Обмен нуклеиновых кислот и нуклеотидов
Биохимические основы хранения и реализации генетической информации Все виды переноса генетической информации основаны на матричном принципе.
Виды переноса генетической информации репликация ДНК транскрипция т-РНК и-РНК р-РНК трансляция белок
Репликация ДНК l l l Репликация ДНК – удвоение ДНК при участии ДНК-полимеразы, происходит в ядре в S-фазу клеточного цикла, предшествует делению клетки. ДНК-полимераза способна наращивать цепь ДНК только на 3′ – конце. Инициацию репликации регулируют сигнальные белки – факторы роста.
l l Стадии репликации: инициация – разрушение водородных связей и расхождение нитей ДНК (образование множества репликативных вилок) элонгация – удлинение дочерних нитей, исключение праймеров терминация – завершение образования двух дочерних цепей ДНК
Инициация l Начинается с расплетения участка ДНК → образуется репликативная вилка (с участием фермента геликазы). l У 3 -׳ конца закрепляется РНК-затравка (праймер), на другой нити закрепляется несколько праймеров.
Элонгация l синтез дочерней нити ДНК начинается с участка РНК-праймера → полимеризация мононуклеотидов, которые выстроились вдоль матрицы по принципу комплементарности с участием ДНКполимеразы, которая активируется РНКпраймером.
Считывание информации идет от 3´конца к 5´ концу (строится цепь 5´- 3´) – называется лидирующая. l На другой нити – полимеризация дезоксирибонуклетидов, строятся фрагменты Оказаки – отстающая нить. l
Репликация 3´ Лидирующая нить геликаза 5´ РНК-праймер вырезается РНК-праймер 3´ 5´ 3´ Отстающая нить фрагменты Оказаки 5´
Терминация l l l Праймеры вырезаются и происходит сшивка фрагментов ДНК-полимеразой. Образуется 2 ая спираль, которая образована материнской и дочерней нитями ДНК. Одновременно репликация идет в нескольких местах ДНК по всем направлениям – сайты репликации (ориджины).
Сайты (ориджины) репликации репликативная вилка
Понятие о теломерах и репликативной старости l l l На 5´- конце ДНК – особые участки, содержат частые повторы (ГГГТТА) – теломеры – роль стоп-сигнала при повторяющейся репликации. Теломеры не реплицируются → образованная нить ДНК всегда короче, чем её матрица (укорачивается при каждом репликативном цикле). После критического укорочения – клетка не делится (50 -60 раз делятся клетки в течении жизни человека).
Репликативная старость лежит в основе старения организма. У долгожителей – 80 -90 циклов деления. l Открыт фермент в эмбриональных клетках – теломераза – способен достраивать теломеры после репликации. l Введение стволовых клеток – высокий репликативный потенциал. l
Повреждения ДНК Структура азотистых оснований и нуклеотидов может искажаться как в ходе репликации, так и вне её (УФ-лучи, хим. агенты – Северин с. 157 -162). l Повреждения ДНК исправляются – репарация с участием репаративных семейств ферментов, которые вырезают поврежденные участки →образуется АП-сайт, в котором достраивается ДНК «правильными» азотистыми основаниями или нуклеотидами. l При врожденной недостаточности репаративных ферментов –мутация. l
Механизмы защиты ДНК от повреждений 1) 2) 3) 4) 5) Система репараций. Кодирующая часть генома (несущая информацию о белке) – 10% от всего генома (↓вероятность реализации мутации через белки). Не все мутации проявляются фенотипически. Апоптоз мутированных клеток. Мутации могут быть полезными.
l l l В репаративную систему входят: белки-ферменты узнающие ошибку белки- ферменты разрезающие в этом месте цепочку l ДНК-полимеразы достраивающие нить l ДНК-лигазы (сшивающие нить) завершающие репарацию.
Апоптоз – процесс естественной смерти l l клетки, морфологически проявляется прогрессирующей фрагментацией клеточных компонентов, включая ДНК Происходит гидролитический распад белков под действием протеаз, называемых каспазами и распад ДНК с помощью ДНКаз Эти ферменты не находятся в лизосомах, в отличии процессов, происходящих при некрозе, где работают лизосомальные ферменты
Контроль за структурой ДНК «Молекулярный полицейский» - белок Р 53 (кодируется геном p 53) l l v v v Активирует ферменты, разрушающие циклины (запускают репликацию) и дает время на работу ферментам репарации. Если дефект не устранен, вызывает гибель клеток путем апоптоза: биосинтез белков семейства Fos, Bax (активаторы каспаз - протеазы); биосинтез гликопротеида Fas/Apo 1 – рецептора для макрофагов и других клеток, уничтожающих остатки погибших клеток; биосинтез Bcl-2 – ингибитор каспаз (внутриклеточный белок, препятствует входу в цитоплазму клеток Са 2+, которые активируют каспазы).
