НОРМАЛЬНАЯ ФИЗИОЛОГИЯ ЛЕКЦИЯ 2 Потенциал покоя

НОРМАЛЬНАЯ ФИЗИОЛОГИЯ ЛЕКЦИЯ 2 • Потенциал покоя • история вопроса • современные представления Гайдуков Александр Евгеньевич ФФМ МГУ 2013

ВВЕДЕНИЕ Электрические явления электрические поля и электрические (ионные токи), текущие через мембрану клетки, свойственны всем живым клеткам (!!!) Поверхностная мембрана всех живых клеток обладает фундаментальным свойством - способна разделять и накапливать электрические заряды (–) отрицательные - внутри, положительные (+) - снаружи. Наличие постоянного перепада электрического поля между внутренней и наружной средой клетки носит название потенциала покоя (ППо). ППо - основополагающее свойство л ю б о й клетки, как возбудимой, так и невозбудимой

Отличия между электровозбудимыми и невозбудимыми клетками • Возбудимыми называются клетки, у которых ионная проницаемость поверхностной мембраны изменяется при изменениях электрического потенциала на мембране • Возбудимыми называются клетки, обладающие способностью в ответ на деполяризующее действие электрического тока генерировать особый тип потенциала, т. н. потенциал действия (ПД) Возбудимые клетки: Невозбудимые клетки: • Нейроны • Клетки печени • Мышечные клетки (все типы) • Клетки почeк • Нейросекреторные клетки (гипофиз, • Глиальные клетки надпочечники) • Рецепторные клетки • Клетки крови и др. (сетчатка, волосковые клетки, механочувствительные клетки) Потенциал действия (ПД) возникает на основе предсуществующего у клетки ПОТЕНЦИАЛА ПОКОЯ

1 -й этап научного исследования биопотенциалов • Луиджи Гальвани (1791) «Трактат о силах электричества при мышечном движении» (De Viribus Electricatitis in Motu Musculari Commentarius) • Карло Маттеучи (опыты в 1830 -1865) Луиджи Гальвани (XVIII век) В 1780 году Гальвани обнаружил, что если к туловищу лягушки приложить железную пластинку, а к лапке - медную, и затем пластинки соединить, то мышцы лапки будут сокращаться. Гальвани трактовал этот факт как доказательство наличия "животного электричества", предположив, что мышца заряжена отрицательно по сравнению с нервом, и в цепи нервметалл-мышца-нерв возникает электрический ток. Карло Маттеучи продолжил проверку гипотезу о существовании «животного электричества» .

Опыты по измерению «тока покоя» Эмиль Дюбуа-Реймон Регистрация электрического тока струнным гальванометром (1848 -1851) «ток покоя» индифферентный электрод мышечное волокно Между внутренней и наружной поверхностью клеток существует перепад напряжения. При введении одного электрода внутрь клетки наблюдается ток - ток покоя! В клетку введен регистрирующий электрод, соединенный с другим, индифферентным, находящимся в наружной среде. Прибор – амперметр - указывает на появление тока в цепи в момент введения электрода в клетку. Это – свидетельство наличия потенциала между внутренней и наружной средой клетки Вопрос: • Как объяснить наличие пространственного разделения электрических зарядов - сосредоточения положительных зарядов снаружи клеток, а отрицательных – внутри, т. е. наличие электрического потенциала между наружной и внутренней поверхностью клеток?

Диффузионный потенциал Диффузия заряженных частиц – противо-ионов происходит с разной скоростью, в соответствии с их подвижностью в растворе электролита Вальтер Нернст ввел понятие «диффузионный потенциал» . Возникает в растворе электролита при диффузии анионов и катионов соли Анионы Катионы Соль А- К+ химическая сила, … пропорциональна заставляющая логарифму перепада диффундировать ионы концентраций С 1 С 2 Фронт анионов U- подвижность иона cм/сек : В/см = см 2 / В·cек

Вильгельм ОСТВАЛЬД Вводит понятие «электролитическая ячейка» для сосуда, разделенного полупроницаемой мембраной В соседние отсеки (ячейки) 1 и 2 налиты растворы электролита К+А- разной концентрации – С 1 и С 2 Ячейки отделены друг от друга ПОЛУПРОНИЦАЕМОЙ МЕМБРАНОЙ Р – проницаемость иона через мембрану, см/сек ΔV Ячейка 1 К + АС 1 РК > 0 Ячейка 2 А- – + К+ А - – + К+ К+ К+ P А= 0 Концентрации катиона К+ между ячейками 1 и 2 не выравниваются ! т. к. на мембране возникает трансмембранный потенциал !, - разновидность диффузионного потенциала, вычисляемого по формуле Нернста, когда «подвижность» одного из С 2 противо-ионов равна нулю!

