ОБМЕН ВЕЩЕСТВ И ЭНЕРГИИ У ПРОКАРИОТ Классификация

ОБМЕН ВЕЩЕСТВ И ЭНЕРГИИ У ПРОКАРИОТ

Классификация бактерий по источнику углерода ► Автотрофы - синтезируют все углеродсодержащие компоненты клетки из СО 2 ► Гетеротрофы - используют готовые органические углеродсодержащие соединения: -гексозы (глюкоза), -многоатомные спирты, -углеводороды, -органические кислоты, - аминокислоты и др.

Классификация бактерий по источнику энергии ► Фототрофы (фотосинтезирующие) - используют солнечную энергию, например: зеленые или пурпурные бактерии ► Хемотрофы (хемосинтезирующие) - получают энергию за счет окислительновосстановительных реакций, например: серобактерии, железобактерии, нитрифицирующие бактерии и др.

Классификация бактерий по природе донора электронов ► Литотрофы (греч. litos – камень) - хемотрофные организмы, которые используют неорганические соединения: Н 2, H 2 S, СН 3 и др. ► Органотрофы - хемотрофные организмы, которые используют органические соединения: сахара, оксикислоты, многоатомные спирты

Классификация бактерий по источнику азота ► Прототрофы - усваивают азот из атмосферы, солей аммония, нитратов, нитритов, глюкозы; способны сами синтезировать все компоненты клетки ► Ауксотрофы - усваивают готовые азотсодержащие вещества из окружающей среды или организма хозяина; -теряют способность к синтезу какого-либо в-ва и требуют его наличия в среде культивирования ► В-во наз-ся фактор роста

Дыхание бактерий ► или энергетический обмен веществ – цепь последовательных окислительновосстановительных реакций, сопровождающихся переносом электронов от окисляющей системы к восстанавливающей и катализируемых строго специфичными ферментными системами.

Классификация бактерий по типу дыхания ► 1. Облигатные аэробы ► 2. Облигатные анаэробы ► 3. Факультативные анаэробы Среди них выделяют: А) Микроаэрофилы Б) Капнеические

Облигатные аэробы ► Не развиваются без доступа кислорода, ► Используют энергию, освобождающуюся при реакциях окисления, протекающих с поглощением свободного молекулярного кислорода. ► Растут на поверхности питательных сред. ► Например: холерный вибрион, возбудители сибирской язвы и туберкулеза

Облигатные анаэробы ► Кислород для них – яд! ► Они осуществляют ферментативное расщепление углеводов в анаэробных условиях – брожение. ► Растут на дне или в толще плотной питательной среды. ► Например: клостридии столбняка, ботулизма, газовой анаэробной инфекции

Факультативные анаэробы ► растут как при доступе кислорода, так и при его отсутствии. ► Используют энергию как от окислительных реакций, так и от брожения. ► Например: эшерихии, сальмонеллы, стафилококки

Особенности метаболизма риккетсий, хламидий, микоплазм ► Риккетсии Не способны синтезировать некоторые макромолекулы → облигатный внутриклеточный паразитизм ► Хламидии § Не способны синтезировать некоторые макромолекулы → облигатный внутриклеточный паразитизм § Не способны синтезировать АТФ – «энергетические паразиты» ► Микоплазмы Не способны синтезировать стерины для ЦПМ – «мембранные паразиты»

Ферменты микроорганизмов ► белки, участвующие в метаболизме бактерий, ► распознают соответствующие им метаболиты, вступают с ними во взаимодействие и ускоряют течение химических реакций

Классификация бактериальных ферментов по механизму действия ► 1. Оксидоредуктазы – окислительновосстановительные ферменты ► 2. Трансферазы – переносят отдельные радикалы и атомы от одних соединений к другим ► 3. Гидролазы – ускоряют реакции гидролиза = расщепление веществ на более простые с присоединением молекулы воды

Классификация бактериальных ферментов по механизму действия ► 4. Лиазы (карбоксилазы) – отщепляют от субстратов химические группы негидролитическим путем ► 5. Изомеразы – превращают органические соединения в их изомеры ► 6. Лигазы = синтетазы – ускоряют синтез сложных соединений из простых