l l l Все эти белки – маркеры апоптоза. При мутациях в гене р53 – апоптоз не включается, идет бесконтрольное деление клеток с поврежденной ДНК (раковая опухоль). Противоопухолевая терапия – активация апоптоза в опухолевых клетках путем повреждения их ДНК (химиотерапия – Северин, с. 543, с. 742 -747)
Транскрипция l l Транскрипция – перенос генетической информации от ДНК к м. РНК Переписывание генетической информации в виде последовательности дезокрибонуклеотидов в последовательность рибонуклеотидов
Биологическое значение : l l синтез м. РНК, которая выполняет роль матрицы для синтеза полипептида (белка) При транскрипции переписывается некоторый участок ДНК, называемый геном.
Транскриптон - участок матричной ДНК, с которой происходит процесс переписывания, то есть транскрипция l l Состоит из нескольких участков.
Структура транскриптона:
l l l Промотор – участок ДНК, к которому присоединяется фермент РНК-полимераза Оператор - участок ДНК, к которому присоединяются различные белки, регулирующие скорость транскрипции Терминатор - стоп - сигнал, завершающий транскрипцию.
3 этапа транскрипции: инициация l элонгация l терминация l
Инициация транскрипции l l Распознается большая бороздка ДНК РНК-полимераза находит промотор в ДНК и взаимодействует с ним ДНК на этом участке начинает плавиться (расплетаются нити ДНК) Промотор содержит пары А-Т, поэтому плавится достаточно легко
Элонгация транскрипции (синтез РНК) Для элонгации необходимо: l рибонуклеотиды, служащие субстратом и источником энергии для этого процесса l фермент: ДНК-зависимая РНК- полимераза l в процессе элонгации мононуклеотиды во вновь синтезированной цепи РНК строго комплементарны мононуклеотидам матричной ДНК
Терминация транскрипции l достижение РНК-полимеразы стоп-сигнала и отсоединение синтезированной РНК
l l Созревание и процессинг м. РНК При синтезе м. РНК транскрибируется ДНК, в которую входят участки информационные и не несущие информации, причем их до 90% После транскрипции участки РНК неинформационные – интроны, вырезаются Остаются экзоны - информативные участки РНК Из ядра в цитоплазму выходит созревшая РНК.
Генетический код l Генетический код – запись информации о первичной структуре белка (последовательности АМК) в виде последовательности рибонуклеотидов в м. РНК.
Свойства генетического кода: (повторить!) l триплетность l специфичность l неперекрываемость l вырожднность l универсальность l коллинеарность l непрерывность
Трансляция l l Трансляция - передача генетической информации от м. РНК на белок Перевод информации с языка последовательности рибонуклеотидов на язык последовательности аминокислот.
Участники процесса: l l l м-РНК, выполняющая роль матрицы аминокислоты, выступающие в качестве субстратов ферменты, в основном пептидилтрансферазы т-РНК, являющаяся переводчиком АТФ – синтез полипептидной цепи идет с затратой энергии
l Процесс трансляции, также как и процесс транскрипции, связан с перемещением вдоль молекулы нуклеиновой кислоты, разница в том, что рибосома шагает на три нуклеотида, в то время как РНКполимераза - на один
т-РНК имеет вторичную структуру, в виде клеверного листа
l l l Антикодоновая петля обеспечивает взаимодействие с кодонами м-РНК Акцепторный стебель обеспечивает специфическое взаимодействие с аминокислотой (каждой аминокислоте соответствует своя т-РНК) Петли обеспечивают взаимодействие с рибосомами.
Схема биосинтеза белка
l l Аминоацил т-РНК входит в рибосому, комплементарно связываясь с кодоном м. РНК затем происходит реакция при которой аминокислотные остатки связываются друг с другом, а т-РНК удаляется
l Этапы трансляции: Рекогниция – узнавание т-РНК соответствующей аминокислоты и её присоединение (фермент аминоацил-РНК-синтаза) l Инициация – присоединение к малой субъединице рибосомы м-РНК, затем присоединение большой субъединицы рибосомы l l Элонгация – образование полипептида Терминация – остановка процесса в соответствии со стоп-кодоном.
l Регуляция синтеза белка Регуляция осуществляется на уровне транскрипции 1. Механизм включения-выключения (индукция-супрессия) l Белки, у которых регулируется скорость синтеза, являются индуцибельными l Белки, у которых не меняется скорость синтеза, являются конститутивными
l l Регуляторные белки – репрессоры, связываются с оператором в транскриптоне и препятствуют работе РНК-полимеразе Регуляторные белки – индукторы, связываются с оператором в транскриптоне и активируют работу РНК-полимеразы
2. Механизм усиления l существуют особые участки ДНК – энхансеры (10 -20 пар оснований), с которыми связываются БАВ, чаще стероидной природы, усиливающие транскрипцию. l Такой механизм работает при действии стероидных гормонов. l Если участки ДНК, связываясь с белками, обеспечивают замедление транскрипции – сайленсеры.
