О стратегии исследования гемостаза в клинике Основные

О стратегии исследования гемостаза в клинике

Основные компоненты системы гемостаза 1. Сосудистая стенка. 2. Тромбоциты. 3. Плазменные белки, свертывании. участвующие в

Современная схема гемостатических реакций эндотелий Обозначения: ТФ – тканевой фактор, II, V, VIII, IX, X, XIII – факторы свертывания крови, то же с приставкой «а» - активированные факторы свертывания крови. Момот А. П. , 2010 (по CSL Behring Gmb. H, 2008).

Противосвертывающая система Антикоагулянты + факторы фибринолиза АНТИКОАГУЛЯНТЫ v Антитромбин III – инактивирует ферментные факторы (тромбин, плазмин и др. ), кроме V и VIII. Кофакторы - гепарин, ГС - активируют АТ (до 1000 раз). v Протеин С (*К*) – разрушает Va и VIIIa. Кофактор - протеин S (*К*) v 1 -Антитрипсин, 2 -макроглобулин, 2 -антиплазмин, анти-С 1 – связывают и инактивируют любые активные протеазы.

ФИБРИНОЛИЗ Система фибринолиза Плазминоген t-PA PAI-1 ф. XII ----------FDP D-димер

В каких случаях нужно определять состояние гемостаза? · При наличии клинических проявлений - диагностика нарушений гемостаза, определение их причин · Скрининг перед оперативным вмешательством – оценка риска кровотечений или тромбозов · Контроль лечения препаратами, влияющими на гемостаз (антикоагулянты прямого и непрямого действия, тромболитические препараты, ингибиторы протеаз…)

Исследование гемостаза · I этап (клинический, первичный) - тщательный сбор жалоб и анамнеза, определение склонности к тромбозам или геморрагиям. · II этап (лабораторный, подтверждающий / уточняющий): а) скрининговые тесты (коагуляционное и тромбоцитарное звенья гемостаза) б) уточняющие тесты (в зависимости от клиники и результатов лабораторного скрининга)

КЛИНИЧЕСКИЙ ЭТАП исследования нарушений гемостаза v Информация о пациенте (пол, возраст, физиологические состояния, характер питания, физическая активность. . . ) v ЖАЛОБЫ: тип геморрагий (петехии, экхимозы, гематомы, кровотечения из мест пункции и операционных ран, из десен, носовые, маточные…) или проявления тромбоза v Anamnesis morbi (начало расстройств, предыдущие эпизоды, причинные факторы – экстракция зуба, травмы / операции, в/в вливания), нарушения menses… v Семейная история (случаи врожденной / приобретенной кровоточивости или тромбоза) v Предшествовавшая и текущая терапия (используемые лекарства и трансфузионные препараты, их эффективность) v Сопутствующие заболевания (уремия, нарушения функции печени, инфекции, опухоли…) v Данные объективного обследования (гепато- и спленомегалия, лимфаденопатия, кровь в кале и моче, признаки дисфункции печени, уремические знаки, Livedo reticularis, варикозные вены, признаки ТГВ…)

Взятие крови из вены «на гемостаз» Ø Исключить или учесть действие вводимых лекарств. Знать, когда и что в/в вливалось пациенту и когда была взята кровь. Ø После инфузии выждать не менее 1 ч (если возможно). Ø Максимально аккуратная венепункция, жгут – не более 1 мин ! Ø При исследовании функции тромбоцитов и/или плазменного гемостаза – не брать кровь из внутривенного катетера ! Ø Взятую кровь сохранять в закрытой пробирке, как можно быстрее доставить в лабораторию (1 ч; для ПВ – до 24 ч). Ø Центрифугирование: PRP – 150 g / 5 -7 min, PPP – 1900 g / 15 min. Ø Плазму хранить до 4 ч при комнатной to, иначе – заморозить.

Вакуумные пробирки для коагулологии Цитрат – 3, 2 % / 3, 8 % v Обязательно правильное соотношение цитрат / кровь: Недобор крови замедление свертывания Неполное заполнение = повышение концентрации цитрата в пробе, существенное (>10%) удлинение АЧТВ и ПВ. HCT – от 25 -30 до 55 %. v 3 -4 аккуратных переворачивания для перемешивания крови с цитратом (энергичное перемешивание => активация тромбоцитов). v Хранение – при комнатной температуре (нарушение температурного режима => гемолиз + активация ТЦ).

Что может наблюдаться у пациента? 1. Наклонность к кровотечениям (в том числе у родственников) 2. Наклонность к тромбозам (инфаркты, инсульты, ТЭЛА, венозные / артериальные тромбозы и др. , в т. ч. у родственников) 3. Выраженной клиники нет (предполагается хирургическая операция) 4. Пациент принимает препараты, влияющие на свертывание (гепарин, варфарин и др. )

ГИПОКОАГУЛЯЦИОННЫЕ СОСТОЯНИЯ - сопровождаются геморрагическими проявлениями • КОАГУЛОПАТИИ: • дефекты внешнего / внутреннего пути гемостаза • чрезмерная активация фибринолиза, дефицит α 2 -антиплазмина • передозировка антикоагулянтов • ТРОМБОЦИТОПЕНИИ, ТРОМБОЦИТОПАТИИ; • ВАЗОПАТИИ.