Классификация бактериальных ферментов ► Экзоферменты ► Эндоферменты Синтезируются во внешнюю среду Локализация: § Периплазматическое пространство § ЦПМ § Цитоплазма

Классификация бактериальных ферментов ► Конститутивные ► Индуцибельные ► Ферменты вирулентности (патогенности): коллагеназа, ДНКаза, нейраминидаза, лецитиназа – Синтезируются постоянно (в том числе и при отсутствии субстрата) Синтезируются только при наличии субстрата разрушают ткань и клетки, обусловливая распространение бактерий и их токсинов в инфицированной ткани

РОСТ И РАЗМНОЖЕНИЕ БАКТЕРИЙ

► Рост – координированное воспроизведение всех клеточных компонентов и структур, ведущее к увеличению массы клетки, ► - согласованное увеличение количества всех компонентов клетки. ► Размножение – увеличение числа клеток в популяции

Способы размножения бактерий ► Бинарное деление ► Почкование ► Фрагментация нитевидных форм ► Экзоспоры ► Особый цикл деления Большинство бактерий: § перегородка формируется от КС к центру клетки – Г+ § перетяжка клетки (клетка истончается посередине) – Г– § Микоплазмы § дрожжи § Актиномицеты § Микоплазмы Стрептомицеты Хламидии

Цикл развития хламидий Стадия Функция Элементарной тельце Инфекционная (проникновения в клетку-хозяина путем инвагинации места адсорбции) Ретикулярное (инициальное) тельце Репродуктивная (размножение бинарным делением → формирование цитоплазматического включения – микроколонии) Промежуточное тельце Переходная форма от ретикулярного тельца вновь к элементарному тельцу

Характер роста бактерий на жидких питательных средах §диффузная муть – большинство бактерий §плёнка – «коховские бактерии» §придонный или пристеночный рост – стрептококки §плёнка со спускающимися вниз «сталактитами» – возбудитель чумы

Характер роста бактерий на плотных питательных средах §S-форма колоний ( «гладкая» ) ►кокки ►Грамотрицательные палочки, кроме возбудителя чумы §R-форма колоний ( «шероховатая» ) ►Грамположительные палочки ►Возбудитель чумы

Требования к условиям культивирования бактерий ► 1. Питательные потребности § простые – растут на универсальных питательных средах § сложные – растут на специальных питательных средах ► 2. Температура культивирования § ≈ 37°С – мезофилы (бол-во патогенных бактерий) § 6 – 20°С – психрофилы (возбудители чумы и лептоспироза), § 50 – 60°С – термофилы (актиномицеты, спороносные бациллы).

Требования к условиям культивирования бактерий ► 3. Реакция среды (р. Н) § кислая –р. Н = 4, 0 -6, 0 § нейтральная – большинство патогенных бактерий § щелочная – для холерного вибриона р. Н = 7, 8 -8, 6 ► 4. Условия аэрации § не принимают во внимание – факультативные анаэробы § ↓ О 2 – микроаэрофилы § ↑ СО 2 – капнофилы § без доступа воздуха – анаэробы § с обязательным доступом воздуха – облигатные аэробы

Требования к условиям культивирования бактерий ► 5. Длительность культивирования - зависит от времени генерации, ► - для большинства бактерий составляет 24 -48 ч; некоторые растут дольше: - бактерии коклюша – 2 -5 сут, - микробактерии туберкулеза – 3 -4 нед. ► ► 6. Освещение - например, микобактерии.

