Новые методы исследования в гистологии Оглавление

Новые методы исследования в гистологии

Оглавление 1. Микроскопические методы исследования Ú Световая микроскопия Ú Люминесцентная м. Ú Иммунофлюорисцентная м. Ú Фазово-контрастная м. Ú Темнопольная м. Ú Стереоскопическая м. Ú Ультрафиолетовая м. Ú Поляризационная м. Ú Интерференционная м.

2. Электронная микроскопия. А) Трансмиссионная (изучение объектов на просвет) Б) Сканирующая (изучение поверхности объектов)

3. Новые методы исследования в гистологии Ú Лазерная сканирующая (конфокальная) микроскопия. Ú Сканирующая зондовая микроскопия (СЗМ) Ú Принципы АСМ Ú А) Контактные методы Ú Метод постоянной силы Ú Б) Полуконтактные методы Ú Метод отображения фазы Ú В) Многопроходные методики Ú ЭСМ (Электросиловая Микроскопия) Ú Метод зоны Кельвина Ú Сканирующая емкостная микроскопия Ú СМСМ (Статическая Магнитно-Силовая Микроскопия) Ú Диссипативная Силовая Микроскопия Ú Принципы спектроскопии Ú А) Силовая спектроскопия Ú Отображение Адгезионных Сил

Световая микроскопия Ú. Разрешающая способность 0, 2 мкм. Ú do =1/2λ, где λ- длинна волны (для видимого спектра 400 -800 НМ). Ú Объективы х10, х20, х40, х90. Ú Окуляры х5, х10, х15 и т. д. Ú Общее увеличение в 1500 -2000 раз. Ú При этом используются объективы двух типов: сухие и иммерсионные

Люминесцентные (МЛ-2, МЛ-3) Ú Позволяют изучать живые неокрашенные объекты. Изучая объекты в отраженном и проходящем УФ-свете, можно наблюдать компоненты клеток, обладающих собственной флюоресценцией. Прямое окрашивание люминесцентными красителями (флюорохромами), позволяет более четко выявить такие структуры клеток, которые трудно изучать в световом микроскопе. Ú -иммунофлюорисценция можно наблюдать реакцию АГ-АТ на уровне одной клетки.

Фазово-контрастный микроскоп Ú Для изучения живых неокрашенных объектов. Ú При этом можно получить контрастные изображения прозрачных и бесцветных объектов, не видимых при обычных методах микроскопирования.

Темнопольный микроскоп Ú Являясь разновидностью метода фазового контраста, дает негативное, по сравнению с позитивным фазовым контрастом изображение.

Ú Стереоскопические микроскопы дают прямое объемное изображение Ú Ультрафиолетовый микроскоп (повышает разрешающую способность м-па до 0, 1 мкм) Ú Поляризационный м. (для исследования объектов с упорядоченным расположением молекул - скелет. мускулатура, коллагеновые волокна и т. д. ) Ú Интерференционные м. (для опред. сухого остатка в клетках, определение толщины объектов)

Лазерная сканирующая (конфокальная) микроскопия. Преимущества

Преимущества 1. Позволяет резко повысить качество микроскопии при работе с “толстыми” срезами 2. Построение 3 -х мерной модели 3. Получение оптических срезов 4. Позволяет оценить подвижность белков в клетке и константы реакций, в которых участвуют эти белки.

Принципы АСМ 2 Схематическое изображение АСМ по патенту "Atomic Force Microscope" (US RE 37, 299)

СЗМ комплекс Рамановской спектроскопии Интегра Спектра

СЗМ комплекс для биологии Интегра Вита

СЗМ Solver PRO

Клетка водоросли Mode: AСМ Рамановское (a), СЗМ ИНТЕГРА люминесцентное (b) модель: Спектра Размер АСМ (c) 26 x 31 µm скана:

Комплексы ДНК-авидин “Полуконтактный метод” Комплексы ДНК-авидин . на слюде. Короткие фрагменты ДНК молекулами биотина на их концах связаны с авидином

ДНК

Конденсированная ДНК

Плазмидная ДНК

ДНК

ДНК в жидкости “Полуконтактный метод”

Молекулы антител

Молекулы коллагена

Рибосомы E. coli

Вирус Эбола Ú Вирус Эбола инактивированный в растворе параформальдегида Вирус Эбола Агрегат вирусов Эбола инактивированный в растворе параформальдегида

Лимфоциты человеческой крови

Human embryo fibroblast

АСМ изображение эритроцитов (кровь бурундука). Erythrocytes

Human embryo fibroblast

Лейкоциты

Human embryo fibroblast

Человеческий волос Изображение слева - рельеф поверхности(Метод Постоянной Силы), изображение справа - сигнал ошибки обратной связи(Контактный Метод Рассогласования).