Если пациент склонен к кровоточивости, нужно: 1. Провести глобальный тест гемостаза (ВСК, АВС) * - необязательное исследование 2. Оценить тромбоцитарное звено гемостаза 3. Провести скрининговые тесты коагуляционного гемостаза (АЧТВ, ПВ / ПО / МНО, фибриноген / ТВ) 4. Провести тесты на патологию сосудистой стенки * - по показаниям

Глобальные тесты гемостаза Время свертывания цельной крови (ВСК) по Ли-Уайту: в стеклянной пробирке при комн. температуре – 6 -11 мин. Кровь пациента Методика Сухарева в капиллярах Нестандартизовано, большой разброс результатов… Активированное время свертывания крови (АВС) – после добавления стандартного каолина / целита, норма – 80 -120 сек. На экспресс-анализаторах для интраоперационного мониторинга гемостаза (АИК, гепарин + протаминсульфат).

Время свертывания цельной крови (ВСК) по Ли-Уайту > 12 мин - гипокоагуляция: - выраженный дефицит фибриногена и факторов внутреннего пути (расходование или снижение синтеза) - действие ингибиторов свертывания (антител, гепарина) - значительная гемодилюция Основное применение теста ВСК - экспресс-диагностика грубых нарушений гемостаза вне КДЛ.

Тесты тромбоцитарного звена v Длительность кровотечения при стандартном проколе кожи - методы Duke, Ivy, Шитиковой. v Количество тромбоцитов в крови (N = 150–(370 -450)х109/л) v Активность тромбоцитов (агрегация спонтанная и индуцированная разными дозами АДФ, коллагеном, адреналином, тромбином, ристомицином (активность v. WF), б/х маркеры активации ТЦ v Проточная цитофлуориметрия – выявление рецепторных гликопротеинов тромбоцитов (www. biocytex. fr ), Р-селектина…

Время кровотечения по Айви (Ivy) Норма 2 -9 мин, у детей 3 -12 мин. Учет времени – до 15 мин. Simplate II, Triplett Bleeding Time Device, скальпель, скарификатор… Учитывать: to воздуха, to тела, прием аспирина, НСПВ, др. лек-в, д-е алкоголя… Удлинение времени кровотечения - при ТЦ-пении, ТЦ-патии, авитаминозе С, болезни Виллебранда, васкулитах и др. Укорочение времени кровотечения – клинически незначимо. Чувствительность метода невысока: длительность кровотечения может быть нормальна при ТЦ-пении (иногда до 50× 109/л) и при легком течении болезни Виллебранда.

Подсчет количества тромбоцитов v В камере Горяева – низкая точность, возможно занижение результатов. CV = 25 -30%. v По Фонио – в мазке крови на 1000 эритроцитов. Низкая точность, субъективность, но можно одновременно оценить морфологию тромбоцитов. v На гематологическом анализаторе – точно, в стандартных условиях, быстро. Важно предотвратить агрегацию ТЦ и ЭР (перемешивание). CV реальн = 1 -2% - важно для оценки динамики.

Тромбоцитопении Причины: - Повышенное разрушение тромбоцитов – ауто- и гетероиммунные ТЦ-пении (в т. ч. хинидин, антибиотики, SAA, гепарин); Симптоматические АИТ - при СКВ, РА, ХМЛ, миеломной болезни, хроническом активном гепатите и др. ; - Уменьшение образования тромбоцитов (онкогематологические заболевания, Mts опухолей в костный мозг, последствия химиотерапии, токсинемии, инфекции); - Секвестрация ТЦ в селезенке (гиперспленизм), - «Расходование» ТЦ - ДВС крови, тромбозы. Тромбоцитопатии Причины: - Болезнь фон Виллебранда – нарушение адгезии ТЦ - ВРОЖДЕННЫЕ - тромбастения Гланцмана, синдром Бернара. Сулье, дефекты пула хранения. - Блокада ТЦ парапротеинами (гемобластозы) или при уремии - Лекарственная ТЦ-патия (аспирин).

Тромбоцитопения < 100 x 109/л v Наиболее частая причина кровотечений. v ТЦ < 100 х109/л => возможно удлинение времени кровотечения и излишняя кровопотеря при хирургических вмешательствах v ТЦ < 50 х109/л – тяжелая ТЦ-пения, риск самопроизв. геморрагий v ТЦ < 20 х109/л => высокий риск самопроизвольных кровотечений, v ТЦ < 10 х109/л => серьезные геморрагии (вплоть до фатальных). v В костном мозге - МКЦ (при разрушении ТЦ) или МКЦ (при нарушениях продукции ТЦ). v Дефекты ТЦ звена гемостаза распознаются: - количественные – путем подсчета клеток, - качественные – по времени кровотечения / агрегации ТЦ.