Питательные среды ► А) должны содержать воду, т к все процессы осуществляются в воде ► Б) должны содержать органический источник углерода и энергии: - Органические соединения: углеводы (Глюкоза!) аминокислоты, органические кислоты, липиды, - пептон- продукт неполного гидролиза белков, состоит из поли-, олиго- дипептидов,

Питательные среды В) должна содержать: ► - источники азота – пептон и соли аммония, ► - серы - сульфаты, ► - фосфора - фосфаты, ► ► - микроэлементы = ионы кальция, магния, магранца, железа – соли (фосфаты) ► Г) должна обладать буферными свойствами = фосфатный буфер или фосфатный буфер + карбонат кальция ► Д) должна быть изотонической – 0, 87% хлорид натрия

Классификация искусственных питательных сред ► По происхождению: ► Естественные – натуральные продукты животного, растительного или микробного происхождения (молоко, сыворотка, кровь, картофель, морковь), ► Синтетические – химически чистые соединения в строго определенных концентрациях = минимальные среды (Основа: минеральные соли и глюкоза), ► Полусинтетические – минимальные среды, к которым добавлен пептон и дрожжевой экстракт

Классификация искусственных питательных сред ► По сложности изготовления: ► Простые – выпускаются промышленностью в сухом виде; ►основу их составляют пептоны – продукты ферментативного или кислотного гидролиза белков животных и рыбы (питательный бульон, питательный агар), ► Сложные - готовятся на основе простых: добавляют 1% сахара, 10 -20% сыворотки крови или 5 -10% крови Кровяной агар, сахарно-сывороточный агар)

Классификация искусственных питательных сред ► По консистенции ► Жидкие – мясной или рыбный бульон на дистиллированной воде (Питательный бульон), ► Плотные – готовятся на основе жидких, добавляют 1, 5% агар-агара (полисахарид, получ-й из морских водорослей), силикагеля или 10 -15% желатины (Питательный агар) ► Полужидкие – готовят на основе жидких, но агара или силикагеля добавляют 0, 7%, а желатины – 57, 5%

Классификация искусственных питательных сред ► По составу § Натуральные ►простые § мясо-пептонный агар и бульон (МПА и МПБ) § желатин § молоко § кусочки овощей ►сложные простые + добавка § Синтетические

Классификация искусственных питательных сред ► По назначению ► Консервирующие – применяются для предотвращения отмирания бактерий в патологическом материале (Глицериновосолевая смесь), ► Основные – применяются для культивирования большинства бактерий (Питательные бульон и агар), ► Элективные – обеспечивают оптимальные условия для выращивания одного вида бактерий (Желточно-солевой бульон для стафилококка, желчный бульон для сальмонелл), ► Дифференциально-диагностические – применяются для изучения биохимических свойств при идентификации бактерий (Среды Гисса, Ресселя, Эндо)

Методы создания анаэробных условий для культивирования бактерий

Физические ► культивирование в анаэростате (выкачивается воздух) или аппарате Киппа (замещается инертным газом, например азотом) ► засев уколом в высокий столбик (полужидкой среды) ► культивирование под слоем масла

Химические ► включение в питательную средуцирующих веществ (связывают растворённый в среде кислород) § глюкоза § тиогликолевая кислота и др.

Биологические ► метод Фортнера (в замкнутом объёме культивируются анаэробы и жадный аэроб – после прекращения роста которого в безкислородной среде начинают расти анаэробы)

Метод Китта-Тароцци ► среда Китта-Тароцци § МПБ с глюкозой § на поверхности – масло § на дне – кусочки печени

Этапы бактериологического исследования ► 1. Забор материала ► 2. Транспортировка ► 3. Посев на плотные питательные среды для получения изолированных колоний. ► 4. Выделение чистой культуры ► 5. Идентификация

1. Забор материала а) выбор материала определяется клинической картиной: - при заболеваниях верхних дыхательных путей – слизь из носа и зева, мокрота; - при заболеваниях желудочно-кишечного тракта – испражнения, промывные воды, рвотные массы; - при генерализованных формах – кровь; ► б) материал берут до начала лечения – антибиотики затрудняют выделение; ► в) в разные стадии заболевания берут разный материал- н-р, брюшной тиф ► г) материал берут асептически в стерильную посуду ►

2. Транспортировка ► а) необходимы специальные транспортные среды, ► б) важно соблюдать условия транспортировки: - температура, - влажность, - время.