Human embryo fibroblast

Ультромикротомирование. Ú 1 — блок; Ú 2 — срез; Ú 3 — ванночка, наполненная жидкостью; Ú 4 — нож; Ú 5 — требуемый угол между ножом и блоком Установка стеклянного ножа для получения срезов

Использование полутонких срезов для прицельной заточки блока а— полутонкий срез (искомый участок располагается в области правого нижнего угла среза); б — срезанная поверхность блока с выбранным участком для окончательной заточки блока; в — окончательно прицельно заточенный блок для получения ультратонких срезов

Окрашивание срезов Ú 1. Полутонкие срезы, полученные на ультрамикротоме, переносят на предметное стекло в каплю 10 %-го эта-нола. Ú 2. Стекло подогревают на пламени спиртовки. При этом спирт испаряется и срезы приклеиваются к стеклу. Ú 3. На только что высушенные срезы наносят насыщенный спиртовой раствор моногидроксида натрия или калия. Травление заливочной среды проводят в течение 10 мин. Ú 4. Промывают в проточной воде. Ú 5. Окрашивают гематоксилином Эрлиха в течение 10— 20 мин при температуре 100— 110°С (можно окрашивать и в термостате при температуре 56— 58 °С). Ú 6. Промывают в теплой воде в течение 1— 2 мин. Ú 7. Окрашивают в 2 %-м спиртовом растворе эозина в течение 20— 30 мин при температуре 100— 110° С (можно и в термостате при 56— 58 °С). Ú 8. Дифференцируют и обезвоживают в спиртах восходящей крепости. Ú 9. Просветляют в карбол-ксилоле, ксилоле и заключают в канадский или пихтовый бальзам.

ПОДГОТОВКА КЛЕТОК, КЛЕТОЧНЫХ СУСПЕНЗИЙ И ТКАНЕВЫХ ФРАГМЕНТОВ ДЛЯ СКАНИРУЮЩЕЙ (РАСТРОВОЙ) ЭЛЕКТРОННОЙ МИКРОСКОПИИ I. Подготовка к РЭМ клеток, культивируемых на подложках (покровных стеклах и др. ) 1) Промывание (37°С) растворе Хенкса (не более 1 мин. ) 2) Фиксация 2% р-ре глютаральдегида (0, 15 М натрий- какодилатном буфере) Длительность фиксации 2— 3 ч при комнатной температуре; при необходимости фиксация продолжается в теч-ие суток и более в холодильнике (5— 6°С). 3) Отмывание культуры р-ре Хенкса в течение 2— 3 мин. 4) Постфиксация в 1% растворе четырехокиси осмия. 5) Отмывание культуры от осмиевого фиксатора в дистиллированной воде (в двух сменах по 10— 15 мин в каждой). 6) Обезвоживание клеток. 7) Высушивание клеток. 8) Покрытие клеток металлом. 9) Наблюдение: столик-держатель с культурой помещают в камеру объектов растрового электронного микроскопа и подвергают РЭМ при ускоряющем напряжении 10 к. В.

II. Подготовка к РЭМ суспендированных клеток 1) Отделение клеток от суспензии путем центрифугирования (1000— 1200 об/мин в течение 3— 5 мин). 2) Промывание: клетки ресуспендируют в теплом (37°С) растворе Хенкса. 3) Фиксация: осажденные клетки ресуспендируют в теплом 2% растворе глютаральдегида. 4) Отмыванне от фиксатора: клетки отделяют от фиксатора центрифугированием, ресуспеидируют в растворе Хенкса (или Эрла) и вновь повторяют процедуру. 5) “Прикрепление” клеток к подложке. 6) Дальнейшую обработку пластинок с прикрепившимися клетками производят так же, как описано в разделе I, пп. 6— 9.

III. Подготовка к РЭМ мягких тканевых объектов Следует увеличить сроки процедур 1— 6. 1) При наличии в исходной суспензионной среде значительного содержания белка (плазма крови, асцитическая жидкость) процедуру промывания клеток можно повторить. 2) Пластинки до их использования сохраняют и смеси 96% зтанола с эфиром. 3) Постфиксация клеток во взвеси четырехокисью осмия пропускается, поскольку после осмирования клетки плохо прикрепляются к пластинкам из фольги.

Специальные (немикроскопические) методы исследования. 1. Цито- или гистохимия. 2. Цитофотометрия. 3. Авторадиография. 4. Рентгеноструктурный анализ. 5. Морфометрия. 6. Микроургия. 7. Метод культивирования клеток и тканей. 8. Ультрацентрофугирование. 9. Экспериментальный метод. 10. Метод трансплантации тканей и органов.