Новые лекарственные формы для люминесцентной диагностики и фотодинамической

Новые лекарственные формы для люминесцентной диагностики и фотодинамической терапии на основе наноразмерных композитов порфириновых фотосенсибилизаторов с амфифильными полимерами и наночастицами. А. В. Иванов РОНЦ им. Н. Н. Блохина РАМН А. Б. Соловьева ИХФ им. Н. Н. Семенова РАН Н. Г. Хлебцов ИБФРМ РАН И. П. Шилов ИРЭ им. В. А. Котельникова РАН

РОНЦ им. Н. Н. Блохина РАМН д. ф. -м. н. Иванов А. В. , к. м. н. Сухин Г. М. , к. б. н. Кузьмина З. В. , Полянская Н. И. ИХФ им. Н. Н. Семенова РАН д. х. н. Соловьева А. Б. , д. ф. -м. н. Тимашев С. Ф. , к. х. н. Глаголев Н. Н. , к. х. н. Аксенова Н. А. , к. ф. -м. н. Тимашев П. С, к. х. н. Тимофеева В. А. ФГУ «ГНЦ лазерной медицины ФМБА» д. м. н. Толстых П. И. , д. м. н. Шин Ф. Е. МГУ им. М. В. Ломоносова д. х. н. Мелик-Нубаров Н. С. , Жиентаев Т. М. ИРЭ им. В. А. Котельникова РАН, Фрязино к. т. н. Шилов И. П. , к. х. н. Румянцева В. Д. , д. т. н. Пожар Э. В. , к. ф. -м. н. Маркушев В. М. , Щамхалов К. С. ИБФРМ РАН, Саратов д. ф. -м. н. Б. Н. Хлебцов, к. б. н. Е. В. Панфилова, к. б. н. В. А. Ханадеев, д. б. н. С. А. Староверов СГУ им Н. Г. Чернышевского, Саратов д. ф. -м. н. Н. Г. Хлебцов, д. б. н. Г. С. Терентюк, А. В. Маркин

n Одна из основных проблем ФДТ – повышение ее эффективности при снижении побочных токсических проявлений. n Частичное решение этой проблемы может быть достигнуто созданием новых фотодинамических препаратов, однако известно, что на это требуется значительное время 5 -10 лет и серьезное долговременное финансирование. n Разработка новых более эффективных лекарственных форм уже созданных и получивших разрешение Фармакологического Комитета на применение препаратов. Это наиболее оптимальный, быстрый и окупаемый путь, поскольку в основе новых лекарственных форм заложены уже известные и хорошо себя зарекомендовавшие в лечебной практике препараты.

Ранее было показано, что комплексообразование амфифильных полимеров с порфириновыми фотосенсибилизаторами повышает эффективность воздействия ПФС на опухолевые клетки и опухоли поверхностной локализации у крыс в 10 - 30 раз ( патент РФ 2314806). Было также показано, что использование противоопухолевых антибиотиков (доксорубицин, винкристин) совместно с сополимерами этиленоксида и пропиленоксида (плюроников) способствует накоплению антибиотиков в опухолевых клетках. Этот эффект особенно выражен для опухолей с множественной устойчивостью к действию лекарств.

I. Фотодинамическая терапия I. Фотосенсибилизаторы: Димегин, фотодитазин – (препарат, применяемый в клинике) Динатриевая соль 2, 7, 12, 18 тетраметил-3, 8 -ди (1 метоксиэтил)-13, 17 -ди (2 оксикарбонил этил) порфирина Димегин, ДМ N-метил-ди-Dглюкаминовая соль хлорина е 6 Фотодитазин, ФД

2. Полимеры Этиленоксид 1. Плюроник пропиленоксид 2. Поливиниловый спирт — СН 2 —СН — ОН n 3. Полисахариды: 3. 1. Карбоксиметилцеллюлоза 3. 2. Хитозан

