ln (закон Рэлея) где a и n – константы, 0 < n < 4 3. lg. Аs = lg a – n lgl © Ю. А. Владимиров. Несанкционированное распространение запрещено законом

4. Построим график зависимости lg. А = f (lgl)в той части спектра, где поглощение отсутствует (длинноволновая область), т. е. А = Аs 5. Экстраполяцией находим величину lg. Аs при нужной длине волны 6. Зная Аa = А – Аs, строим истинный спектр поглощения Аa = f (l) © Ю. А. Владимиров. Несанкционированное распространение запрещено законом

Погрешность измерения оптической плотности Детектор измеряет интенсивность падающего и прошедшего света с погрешностью I, которая зависит от уровня шумов. Оптическая плотность, таким образом, тоже измеряется с погрешностью А. Можно математически найти значение оптической плотности, при котором ошибка минимальна. © Ю. А. Владимиров. Несанкционированное распространение запрещено законом

Относительная погрешность оптической плотности должна быть минимальна В минимуме функции первая производная равна 0 Этот минимум достигается при А опт = 1/ln 10 = 0. 434 © Ю. А. Владимиров. Несанкционированное распространение запрещено законом

Ошибка определения оптической плотности D/D при обычной (1) и разностной (2) спектрофотометрии © Ю. А. Владимиров. Несанкционированное распространение запрещено законом Количественные характеристики этой кривой зависят от детекторов. Для большинства детекторов интервал измерения оптической плотности составляет от 0. 2 до 0. 8.