Алгоритм лабораторного исследования при тромбоцитопении Тромбоциты < 150 х109/л патология Исследовать костный мозг Уровень Hb, количество WBC норма Мазок периф. крови Фрагментация ЭР, шизоцитоз Агрегаты ТЦ ЭР нормальные, ТЦ нормальные или увел. размера Псевдо. ТЦ-пения, ЭДТА-зависимая агрегация ТЦ Микроангиопатическая гемолитическая анемия / ДВС / ТТП Лекарственная ТЦ-пения? сепсис, тромбозы, ожоги, обширные гемотрансфузии, острый промиелоцитарный лейкоз. . . Инфекционная ТЦ-пения? Иммунная (идиопат. ) ТЦ-пения? (этанол, САА, хинидин, тиазиды, эстрогены, гепарин) (СКВ, лимфома, СПИД) Врожденная ТЦ-пения? Взять кровь с цитратом или гепарином Harrison’s Manual of Medicine: 17 th ed. , 2008

Показатели активности тромбоцитов ИФА-тесты 1. Спонтанная и индуцированная агрегация ТЦ (индукторы – АДФ, коллаген, адреналин, тромбин, ристомицин) 2. PF 4 – тромбоцитарный фактор 4 3. -TG - -тромбоглобулин 4. Метаболиты тромбоксана (11 -дегидро. ТХA 2)

Агрегация тромбоцитов Учесть прием пациентом аспирина и НСПВ в предыд. 9 дней ! На агрегометре – спонтанная и индуцированная агрегация, разные виды и концентрации индукторов = тип кривой, ее параметры BIOLA – 230 LA CHRONO-LOG 590 Оптические агрегометры – по флуктуации интенсивности проходящего через PRP тонкого лазерного луча и методом Борна. Продолжительность анализа – 15 -30 мин, нужен бланк по PPP. Импедансные агрегометры – оценка изменений электропроводности разведенной цельной крови / PRP в ходе агрегации ТЦ. Продолжительность анализа – 5 -7 мин.

ЭКО-МЕД-С Импедансные POC-агрегометры Dia. Med Impact MULTIPLATE v работа с цельной кровью (300 мкл/тест) v тесты на действие антиагрегантов Verify. Now® Aspirin и Verify. Now® P 2 Y 12, Ultegra Т. В. Вавилова 2008 ЭКО-МЕД-СМ

Алгоритм диагностики ТЦ нарушений и v. WD Оценить морфологию ТЦ в мазке крови Присутствуют – SR Бернара-Сулье? Гигантские ТЦ ? Искл. ДВС, уремию, лейкоз Врожден. – наруш. пула хранения / дефект высвоб-я с АДФ - нет 2 -й волны агрегации Вторичн. – действие лекарств, лейкозы опр. v. Wf Ag, VII: RCo, ЭФ Патология – б-нь Виллебранда Агрегация ТЦ с АДФ, адренал. , коллагеном Отсутствие – тромбастения Гланцмана с ристоцетином Снижение – SR Бернара-Сулье ARUP Laboratories, 2004

Тестирование коагуляционного звена гемостаза при снижении свертывания крови

Активация плазменного гемостаза ь -т в по я ь на ут т йп ак и т нн II) он е к тр (X I у X Вн Тк ан ев ой фа Вн кт еш ор ни йп ут T ь V F IX Ia I VI > I-I VI IIa Общий путь <- -V II АЧТ Образование тромбина В II Образование фибрина I ПВ V--> Va Тест X

Гипокоагуляция по ПВ и АЧТВ Норма ПВ: 11 -15 сек (наборы и прибор), новорожд. – 13 -18 сек. Норма АЧТВ: 20 -45 сек (наборы + прибор!) ПВ ( % по Квику, ПТИ < 0, 8; МНО > 1, 2 -1, 5): - дефицит факторов внешнего пути (VII, IX, X, II, фибриноген): болезни печени, гиповитаминоз К / лечение АНД, поздние стадии ДВС… - действие антикоагулянтов (гепарин, ПДФ, антитела). Целевое значение МНО при лечении АНД – 2, 0– 3, 5. АЧТВ, ИАЧТВ > 1, 2: - дефицит факторов внутреннего пути (расходование, снижение синтеза ДВС во II – III фазе, болезни печени. . . ) - действие ингибиторов (антител, гепарина…) - избыток цитрата / нехватка крови ? КОРРЕКЦИОННАЯ ПРОБА с добавлением стандартной плазмы: АЧТВ осталось удлиненным = присутствие ингибиторов свертывания (антикоагулянтов или антител). АЧТВ нормализовалось = нехватка / отсутствие факторов.