Электролитическая ячейка Vм=0 С 1 1 С 2 А- АК+ М 2 К + Cl- – 2 М 1 =Р · С 1; поток слева направо ΔVм =Е к равн М 2 = Р·С 2 поток справа налево В ПЕРВЫЙ МОМЕНТ М 1 ≠ М 2 К+ А- – – + + + К+ ; Р · С 1 · е-V/KT = Р ·C 2 ПРИ УСТАНОВИВШЕМСЯ ПОТЕНЦИАЛЕ Vм потоки ионов калия ВЫРАВНЕНЫ М 1 = М 2 Величина потенциала рассчитывается по формуле Нернста … прологарифмировав, получаем

Конец XIX – Начало XX века опыты по определению - содержания калия в клетке, - движению воды из или внутрь клетки Концентрация ионов внутри клетки и в наружной среде Объект ИОН Концентрация, м. М внутри клетки снаружи клетки Гигантский аксон кальмара K+ Na+ Cl- 369 44 36 13 460 540 Скелетная мышца лягушки K+ Na+ Cl- 140 15 1, 2 2, 5 110 77 Мотонейрон кошки K+ Na+ Cl- 150 15 9 5, 5 150 125

Юлиус Бернштейн – 1902 -1912 гг. , Берлин - на основании данных физ. химии (работы Нернста, Оствальда) - используя данные о высокой концентрации К+ в клетке - используя данные о свободном движении воды через мембрану и возможном существовании электролитов в клетке формулирует «Мембранную теорию» происхождения «потенциала покоя» 1. Система – “Клетка – Наружная среда” может быть уподоблена электролитической ячейке Оствальда, разделенной полупроницаемой мембраной 2. В клетке высока концентрация ионов калия К+ (140 -150 ммоль) и А- органических анионов. В наружной среде концентрация К+ мала – 4 -5 ммоль. 3. Ионы калия проникают через мембрану, а их противо-ионы - органические анионы (А-) – не проникают. 4. В таком случае на мембране устанавливается потенциал, выравнивающий потоки ионов калия. ПП 0= Ек равн - равновесный потенциал для потоков ионов калия.

Согласно теории Ю. Бернштейна, «клетка может быть уподоблена электролитической ячейке» Электролитическая ячейка: Две камеры с жесткими стенками, наполненные растворами электролитов, К + А- и 2 1 К+ К+ А K+ - K+ K Камеры 1 и 2 разделены мембраной, проницаемой только для одного иона – иона калия Концентрация калия: CК+вн > CК+нар, К+Cl- Равновесным называется такой потенциал на мембране, при котором выровнены потоки ионов калия через мембрану и который равен по величине, но противоположен по знаку диффузионному потенциалу для тока калия.

Согласно теории Ю. Бернштейна, «клетка может быть уподоблена электролитической ячейке» Электролитическая ячейка: Две камеры с жесткими стенками, наполненные растворами электролитов, К + А- и 2 1 К+ К+ А K+ - K+ K Камеры 1 и 2 разделены мембраной, проницаемой только для одного иона – иона калия Концентрация калия: CК+вн > CК+нар, К+Cl- Для мышечного волокна лягушки: z=1; при T=20 C При переходе от натурального логарифма к десятичному 25 · 2, 3845 ≈ - 58 м. В реальный Vм= -90 м. В

Если выход ионов калия заряжает мембрану до Vм = ЕКравн , то изменяется ли при этом исходная концентрация иона в клетке? Какое количество зарядов (ионов калия) должно оказаться на наружной поверхности клетки, чтобы зарядить ее до - 100 м. В ? Клетка может быть уподоблена шаровому конденсатору, поверхность которого - (мембрана) – способна разделять и накапливать заряды. Удельная емкость мембраны клетки С = 10 -6 фарад/см 2 C K+ [А-] 9 [К]вн ΔQ= 10 -6 Ф = ΔQ ΔV · 10 -1 В = 10 -7 кулон/см 2 Разделив ΔQ (10 -7 кулон /см 2) на число Фарадея F = 96500 кулон/моль см 2 (~10 5) [К+] (моль)=10 -7 кулон/см 2 : 105 кулон/ моль·см 2 = 10 -12 моль = 10 -9 м. М Вывод : при зарядке мембраны до 0, 1 В концентрация калия в клетке (140 м. М) практически не меняется!