3. Механизм координированного усиления или ослабления биосинтеза l Активные формы кислорода связываются с участками ДНК, где находятся гены, кодирующие все антиоксидантные ферменты.
Управление биосинтезом белка в медицине l l Многие антибиотики и антибактериальные препараты – ингибиторы процессов транскрипции и трансляции в клетках бактерий. Эритромицин – ингибитор перемещения м. РНК в рибосоме. Тетрациклины – препятствуют взаимодействию м. РНК в рибосоме с аминоацил-т. РНК. Анаболики (синтетические андрогены) – усиливают биосинтез белка энхансерным механизмом.
Методы работы с генным материалом Трудности в изучении ДНК заключаются в следующем: l Молекулы ДНК животных и человека имеют большие размеры l Такие молекулы неудобны для исследования и их предварительно разрезают, фрагментируют с помощью специальных ферментов - рестриктаз, выделяемых из бактерий l Рестриктазы «узнают» определенные последовательности и разрезают ДНК в определенных местах;
l l Количество ДНК в клетке невелико, поэтому необходим способ умножения (амплификации) изучаемой ДНК in vitro Таким методом является полимеразная цепная реакция - ПЦР, которая позволяет амплифицировать ДНК или ее фрагмент в миллионы раз за несколько часов
Метод ПЦР l l Осуществляют диагностику следующих заболеваний: ВИЧ –инфекции, гепатиты А, В, С, Д, цитомегаловирусную инфекцию, токсоплазмоз, хламидии - вирусные и бактериальные инфекции. Используют для ранней диагностики (до рождения) наследственных заболеваний. Криминалистика (идентификация личности). Оценка вирусной безопасности в донорской крови.
l l l ПЦР осуществляют в пробирке с помощью термостабильной ДНК-полимеразы при участии субстратов (нуклеотидов ДНК) и коротких олигонуклеотидных затравок праймеров Праймер - короткие, длиной в 20 -30 нуклеотидов одноцепочечные фрагменты РНК, комплементарные 3'-концевым последовательностям копируемой ДНКматрицы Реакция происходит в несколько стадий:
Стадии одного цикла ПЦР:
Денатурация. Инкубационную смесь нагревают до 90 о-950 (термостат). При этом происходит разрушение слабых связей в ДНК и из одной двухцепочечной молекулы образуются две одноцепочечные.
Гибридизация праймеров Температуру снижают до 50 о-60 o, при этом происходит гибридизация цепей ДНК с праймерами.
Полимеризация Инкубационную смесь нагревают до 70 о. При этой температуре полимераза удлиняет оба праймера с их 3'-концов. Праймеры дорастают до размеров матрицы и в результате количество ДНК удваивается.
l l l Метод основан на том, что первичная структура ДНК разных видов организмов различна. Подбираются последовательности, характерные для ДНК возбудителей болезни и подбираются такие праймеры, которые будут гибридизоваться с ДНК возбудителя, но не с ДНК человека. В этом случае продуктом амплификации будет ДНК только возбудителя, а не пациента.
l l l Клонирование генов Фрагменты ДНК можно вырезать из генома эукариот специально подобранными рестриктазами и встроить в ДНК плазмиды или вируса вскрытую (разрезанную) теми же рестриктазами Образуется гибридная плазмида или рекомбинантная ДНК. Однако таким способом получается очень небольшое количество рекомбинантной ДНК.
l Клонирование - это способ накопления. Для этого рекомбинантные плазмиды встраивают в бактерии и получают рекомбинантные бактерии, которые реплицируют, транскрибируют и транслируют «чужие» гены.
Схема синтеза проинсулина в трансформированных клетках E. сoli
l l l Рекомбинантные микроорганизмы нашли практическое применение как продуценты необходимых человеку веществ: белковых гормонов биологически активных пептидов (соматотропина, инсулина, интерферона, хорионического гонадотропина)
Скачать презентацию Обмен нуклеиновых кислот и нуклеотидов Биохимические основы
Обмен нуклеиновых кислот и нуклеотидов (3).ppt