№ Полимер Растворимость в воде Цитотоксичность хорошая нетоксичен ограниченная нетоксичен 1 CMC 2 CMC + Chi 3 P-85 хорошая токсичен 4 P-127 ограниченная слабо токсичен 5 P-127 + Chi ограниченная токсичен 6 PBC хорошая нетоксичен 7 HPBC ограниченная слабо токсичен 8 HPMC хорошая нетоксичен 9 MC хорошая нетоксичен 10 PAA хорошая токсичен 11 LPL хорошая нетоксичен 12 HPL ограниченная токсичен 14 PBC+PVCL слабая нетоксичен

Состав и физико-химические характеристики мицелл плюроников. , Парциальный Гидро-динамический радиус мицеллы, RH, нм Отношение объема «опушки» к объему ядра в мицелле KKM, % [15] удель-ный объем, 30 0. 023 - - 26 40 0. 0030 0. 9054 3. 7 [2] 7. 3 6. 6 12600 100 65 0. 03 0. 8787 4. 5 [1] 11 13. 6 8400 76 30 0. 4 0. 8726 2 [16] 8 63 Мол. масса n L 61 2090 2 P 85 4500 F 127 F 68 Плюроник Радиус гидрофобного ядра мицелл, RC, нм m см 3/г [15]

Механизм взаимодействия плюроников с ПФС Рост фотокаталитической активности порфиринов в присутствии плюроников может быть связан как с эффектом мицеллярного катализа при концентрировании катализатора и субстрата в одной мицелле. Кроме того, солюбилизация может вызывать уменьшение размеров молекулярных агрегатов, которые некоторые порфирины образуют в водной среде. При агрегации активность порфиринов уменьшается. - димегин - фотодитазин - триптофан Вследствие разной гидрофобности димегин и фотодитазин могут локализоваться в разных областях мицелл плюроника.

Размеры мицелл плюроника F 127 (а), и его комплексов с ФС (б). При увеличении концентрации плюроника до 10 -3 моль/л средний размер мицелл не меняется. Размер агрегатов фотодитазина <10 нм. Присутствие фотодитазина в воде не меняет размер мицелл плюроника, составляющих 10 -15 нм. Рост активности агрегированного в воде димегина, очевидно, вызван в основном дезагрегацией. В случае ФД, не образующего заметных агрегатов, и локализованного так же, как и триптофан, в гидрофильной «опушке» плюроников, влияние полимера, вероятно, связано с локальным концентрированием субстрата и катализатора в объеме мицелл.

ВЛИЯНИЕ ПОЛИМЕРОВ НА НАКОПЛЕНИЕ ФОТОДИТАЗИНА В КЛЕТКАХ (а) - в отсутствие полимеров - в присутствии 0, 1% Р 85 (а) и ПВС (б) ØПолимеры не влияют на фотодитазина, проникшего в клетки (б) количество

ВЛИЯНИЕ МИЦЕЛЛ ПЛЮРОНИКА F 127 НА РАЗМЕР ПОР МОДЕЛЬНОЙ ЛИПИДНОЙ МЕМБРАНЫ Гидрофильные этиленоксидные фрагменты Схематичное изображение липидной мембраны со «встроенной» молекулой плюроника Гидрофобный пропиленоксидный блок Плюроники не влияют на размер пор липидных мембран, возникающих под действием 1 О 2 (по данным кинетики «вытекания» карбоксифлуресцеина). Однако, они стабилизируют возникающие в мембране дефекты и блокируют

. Влияние карбоксиметилцеллюлозы на фотоцитотоксичность фотодитазина

Влияние ПВС на фотоцитотоксичность фотодитазина

В присутствии амфифильных полимеров клетки гибнут в основном по механизму некроза

n n n Обнаружено повышение фотодинамического эффекта препаратов при использовании их в комплексе с полимерными носителями на 1, 5 -2 порядка Совокупность проведенных экспериментов показывает, что скорее всего эффект амфифильных полимеров в ФДТ связан с дезагрегацией ФС и со стабилизацией дефектов в мембране, вызванных воздействием синглетного кислорода. Обнаруженный эффект, по-видимому, является общим свойством для различных фотодинамических агентов в комплексах с рядом амфифильных полимеров.