ПВ капиллярной крови Тромбопластин + Са 2+ Капиллярная кровь с цитратом l Цитрат + капиллярная кровь l Меньшая точность и воспроизводимость анализа. l Зависит от гематокрита. l Предпочтительно – на специальном коагулометре. РЕНАМ

К а р т р и д ж н ы е INRatio (Hemo. Sense Inc. ) Pro. Time (ITC) Coagu. Chek XS (Roche Diagnostics) к о а г у л о м е т р ы

АЧТВ и ПВ при кровоточивости АЧТВ ↑ Норма ПВ (ПО, МНО) Норма Наиболее частая патология врожденная приобретенная Дефицит ф. VIII, IX, XI Ингибитор ф. VIII Волчаночный антикоагулянт (кровоточивости нет) ↑ Дефицит ф. VII ↑ Глубокий дефицит фибриногена (<1 г/л) Дисфибриногенемии Дефицит ф. II, ф. V, ф. X Норма Патология печени (дефицит ф. V и ф. VII) Гиповитаминоз K (дефицит только ф. VII) ДВС крови Массивные трансфузии Тяжелая патология печени Недост-ть факторов (амилоидоз) Умеренная недоста. Тромбоцитопения точность факторов Качественные нарушения ТЦ Болезнь Виллебранда (умеренной степени) Приобретенная б-нь Виллебранда Недостаточность ф. XIII

Количество фибриногена по Клаусу Активный тромбин Время (в секундах) Клоттинг-методика - время свертывания разведенной плазмы избытком высокоактивного тромбина (на коагулометре). Плазма, разведенная 1: 10 Высокоактивный тромбин 60 30 1: 40 1: 30 1: 20 1: 10 10 6 1: 5 3 0, 2 0, 4 0, 6 1, 0 2, 0 Фибриноген в г/л 370 С Плазма, разведенная имидазол. буфером 1: 10 Сгусток 4, 0 6, 0

Уровень фибриногена Норма: 2 - 4 г/л; у новорожденных – 1, 25 – 3, 0 г/л - гиперпотребление (ДВС, травмы, ожоги, состояние после кровотечения), шок, тяжелый токсикоз, лечение фибринолитиками), болезни соединительной ткани, злокачественные новообразования, тяжелая патология печени … «Гипокоагуляция» возможна при уровне < 0, 5 -1 г/л АЧТВ и ПВ напрямую НЕ ЗАВИСЯТ от уровня фибриногена (если он > 1 -1, 5 г/л).

Тромбиновое время (ТВ) «Фибриноген + антитромбины» неразведенная плазма + тромбин --> сгусток фибрина Норма – 12 -16 (10 -20) сек на коагулометре или вручную. - гипофибриногенемия, (дисфибриногенемии) - действие гепарина, ПДФ, парапротеинов… Применение - для контроля терапии гепарином и фибринолитиками

КОАГУЛОПАТИИ Врожденные – изолированная недостаточность фактора (v. WF, VIII, IX; реже - других) Приобретенные – обычно сочетанная недостаточность нескольких факторов.

Коагулопатии Гемофилия А – врожденная недостаточность ф. VIII (~ 1 -3 : 10000 населения). Тяжесть – по остаточному уровню фактора VIII. - гематомный тип кровоточивости: посттравматические кровоизлияния, гематомы, кровотечения из ЖКТ, после экстракции зуба, микро- макрогематурия и др. Диагностика гемофилии: - анамнез, клиника, - времени свертывания крови и АЧТВ; коррекция при добавлении нормальной плазмы, - нормальные ПВ, ТВ и функция ТЦ. Диф. диагноз – коррекционные пробы с фактор-дефицитными плазмами, активность ф. VIII, титр ингибитора.

Гемофилия (ингибитор ф. VIII) А. Н. Мамаев 2006

Гемофилия А Ингибиторные формы – 10 -15% пациентов. Причины: - после трансфузии экзогенного ф. VIII у пациентов с гемофилией, особенно тяжелой - после родов (через 2 -5 мес, длится 1 -1, 5 года) - при аллергических и иммунопатологических заболеваниях (ревматоидный артрит, СКВ, НЯК, бронхиальная астма, онкопатология, миелома… ) - реакция на лекарства – пенициллины, сульфаниламиды, левомицетин… - самопроизвольно, чаще в пожилом возрасте. Проходит после иммуносупрессивной терапии.

Болезнь Виллебранда - 0, 1 - 1% в популяции. - наследственный дефект / снижение выработки v. WF. - нарушение адгезии ТЦ => кровоточивость (петхиально-гематомная). Диагностика: 1. ристоцетин-кофакторная активность (v. WF: RCo – на агрего-метре, реакция с ристомицином), 2. антиген фактора v. WF: Ag – метод ИФА, 3. кол-во ТЦ, время кровотечения, АЧТВ, ПВ, активность ф. VIII, генетическая диагностика (? ). + мультимеры v. WF (электрофорез), связывание v. WF с коллагеном в лунке

Дефицит витамина К Причины: - Терапия варфарином, антибиотиками → угнетение кишечной микрофлоры, - Холестаз, мальабсорбция, диета… Диагностика: ПВ, N- АЧТВ, сочетанное снижение ф. II, V, IX, X, Пр. С, Пр. S на фоне нормального содержания других факторов. Патология печени - Нарушение синтеза факторов гемостаза, кроме ф. VIII и фибриногена (в острых случаях), - Умеренная ТЦ-пения, - Ускорение фибринолиза (нарушение синтеза α 2 -АП, снижение печеночного клиренса t-PA), возможно развитие ДВС. Диагностика: ПВ и АЧТВ (ПВ – в большей степени), N- фибриногена, ТЦ и ф. VIII, сочетанное снижение ф. II, V, VII, IX, XIII, AT III, Пр. С, Пр. S.