Экспериментальные подтверждения мембранной теории Ю. Бернштейна 1. Измерения МП мышечных волокон при разной температуре. При 20 о. С Определение темпер. коэффициента Q 10 ~ 1, 03 -1, 3 Косвенное подтверждение диффузионной, а не метаболической природы ПП 2. Измерения зависимости МП от [ К] нар – хорошо соответствует ПП 0, м. В Отклонение экспериментальной кривой от теоретической в области низких концентраций [К +] нар -90 -80 В случае соли КCl 2, 5 5 50 140 lg [К+] нар [K 2 SO 4]! Что будет с ПП 0 клетки, если мембрана клетки проницаема и к калию, и к хлору?

Теория Бойла – Конвея (1941) (Доннановское равновесие) В 1911 г. Фредерик Доннан провел опыты на электрохимической ячейке, мембрана которой проницаема к двум ионам и содержат разные растворы электролитов 1. В первый момент, когда в оба отсека налиты соответствующие растворы: Cl- Cl. K+ Возникает поток ионов Cl из 2 -й в 1 -ю камеру будет «тянуть» за собой и перемещение противо-ионов калия некоторое количество – х - успеет перейти в соседнюю камеру, прежде чем установится мембранный потенциал 2. В момент окончательного установления VM: потоки ионов калия и хлора выравнены тогда для потоков К+ тогда для потоков хлора отсюда условие Доннановского равновесия

Следствия из Доннановского равновесия т. е. из наличия у мембраны проницаемости к двум ионам: к калию, и к хлору 1. Сохраняется основная идея Бернштейна о том, что ППо РАВНОВЕСНЫЙ потенциал для проницаемых ионов. ППо= Еравн К = Е равн Cl 2. В отличие от потока калия наружу, движение хлора внутрь клетки сопровождается изменениями концентраций ионов в клетке. Δ К+ Cl - Vm= – К+ Cl- Внутри Снаружи Низкая концентрация хлора внутри клетки любое его перемещение из/в клетку будет менять не только заряд на мембране, но и концентрацию Clвн → и градиент концентрации Cl → химический градиент (и, и величина потенциала Есl) подстраивается к величине ПП.

Теория Бойла-Конвея. Роль калиевого и хлорного токов в создании и поддержании потенциала покоя деполяризация Деполяризация при увеличении [к +] нар – постоянна! Деполяризация при снижении [Cl-] снаружи нестойкая, т. к. сопровождается входом ионов хлора, изменением его внутриклеточной концентрации, градиента Роль потоков калия и потоков хлора – не одинакова !! в удерживании постоянства ПП 0.

40 -е годы XX века Модель мембраны, проницаемой к трем ионам – калию, хлору и НАТРИЮ ДАНО: ППо= - 80 м. В ; Еравн Na ≈ +30 м. В, а мембрана клетки пропускает ионы натрия !? Если мембрана клетки проницаема и к натрию, то потенциал покоя не может быть равновесным для трансмембранных потоков ионов натрия и других проникающих ионов – калия и хлора ППо ≠ Еравн К ≠ Еравн. Cl≠Е равн Na Вопрос: как же формируется и удерживается стабильный ППо порядка – 80 м. В?

Модель мембраны с тремя проникающими ионами Задача : количественно описать три тока – INa, IK, ICl текущие внутри мембраны при постоянном ППо как функцию : потенциала Vm, проницаемости Pi и перепада концентраций иона ΔСi (Vm) (мембранный потенциал) Ii = f ( Pi ) (проницаемость иона ) Δ (Ci) (перепад концентраций иона)

Модель электролитической ячейки, проницаемой к трем ионам В первый момент Vм Внутри клетки Через мембрану текут три противоположно направленных ионных тока калия, натрия, хлора. Каждый из токов участвует в создании потенциала на мембране В результате формируется стационарный потенциал покоя при котором разностные токи калия, натрия и хлора в сумме равны нулю.

Уравнение Нернста – Планка Постулаты теории постоянного поля Д. Гольдмана (1943 г. ) 1. Движение иона в мембране - аналогично его движению в свободном растворе, а Рi пропорциональна подвижности иона (U) в растворе 2. Напряжение электрического поля в мембране постоянно, и потому потенциал внутри мембраны распределяется линейно по ее длине: d. V/dx=сonst Разностный ток иона Ii = диффузионный поток иона через мембрану поток иона, обусловленный электрическим полем внутри мембраны Если допустить, что: Pi=U · β · RT Fх d. V/dх = сonst !!! Ii - разностный ток через мембрану, P – проницаемость иона, Ui –подвижность иона в мембране β – коэффициент распределения иона в мембране, [K+]0, [K+]i - концентрации иона снаружи и внутри клетки, β[K+]i – концентрация иона внутри мембраны; U – подвижность иона.