3. Посев материала на плотные питательные среды для получения изолированных колоний ► Колония – видимое скопление микроорганизмов, выросшее из одной бактериальной клетки на плотной питательной среде ► Изолированная колония – не соприкасается краями с другими колониями

4. Выделение чистой культуры и накопление биомассы: ► 4. 1. Изучение культуральных признаков ► 4. 2. Изучение морфологических и тинкториальных (отношение к окраске) признаков = приготовление мазка и окраска по Граму ► 4. 3. Посев на скошенный столбик элективной ► 4. 4. Проверка чистоты культуры = мазок, окраска питательной среды по Граму

Культуральные признаки бактерий ► – это характер колоний на плотной питательной среде Величина Форма Цвет Консистенция Поверхность Край Структура Крупные, средние, мелкие Круглые, овальные, розеткообразные, напоминающие гриву льва, яичницу и т. п. Белые, желтые, красные, бесцветные Сухие, влажные, слизистые Гладкая, морщинистая, плоская, выпуклая Ровный, волнистый, фестончатый Аморфная, зернистая, волокнистая

5. Идентификация выделенной чистой культуры ► Это изучение биохимических и серологических свойств бактерий: ► А) Определение сахаролитических ферментов ► Б) Определение протеолитических ферментов

Определение сахаролитических ферментов ► = посев на «пестрый ряд» (среды Гисса – включают в себя углевод и индикатор Андреде). ► Для сбора газообразных продуктов в пробирки помещают поплавок.

Определение сахаролитических ферментов ► Различают: - Короткий «пестрый ряд» включает углеводы: глюкоза, лактоза, мальтоза, сахароза, маннит - Длинный «пестрый ряд» включает те же углеводы, что и короткий ряд: глюкоза, лактоза, мальтоза, сахароза, маннит и дополнительно в его состав входят: ► 1) моносахариды: арабиноза, ксилоза, рамноза, галактоза; ► 2) полисахариды: инулин, крахмал, гликоген; ► 3) спирты: глицерин, дульцит, инозит

Определение сахаролитических ферментов ► Принцип действия утилизация содержащегося в среде углевода сдвиг р. Н в кислую сторону изменение цвета среды

Определение сахаролитических ферментов ► Учет результатов: 1. Если цвет среды изменился, бактерии ферментируют этот углевод до кислых продуктов (ставят в таблице букву К). 2. Если наряду с изменением цвета среды в поплавке обнаруживается газ, бактерии ферментируют этот углевод до кислоты и газа (ставят – КГ). 3. Если цвет среды не изменился, бактерии не ферментируют этот углевод

Определение протеолитических ферментов = посев бактерий уколом в столбик 10 -20% желатины и пептонную воду (в пробирку к пробке прикрепляют индикаторные бумажки: - 1. на индол = С 8 Н 7 N – Способ Эрлиха: в пробирку с культурой добавляют 2 -3 мл эфира и реактив Эрлиха (спиртовый раствор пара-диметил-амино-бенз-альдегид с хлористоводородной кислотой →встряхивают → розовое окрашивание или + горячий насыщенный раствор щавелевой кислоты → красное), ►

Определение протеолитических ферментов - 2. сероводород – Н 2 S – бумажка, смоченная сульфатом железа → при выделении Н 2 S образуется нерастворимый сульфит железа → черная окраска - или в пробирку с питательной средой добавляют смесь солей (сульфат железа, тиосульфат натрия, сульфит натрия) и уколом засевают истыпуемый штамм → по ходу укола черное окрашивание, - 3. аммиак=N Н 3 – лакмусовая бумажка.

Определение протеолитических ферментов Учет результатов: ► 1. При наличии протеолитических ферментов бактерии разжижают желатин, образуя «воронку» или «елочку» . ► ► ► 2. При образовании газообразных продуктов разложения пептона бумажки меняют цвет: бумажка на аммиак – синеет, бумажка на сероводород - чернеет, бумажка на индол – розовеет.

Определение наличия отдельных ферментов Для обнаружения каталазы на стекло наносят культуру и каплю 1 -3% р-ра Н 2 О 2 → пузырьки газа. ►

Определение наличия отдельных ферментов § оксидазная активность = покраснение индикаторной бумажки