ВАЗОПАТИИ Причины: - врожденные – ангиоматоз, телеангиэктазии, болезнь Рандю-Ослера (недоразвитие субэндотелия), - геморрагическая пурпура при инфекционных заболеваниях (корь, скарлатина, сыпной тиф…), - геморрагический васкулит Шенлейн-Геноха. - авитаминоз С и др. Характерны телеангиэктазии (сосудистые звездочки), кровоточивость на фоне воспаленной, гиперемированной кожи.

Геморрагические васкулиты

Вазопатии Диагноз: - анамнез, клиника, - (+) ревмопробы (при воспалительных заболеваниях) - Время кровотечения, количество тромбоцитов, АЧТВ, ПВ, ТВ, ФЛА и функция тромбоцитов – в норме - Проба щипка под ключицей: при патологии - петехии или кровоподтек, отчетливо видимые через 24 ч. -Манжеточная проба – для определения резистентности стенки капилляров (м. б. вторичное нарушение из-за ТЦпении). Маркеры повреждения ЭНТ - времени кровотечения, - активности v. WF, PAI-1, тромбомодулина; - угнетение фибринолиза (лизиса эуглобулинов).

Основные исследования для уточнения причин кровоточивости Тесты Патологический уровень Время кровотечения по Айви более 10 -12 мин Количество тромбоцитов Оценка функции тромбоцитов (адреналин, АДФ, ристомицин) АЧТВ Протромбиновое время Тромбиновое время Анцистроновый тест Концентрация фибриногена Фактор Виллебранда Определение концентрации факторов (прежде всего VIII и IX) менее 80 -100 х109/л снижение агрегации гипокоагуляция (более 45 сек) гипокоагуляция (ПО более 1, 2) значительно удлинено патологические результаты менее 1, 0 г/л активность менее 50% активность менее 25% А. Н. Мамаев, 2008

Лабораторная оценка гемостаза при кровоточивости (USA) Внутр. путь гемостаза АЧТВ Внешний путь гемостаза ПВ / ПО / МНО Фибринообразование Фибриноген, ТВ или рептилазное время Активность факторов ф. II + VII или X (на базе ПВ), ф. VIII + IX + XI или XII (на базе АЧТВ), ф. XIII Ингибиторы факторов Микс-тесты ПВ / АЧТВ (с инкубацией), люпус-антикоагулянт, ингибиторы ф. VIII / IX Болезнь Виллебранда Активность ф. VIII, v. WF: RCo, v. WF: Ag, кривая ответа на ристоцетин, мультимеры v. WF Функция тромбоцитов Агрегация ТЦ с АДФ, адреналином, тромбином, коллагеном, арахидонатом, ристоцетином Фибринолиз Лизис эуглобулинов, PAI-1 ДВС D-димер (колич. ), АЧТВ, ПВ, фибриноген MAYO Laboratories, 2009

Лабораторное тестирование при склонности к тромбозам

Тромбофилии = предтромботические состояния (повышенная наклонность к тромбозам кровеносных сосудов и ишемии органов) Первичные (врожденные) Наследственный дефицит антикоагулянтов (АТ III, Пр. С, Пр. S…) Аномалии / гиперактивность прокоагулянтов (РАПС, лейденская и др. мутации) Вторичные (на фоне других заболеваний) Операции (особенно на сердце и крупных сосудах), тяжелые травмы костей, злокачественные опухоли, гестозы, СКВ / АФС, нефротический синдром, дегидратация, атеросклероз, болезни печени … + обездвиживание, ожирение, беременность и роды, длительный прием оральных контрацептивов… тромбофилия гиперкоагуляция (есть тромбофилии со склонностью к гипокоагуляции – АФС, дисфибриногенемии, дефицит ф. XII…)

Наиболее частые врожденные тромбофилические состояния с увеличенным риском венозной тромбоэмболии Вариант тромбофилии Фактор V Лейден Мутация гена протромбина Мутация МТГФР * Дефицит АТ III Дефицит протеина С Дефицит протеина S + Мутация гена PAI-1 + Мутация гена фибриногена У населения в целом, % 4 2 10 0, 02 0, 08 ? ? Относит. риск вен. тромбоза × 8 × 3 × 1, 5 × 25 -50 × 10 × 2 -10 - * метилентетрагидрофолатредуктаза Мамаев А. Н. , 2008

Лабораторные исследования при «простых» формах тромбофилий 1. Повышенная вязкость крови - общий и б/х анализ крови, Hct, вязкость крови и плазмы (? ). 2. Чрезмерная активация ТЦ звена – количество ТЦ, их агрегация под действием малых доз АДФ и ристомицина. 3. Дефицит / аномалии первичных антикоагулянтов – активность АТ, нарушения в системе Пр. С. 4. Избыток / гиперактивность факторов свертывания – фибриноген, ПВ (ПТИ, МНО), АЧТВ, нарушения в системе Пр. С; ТВ, ф. VIII. 5. Нарушения фибринолиза - XIIа-зависимый фибринолиз, стрептокиназный тест, TPA, PAI-1.