Испытания на животных: Использовали мышей двух видов (мыши линии BALB/c, мышигибриды F 1(CBAx. С 57 Bl/6), которым прививали карциному легких Льюис и неимбредно размножаемые мыши с генотипом Swiss, (прививали асцитную карциному Эрлиха) и крыс линии Вистар (прививали опухоль М 1). Общее количество использованных животных составило 1230 мышей трех линий и 110 крыс линии Вистар. Использовали гель ПВС, содержащий 1% димегина. Эффективность ФД-воздействия определялась по динамике роста опухоли (для сόлидных вариантов роста 3 -х типов опухолей), числу метастазов в легких (для опухоли КЛЛ), а также клоногенной выживаемости клеток КЛЛ после переноса их в диффузионную камеру. n. Использование геля амфифильного полимера, содержащего димегин, не только повышает эффективность ПФС ~ в 10 раз, но и ослабляет интенсивность метастазирования опухолевых клеток в легкие.

Показано, что комплексообразование амфифильных полимеров с порфириновыми фотосенсибилизаторами повышает эффективность воздействия ПФС на опухолевые клетки и опухоли поверхностной локализации у животных в 10 - 30 раз ( патент РФ 2314806). Использование комплексов амфифильный полимерфотодитазин наряду с повышением эффективности ФДвоздействия позволяет в 10 -30 раз снизить концентрацию фотосенсибилизатора, а значит и терапевтическую дозу препарата, что ведет к заметному снижению нежелательных побочных токсических явлений n

n Ожоги и раны являются одними из наиболее широко распространенных видов травматических поражений. Увеличение в последние годы опасности террористических актов и возникновения стихийных бедствий повышает актуальность проблемы оперативного лечения поверхностных повреждений кожи, ожогов, гнойных ран. Только в России ежегодно до 600 тысяч человек получают ожоги и регистрируется более 12 млн случаев ушибов, ран, переломов костей верхних и нижних конечностей, что очень часто приводит к развитию гнойных процессов. В настоящее время для лечения гнойных ран и трофических язв начали применять фотодинамическую терапию (ФДТ).

Заживление огнестрельных ран у крыс при фотодинамической терапии с использованием комплексов фотодитазин-поливиниловый спирт Группа животных Исчезновен Очищение Появление Полное ие от детрита грануляций заживление признаков (сутки) воспаления (сутки) Контрольная (хлоргексидин) 13, 3 1, 4 13, 0 0, 5 14, 1 0, 9 34, 3 1, 7 1 -я опытная (ХЛ 12, 2 1, 3 раствор, 0, 05 мг/мл) 12, 9 1, 1 13, 3 1, 7 33, 8 1, 3 2 -я опытная (ФДраствор, 10 мг/мл) 11, 4 12, 7 1, 5 12, 4 1, 1 32, 1 1, 6 3 -я опытная (ХЛгель, 0, 05 мг/мл) 10, 9 1, 5 11, 2 1, 6 1, 3 31, 8 1, 5 4 -я опытная (ФДгель, 10 мг/мл) 7, 3 0, 9 6, 5 0, 1 6, 1 0, 4 25, 2 1, 5 5 -я опытная (комплекс ПВС-ФД) 5, 8 0, 69 5, 3 0, 7 5, 5 0, 3 22, 2 0, 6

оки очищения ран у больных от гнойно-некротических масс, появления грануляций и краевой эпителизации Метод лечения Традиционное лечение Сроки, сутки Появление Краевая Очищени грануляци эпители е й зация 6, 5± 0, 7 ФДТ с использованием 1% раствора 4, 1± 0, 5 фотодитазина в 25%ном димексиде ФДТ с использованием 3, 6± 0, 3 1% фотодитазина в геле Гель ПВС-ФД (0, 1% 2, 3± 0, 5 фотодитазин) 7, 8± 0, 6 7, 8± 1, 2 4, 7± 0, 4 6, 1± 0, 4 3, 6± 0, 3 5, 1± 0, 5 2, 4± 0. 5 4, 0± 0, 7

Динамика заживления ран в основной и контрольной группах.