Антифосфолипидные антитела Ig. G, Ig. M, Ig. A к комплексам мембранных Θ фосфолипидов со специфическими белками (бета-2 гликопротеин 1 и др. ) • повреждают мембраны ТЦ и ЭНТ • подавляют активацию ферментных комплексов свертывания на ФЛ поверхности ТЦ • снижают антикоагулянтный потенциал ЭНТ РЕЗУЛЬТАТ: - тромбофилия in vivo (стаз, тромбозы малых и средних вен и артерий, тромбоэмболия) - гипокоагуляция in vitro. Кровоточивости нет !

Лабораторные тесты при АФС (дважды, с интервалом 6 -12 нед) ТЕСТ волчаночный антикоагулянт AЧТВ (люпус-чувствительное) увеличено ПВ (ПО, МНО) Микст-тест 1: 1 с нормальной плазмой увеличено или норма АЧТВ ↑, не нормализуется Микс-тест с фосфолипидами нормализация АЧТВ Активность ф. VIII норма + Ig. G / M / A к фосфолипидам / бета-2 -ГП 1 – ИФА-метод

Гипергомоцистеинемия - Дефицит витаминов В 6, В 12, фолиевой кислоты (кофакторы ферментов метаболизма ГЦ) - Некоторые заболевания (ХПН, гипотиреоз, онкология, В 12 дефицитная анемия) - Генетические дефекты ---> изменения структуры ферментов метаболизма гомоцистеина (мутация МТГФР) При высоком уровне гомоцистеина учащаются тромбоз глубоких вен и дефекты развития плода Определение уровня гомоцистеина – ИФА-метод, ИХЛ, иммунохроматография, биохимические тесты. В. В. Вельков, 2007

ПЛАЗМЕННОЕ ЗВЕНО: говорят ли скрининговые тесты гемостаза о гиперкоагуляции? ВСК - КЛИНИЧЕСКИ МАЛОИНФОРМАТИВНО: - травматичность процедуры взятия крови. - [ рост количества / гиперактивация плазменных факторов внутреннего пути (беременность, онкология… ), повышенная вязкость крови, тромбоцитоз ] АЧТВ – КЛИНИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ НЕВЕЛИКО: - попадание тканевого фактора в пробирку - [ избыток / активация факторов внутреннего пути - беременность, онкология… ] + острофазовый ответ с ростом уровня ф. VIII.

Скрининговые тесты гемостаза и гиперкоагуляция / тромбофилия ПВ ( ПТИ, % по Квику, МНО) – КЛИНИЧЕСКИ МАЛОЗНАЧИМО - попадание тканевого фактора в пробирку - [ гиперактивность факторов внешнего пути: повреждение сосудов, травмы, канцероматоз… + беременность и роды ]. уровня фибриногена - острофазовая реакция (воспаление, инфекции, травмы, ожоги, послеоперационный период, ОИМ…), болезни соединительной ткани, злокачественные новообразования. . . В норме м. б. при беременности, лечении эстрогенами и во время месячных. Уровень фибриногена с гиперкоагуляцией непосредственно не связан! ТВ - при гиперфибриногенемии. НЕ ГИПЕРКОАГУЛЯЦИЯ ! v Длительность кровотечения – УКОРОЧЕНИЕ НЕЗНАЧИМО !!!

Так что же свидетельствует об активации гемостаза и склонности к тромбообразованию? КЛИНИЧЕСКИ – повторные эпизоды тромбоза глубоких вен (DVT), тромбоэмболия легочной артерии (PE), ОИМ, ОНМК и др. - венозный стаз (беременность, иммобилизация…) - васкулиты, рак, миелопролиферативные заболевания - прием оральных контрацептивов, длит. введение гепарина… - тромбоцитоз (> 600 x 109/л) - присутствие ВА / АКЛ - дефицит естественных АК (АТ III, Пр. С, Пр. S) - РАПС, G 20210 A…

Маркеры активации плазменного гемостаза 1. Ранние – фрагменты протромбина F 1+2, комплекс тромбинантитромбин Т-АТ 2. В момент образования сгустка – фибрин-мономеры (FM), фибринопептид А (ФП А) 3. Поздние - D-димер, продукты деградации фибрина (ПДФ) *** Предикторы: ф. VIII, АТ III, Пр. С / Пр. S + РФМК – растворимые фибрин-мономерные кмплексы Маркеры повреждения эндотелия 1. Фактор Виллебранда (кол-во, активность) 2. ТPA, тромбомодулин 3. PAI-1, эндотелин, молекулы адгезии ( ICAM-1, VCAM-1, P- и Eселектины…)

D-димер < 0, 5 мкг/мл FEU, < 0, 25 мг/л DDU v Продукт распада фибрина, но не фибриногена => наиболее надежный маркер образования / лизиса фибриновых сгустков. v Определяется точными иммунологическими методами. v Инерционный параметр (Т 1/2=24 ч). v На результаты определения мало влияют техника взятия крови, примесь тромбоцитов и т. д. v Тест D-димера отражает "итоговую" эффективность антитромботической терапии. В результате гепаринотерапии и лечения клексаном у онкологических больных уровень D-димера снижается в 1, 5 -2, 5 раза. Нет D-димера = нет тромбов

Современные технологии определения D-димера Nyco. Reader II™ Повышенный уровень D-димера (более чем в 1, 5 раза от верхней границы нормы для соответствующего срока гестации) вне зависимости от количества РФМК в плазме требует назначения лечебных доз гепарина или НМГ и проведения дуплексного исследования сосудов (вен). А. П. Момот, 2010

Контингент, подлежащий обследованию на D-димер в первую очередь 1. Пациенты с подозрением на тромбоз (клинические проявления ДВС, ТГВ и ТЭЛА), а также с повышенным риском тромботических осложнений (мерцательная аритмия и др. ) 2. Больные, которым предстоит обширная операция. 3. Пациенты, которым нужно оценить эффективность антитромботической терапии (в т. ч. при онкологии).

ие Тесты антикоагулянтной системы Антитромбин III (количество) - ИХЛ, ИФА Антитромбин III (активность) – по инактивации стандартного раствора тромбина при добавлении плазмы пациента: 1. Клотинговый метод (Абильдгаард, 1970) – трудоемок, нестабильные результаты… 2. Метод с хромогенным субстратом (фотометрический) – точнее, удобнее в работе Норма: 75 -140% от уровня нормальной плазмы. ↓ - уменьшение синтеза (тяжелые заболевания печени, шоковые состояния, старческий возраст…), действие эстрогенов последние месяцы беременности, прием пероральных КА - МАЛОЗНАЧИМО / дефицит витамина К, прием АНД.

Протеин С 3. ИХЛ, ИФА – количество протеина С. N = 70 -130% от уровня нормальной плазмы - гиперпотребление (тромбозы, тромбофлебиты, ДВС); - уменьшение синтеза (старческий возраст, болезни печени, действие варфарина, длительный прием пероральных КА) => тромбофилия. Протеин S (Пр. S) – кофактор Пр. С; норма – 60 -140% от норм. плазмы. При острофазовой реакции (связывание с С 4 -BP) возможен недостаток Пр. S и снижение активности Пр. С.

Тесты активности фибринолиза 1. Лизис эуглобулинов – XIIa-калликреин-зависимый фибринолиз (укороченный вариант; N = 4 -12 мин) - снижение уровня плазминогена, или дисфибриногенемия, или - недостаточная активация фибринолиза (тяжелые болезни печени, передозировка трасилола и др. ) 2. Плазминоген (стрептокиназный хромогенный тест). N = 80 -120% от уровня нормальной плазмы. - снижение уровня плазминогена: - гиперпотребление - тромбозы, ДВС крови, действие стрептокиназы и активных протеаз; - уменьшение синтеза - тяжелые болезни печени. . .

Лабораторная оценка гемостаза при склонности к тромбозам (USA) РАПС (a. PCR) * + мутация Лейден G 1691 A (ПЦР) Люпус-антикоагулянт LA-АЧТВ, d. RVVT, микс-тесты Антитела к кардиолипину * Ig. M / Ig. G Антитромбин III Хромогенный метод, антиген АТ III Гомоцистеин (натощак) * Биохимический метод / ИФА Активность ф. VIII Клоттинговый / хромогенный метод Активность протеина С Хромогенный метод, антиген Пр. С Активность протеина S Общий и свободный Пр. S (антиген) Мутация гена протромбина G 20210 A * ПЦР-метод * - селективный профиль тестов при эпизоде тромбоза, приеме АК во время исследования или в последние 10 -14 дней MAYO Laboratories, 2009 Coagulaton Testing. Quick Guide to Coagulation Testing. Marques, MB; Fritsma, GA. AACC Press, 2006. -62 p.

Алгоритм для диагностики причины венозного тромбоза (ARUP Labs, 2004) Пациент < 50 лет с венозным тромбозом (первый случай, или «семейный» тромбоз) Патология – мутация Leiden РАПС или мутация ф. V Мутация ф. II G 20210 A Патология – недост-ть Пр. С Активность протеина S Патология – недост-ть AT III Патология – мутация протромбина Патология – недост-ть Пр. S Активность AT III Гиперактивность ф. VIII ? Гипергомоцистеинемия ?