. Сроки полного заживления ран в основной и контрольной группах. Лечение Количество больных Сроки заживления ран (сутки) ФДТ (АП-ФД) 40 20, 6± 2, 4 Традиционное 40 лечение 26, 0± 2, 7

Применение комплекса плюроник F 127 фотодитазин при лечении гнойно-некротической раны лопаточной области В 10 раз меньшая доза активного препарата в комплексе с полимером в 1, 5 -2 раза сокращает сроки закрытия ран Исходное состояние после некроэктомии На 2 -сутки после воздействия ФД-АП и облучения (рана очистилась) На 14 - сутки произошла эпителизация

n n Использование комплексов амфифильных полимеров с «Фотодитазином» позволит разработать высокоэффективный комплексный метод лечения ран и ожогов, основанный на совмещении ФДТ пораженных участков тела с воздействием бактерицидных факторов, что достигается при иммобилизации ФС на полимерных носителях, обладающих собственной бактерицидностью. Этот метод при использовании простой автономной аппаратуры для фотовозбуждения ФС позволит проводить первичную обработку ран и ожогов, препятствующую дальнейшему инфицированию травм, в условиях чрезвычайных ситуаций и отсутствия специального оборудования.

n Совершенно очевидно, что предлагаемые лекарственные формы «Фотодитазина» найдут применение при лечении воспалительных, эрозивных и неопластических процессов слизистой оболочки тканей в гинекологии, оториноларингологии и стоматологии, где достаточно широко применяются препараты в виде мазей, гелей и спреев.

n n В настоящее время рак по смертности стоит на 2 -м месте после сердечнососудистых заболеваний. Ежегодно в России регистрируется около 500 тысяч первичных онкологических больных и около 300 тысяч смертей от рака. По данным ВОЗ в мире в 2007 году произошло 7, 9 миллиона случаев смерти от рака (около 13% всех случаев смерти). По прогнозам Международного Агентства по изучению рака к 2015 году планету захлестнет эпидемия онкологических заболеваний. Ежегодно будут регистрироваться до 15 миллионов новых случаев, и ежегодно в мире будут погибать до 10 миллионов больных. По прогнозам ВОЗ в 2020 г. число онкологических больных увеличится на 50%, несмотря на значительный прогресс в развитии методов лечения рака.

Одной из причин такой ситуации является отсутствие реально применимых в широкой медицинской практике методов ранней диагностики рака. Новый подход, который может быть назван ранней люминесцентной диагностикой (РЛД), направлен на выявление наиболее распространенных, визуально и эндоскопически доступных нозологических форм злокачественых новообразований.

Терапевтические фотосенсибилизаторы принципиально не могут использоваться для эффективной первичной диагностики рака, поскольку их люминесценция в тканях всегда сопровождается процессом эффективной генерации синглетного кислорода как в злокачественных, так и в здоровых тканях организма, что вызывает ряд нежелательных побочных реакций.

Предлагается создание и использование для люминесцентной диагностики рака нового класса нефототоксичных ФС, которые практически не генерируют синглетный кислород, имея при этом высокие люминесцентные характеристики при сохранении уровня туморотропности терапевтических ФС.

Схема электронных переходов порфириновых сенсибилизаторов и образования синглетного кислорода

Для большинства синтезированных порфиринов были приготовлены комплексы с платиной, палладием, родием, иттербием, неодимом и рутением. n Иттербиевые комплексы были выбраны в качестве объектов исследования в связи с тем, что для этих комплексов при возбуждении π– электронной части молекулы была обнаружена ИК- люминесценция, обусловленная переходами 2 F 5/2 уровня 4 f электронов иона Yb 3+. n

Дикалиевая соль Yb(acac) -2, 4 диметоксигематопорфирина IX

Спектры люминесценции некоторых Yb-металлокомплексов порфиринов 1 - Yb(acac) –tetra-(1 -N- (p-fluorophenyl)-3(о-chlorphenyl) pyrazole-4 -il) porphyrin (10 -6 М, 40% DMSO); 2 - Yb(acac) - 2, 4 -dimethoxyhematoporphyrin IX (10 -6 М, 40% DMSO )

ИК спектры люминесценции опухолевой ткани (саркома) in vivo через 5 часов после введения Yb(acac)-2, 4 – диметоксигематопорфирина IX: а-центральная часть опухоли; b- периферия; с-прилегающая здоровая кожа; d- кожа контрольной мыши ИК спектры люминесценции опухолевой ткани (саркома) -1 и мышцы контрольной мыши -2 через 27 часов после введения Yb(acac)-2, 4 – диметоксигематопорфирина IX:

Полученные спектрально-кинетические данные позволяют рассматривать Ybкомплексы порфиринов как перспективные маркеры для люминесцентной диагностики опухолей без свойственной традиционным порфиринам фототоксичности и с высоким значением люминесцентного контраста.

n Тераностика – развивающаяся область медицины, сочетающая в себе терапию и диагностику, когда врачи используют одну технологию и для диагностики, и для лечения заболевания в ходе общей процедуры.

Термотерапия Суспензия специальным образом приготовленных наночастиц вводится внутривенно в организм больного. Из-за особенности ангиогенеза в опухоли сосудистая сеть оказывается проницаемой для наночастиц размером около 100 нм. Это обеспечивает избирательное накопление нанопрепаратов в опухоли, изменение фармакокинетики и существенное снижение токсичности. После накопления нанопрепарата в опухоли патологический участок подвергается облучению в определенном спектральном диапазоне. В зависимости от параметров и режима облучения в месте локализации наночастиц в ткани может быть за короткое время достигнута высокая температура, при которой раковые клетки погибают.

Прохождение наночастиц через поры в эндотелии В процессе ферментативного расщепления оболочек капилляров в эндотелии, устилающем их внутреннюю поверхность, образуются поры, размером 380 – 780 нм (в нормальных сосудах их размер не более 50 нм). Иногда размеры этих дефектов могут достигать значений до 1, 2 мкм.

В зависимости от физических характеристик (размера, качества и толщины металлического покрытия) наночастицы способны поглощать излучение в различных областях спектра (плазмонный резонанс), что делает возможным при изготовлении композиционных наночастиц варьированием технологических параметров наилучшим образом коррелировать их спектральные характеристики со спектральными свойствами определенных биологических тканей. Таким образом появляется возможность создания композиционных нанопрепаратов адресного действия. Способность ИК излучения проникать в биологическую ткань на большую глубину (до 10 см) в зависимости от типа ткани позволяет разработать методику фототермотерапии опухолей достаточно глубокой локализации с применением адресных композиционных нанопрепаратов, что представляет нерешенную пока проблему для неинвазивной лазерной термотерапии.

Для проведения нанотермотерапии подыскиваются материалы, обладающие сродством к опухолевым тканям или специфическими размерами 80 – 250 нм в диаметре. Клетки человека имеют размер 10000 -30000 нм в диаметре, органеллы – 2000 -30 нм, макромолекулы - <5 нм. Наночастицы меньше 20 нм могут свободно проходить сквозь стенки кровеносных сосудов. Чтобы доставить лекарственный препарат непосредственно в пораженный орган и преодолеть при этом фильтрацию в селезенке и печени, размер наночастиц должен быть не более 150 -200 нм и не менее 50 нм. В настоящее время установлен оптимальный размер нанопрепаратов 120 -170 нм.

Одним из перспективных материалов для использования в нанотермотерапии являются наночастицы золота и кварца, покрытые золотом. Как известно, золото среди всех остальных металлов обладает наибольшей тропностью к опухолевым тканям. Диаметр используемых частиц обычно составляет 50 нм, однако при длительном хранении они образуют агрегаты, трудно поддающиеся механическому разделению.

Настройка резонансов золотых наносфер и нанооболочек Окно прозрачности биотканей

Схема получения и применения нанокомпозитов

Обзорное (а) и увеличенные (б – в) ТЭМ изображения наночастиц и гистограмма распределения частиц по размерам (г). Показаны: сквозное отверстие и структура в центре частицы (б, стрелка), частицы различной структуры (вставки A-C), типичная толщина стенки полой наночастицы 4 -5 нм (D) и средний размер кубических наночастиц 53. 5 ± 5 нм

Фото и ТЭМ-изображения образцов

Доказательство функционализации Yb-HP: Флуоресцентные свойства Yb-HP +Yb-HP

1 - наночастицы Au nanocages, покрытые двуокисью кремния с HP – Yb концентрация – 7 mkg/ml 2 - раствор HP – Yb в воде концентрация 7 mkg/ml.