Лабораторное тестирование приеме препаратов, влияющих на систему гемостаза

Контроль терапии прямыми антикоагулянтами (гепарин) Гепарин связывается с БОФ, PF 4, макрофагами и др. , и его активная концентрация 1. АЧТВ (удлинение в 1, 5 -2, 5 раза от нормы), ТВ, ПВ 2. АВС (point-of-care), ВСК 3. Динамика D-димера / РФМК в плазме 4. Количество ТЦ (опасность HIT !), ЭР, Hb, ЛЦ, Hct 5. AT III (не менее 70 -80% !) 6. (Анти-Xa-активность) - при назначении НМГ пациентам с почечной патологией, при беременности, тромбозах, длительном введении НМГ + Общий анализ крови на гематологическом анализаторе ТЦ (опасность HIT !), Эр, Hb, Hct, ЛЦ. ЦНИЛ Алтайского ГМУ

Контроль за лечением непрямыми антикоагулянтами (варфарин) ОБЫЧНАЯ СХЕМА во то чи я ли з бо бо ом Тр эм 1. ПВ (МНО) со стандартным тромбопластином. 2. АЧТВ. 3. Нарушения в системе Пр. С ( ). 4. РФМК в плазме. 5. Изоформы CYP 2 C 9, VKORC 1. Кр о Терапевтическое окно РАСШИРЕННАЯ СХЕМА во ст ь ПВ (МНО) со стандартизованным тромбопластином (целевой уровень МНО - 2, 0 – 3, 0). МНО

Динамика уровня витамин К зависимых компонентов гемостаза в первые дни терапии АНД Н. А. Липатова с соавт. (2006)

Мониторинг антикоагулянтной терапии (USA) Варфарин ПВ (в виде МНО) Нефракционированный гепарин АЧТВ Анти-Ха активность (хромогенный метод) Низкомолекулярный гепарин Анти-Ха активность (хромогенный метод) или не требуется Прямые ингибиторы тромбина (Лепирудин, Аргатробан; пероральные – Агабатран) АЧТВ Прямые ингибиторы Xa (Фондапаринукс, пероральные – Ривароксабан) Не требуется, или АЧТВ Антитромбоцитарные препараты (аспирин, клопидогрель, тиклопидин…) Не требуется, или 11 -d. ТХА 2, или АДФ-агрегация ТЦ Coagulaton Testing. Quick Guide to Coagulation Testing. Marques, MB; Fritsma, GA. AACC Press, 2006. -62 p.

Лабораторная оценка гемостаза Рекомендации Всероссийской Ассоциации по изучению тромбозов, геморрагий и патологии сосудов им. А. В. Шмидта – Б. А. Кудряшова и Российской Ассоциации медицинской лабораторной диагностики Санкт-Петербург, 2007 г. Оценочные тесты 1 -го уровня – лаборатории первичного звена Количество тромбоцитов, время кровотечения, АЧТВ, ПВ (МНО), уровень фибриногена Оценочные тесты 2 -го уровня – лаборатории диагностических центров и стационаров Агрегация тромбоцитов, D-димер (или РФМК), тромбиновое время, лизис эуглобулиновых фракций

Лабораторная оценка гемостаза Дополнительные тесты – в специализированных лабораториях При кровоточивости При тромбозах Фактор Виллебранда – активность Антитромбин III, протеины C и S, а. РС-резистентность Факторы свертывания – активность Генетический анализ – ф. V-Leiden, мутация гена протромбина Другие тесты - гомоцистеин, волчаночный антикоагулянт, антифосфолипидные антитела Агрегация тромбоцитов Контроль антитромботической терапии – в лабораториях всех уровней Нефракционированный гепарин – АЧТВ Антагонисты витамина К – МНО

Лабораторная диагностика Д В С (базовые тесты) 1. Активация свертывания и фибринолиза - D-димер, РФМК. 2. Потребление плазменных факторов - динамика фибриногена, АТ-III, АЧТВ, ПВ, ТВ. 3. Клеточные маркеры ДВС - динамика количества тромбоцитов и их спонтанной агрегации, умеренная анемия, шистоцитоз, фрагментация эритроцитов.

Лабораторное тестирование при подготовке к операциям и в их ходе

Ориентировочная коагулограмма Рекомендации Барнаульского филиала Гематологического научного центра РАМН Баркаган З. С. , Момот А. П. , 1999 г. 1. АЧТВ. 2. ПВ (% по Квику, ПТИ) 3. Уровень фибриногена в плазме. 4. РФМК (о-фенантролиновый тест). + количество ТЦ (на гематологическом анализаторе)

Активационная тромбоэластометрия Normal Норма Hyperfibrinolysis Гиперфибринолиз Thrombocytopenia Тромбоцитопения Hypercoagulation Гиперкоагуляция Тромбоэластометры ROTEM, TEG-5000 Время исследования – 10 -15 мин

Подведем итог. Основные скрининговые тесты при тромбофилии и склонности к кровотечениям Кровоточивость Склонность к тромбозам ВСК / ВСКа D-димер ПВ (ПТИ, МНО, % по Квику) РФМК АЧТВ / и. АЧТВ [ ФМ, Т-АТ, P-AP… ] ТВ Уровень фибриногена Количество тромбоцитов Время кровотечения Укорочение любого времени свертывания в «модельных» условиях клинически незначимо Кузнецова О. А. , Roche - 2010

СПАСИБО ЗА ВНИМАНИЕ ! alex_gilm @ yahoo. com