Фототермические свойства Au-Ag наноклеток и композитов.

Выживаемость He. La клеток при фототермотерапии 810 нм с помощью свободного Yb-HP и нанокомпозитов

ИК-люминесцентная детекция биораспределения нанокомпозитов в тканях мышей с привитой опухолью (Ehrlich carcinoma tumor)

n n Соловьева А. Б. , Иванов А. В. , Конопляников. А. Г. и др. Средство для лечения патологических изменений кожи методом фотодинамической терапии. Патент РФ № 2314806, 2008. Толстых П. И. , Соловьева А. Б. , Иванов А. В. и др. Способ лечения обширных гнойных ран мягких тканей. Патент РФ № 2396994, 20. 08. 2010. Румянцева В. Д. , Шилов И. П. , Иванов А. В. и др. Иттербиевые комплексы тетрапиразолилпорфиринов как флуоресцентные метки для диагностики злокачественных новообразований. Патент РФ 2372099, 10. 11. 2009. В. Д. Румянцева, А. Ф. Миронов, И. П. Шилов и др. Иттербиевый комплекс дикалиевой соли 2, 4 -диметоксигематопорфирина IX как флуоресцентная метка для ранней диагностики рака. Патент РФ 2411243, 10. 02. 2011 Хлебцов Н. Г. , Терентюк Г. С. , Иванов А. В. И др. Многофункциональный нанокомпозит для тераностики. Заявка на изобретение 2011117701 от 05. 2011

n n n Solovieva А. B. , Melik-Nubarov N. S. , Zhiyentayev Т. М. , Tolstih P. I. , Kuleshov I. I. , Aksenova N. A. , Litmanovich E. A. , Glagolev N. N. , Timofeeva V. А. , Ivanov A. V. Development of novel formulations for photodynamic therapy on the basis of amphiphilic polymers and porphyrin photosensitizers. Pluronic influence on photocatalytic activity of porphyrins. Laser Physics, 2009, vol, 19, issue 4, pp. 817 -824. Соловьева А. Б. , Толстых П. И. , Иванов А. В. , Глаголев Н. Н. , Мелик-Нубаров Н. С. , Жиентаев Т. М. , Шинн Ф. Е. , Кулешов И. Ю. Полимеры в фотодинамической терапии: наноразмерные комплексы плюроников с фотодитазином при лечении ожогов и гнойных ран. Альманах клинической медицины, 2008, с. 362 -366 A. B. Solovieva, P. I. Tolstih, V. A. Derbenev, N. N. Glagolev, A. V. Ivanov The Combine Laser And Photodynamic Treatment Effects In Vast Purulent Wound. Laser Physics, 2010, vol. 20, issue 2, pp. 421 -426 n A. V. Ivanov, V. D. Rumyantseva, K. S. Shchamkhalv, I. P. Shilov. Luminescence Diagnostics of Malignant Tumors in the IR Spectral Range Using Yb-Porphyrin Metallocomplexes. Laser Physics, 2010, vol. 20, issue 12, pp. 2056 -2065 n n B. Khlebtsov, E. Panfilova, V. Khanadeev, O. Bibikova, G. Terentyuk, A. Ivanov, V. Rumyantseva, I. Shilov, A. Ryabova, V. Loshchenov, N. Khlebtsov, Nanocomposites containing silica-coated gold-silver nanocages and Yb-2, 4 -dimethoxyhematoporphyrin: Multifunctional capability of IR-luminescence detection, photosensitization, and photothermolysis, ACS Nano 5, 2011. doi: 10. 1021/nn 2017974 Nikolai Khlebtsov, Boris Khlebtsov, Elizaveta Panfilova, Vitaly Khanadeev, Olga Bibikova, Sergey Staroverov, Georgy Terentyuk, Valentina Rumyantseva and Andrei Ivanov. Novel multifunctional nanocomposites for theranostics. 22 September 2011, SPIE Newsroom. DOI: 10. 1117/2. 1201109. 003832

Нанокомпозиты для тераностики

ivavi@ivavi. ru