Модель мембраны с тремя проникающими ионами Уравнение Голдмана – Ходжкина – Катца «В момент установления VМ ионные потоки K+, Cl-, Na+ остаются не выравненными» . Но! Их алгебраическая сумма равна нулю!!! РК+> 0; РCl-> 0; РNa+> 0; Но! РА=0 и камеры – проточные. Уравнение разностного тока для токов натрия, калия и хлора Решаем для VM, и прологарифмировав, получаем:

МОДЕЛЬ МЕМБРАНЫ С ТРЕМЯ ПРОНИКАЮЩИМИ ИОНАМИ Уравнение Голдмана-Ходжкина-Катца ВОПРОС: Как соотносятся величины проницаемостей РK PNa PCl между собой при потенциале покоя? ППо = -70 - -100 м. В

Экспериментальная проверка уравнения Гольдмана–Ходжкина–Катца. аксон 1. Заменим весь Na. Cl на сахарозу, тогда вырождается в уравнение Нернста: , и измеряя VМ, узнаем [K+]в 2. Добавим в наружный раствор только ионы Na+ (Na 2 SO 4 вместо сахарозы) тогда , разделив на РК, получаем: →α = PNa/PK 3. Добавим снаружи ионы Cl- (заменив Na 2 SO 4 на Na. Cl) тогда , разделив на PK →β = PCl/PK , зная коэффициенты, получим Гигантский аксон кальмара - PK m. sartorius лягушки - : PNa : PCl = 1 : 0, 04 : 0, 25 PK : PNa : PCl = 1 : 0, 01 : 2

Модель мембраны с тремя проникающими ионами Уравнение Гольдмана- Ходжкина – Катца Проницаемость Р (см/сек) и Проводимость g (сименс) иона через мембрану Пассивная проницаемость иона – Рi (см/сек) обусловлена физическими свойствами канала утечки, НЕ зависит от Vм Проводимость g – показатель ионного тока, текущего через мембрану при Vm ≠ Е равн Зависит от Р и концентрации ионов

КЛЕТКА в терминах эквивалентной электрической схемы Мембрана клетки – изолятор между наружной и внутренней средой, имеющая проводимости для ионных токов Закон Ома I = V/R По закону Ома V~ЭДС I ток Для одного проникающего через мембрану иона

Пассивная проводимость мембраны – величина, пропорциональная току , сдвигающему потенциал мембраны на величину ∆V м ∆Vм = I м / gм Пассивная проводимость мембраны – постоянная величина. g= I ток Iм / ∆V ∆V = I g ++ ++ -- -- -65 м. В g утечки или пассивная проводимость мембраны Vм = ППо

Эквивалентная электрическая схема мембраны с тремя проникающими ионами – K, Na, Cl Каналы пассивной g. Na · (VM – ENa) = - g. K · (VM – EK) ионной проводимости Наружная среда Внутренняя среда клетки Равновесные потенциалы (ЭДС)

Каналы пассивной ионной проводимости В нейронах и других клетках обнаружены и выделены белковые молекулы, функционирующие как каналы пассивной проницаемости для: • Ионов калия (~15 подтипов) - димеры • Ионов хлора • Для ионов Na+ специальных каналов утечки не найдено ! Свойства каналов утечки: 1. Канал обладает избирательной проницаемостью к определенному виду ионов (только калия или только хлора) 2. Канал находится в открытом состоянии ПОСТОЯННО, не зависимо от потенциала на мембране! Нет ворот!!! 3. Каналы пассивной проницаемости обусловливают движение ионных токов через мембрану и сдвигов ПП в отсутствии ПД (электротон и т. п. подпороговые сдвиги МП)

Каналы пассивной ионной проводимости способны реагировать на различные воздействия

1. В состоянии ПОКОЯ мембрана клетки проницаема к трем видам ионов – к калию, натрию, хлору. 2. Потенциал покоя (ПП 0) клетки – стабильная величина. ПП 0 не является равновесным потенциалом ни для суммарных потоков ионов калия, ни для суммарных потоков ионов натрия. 3. В состоянии покоя через мембрану клетки текут пассивные ионные токи - ток калия IK+ - наружу, ток натрия I Na+– внутрь клетки. ПП 0=-80 м. В Ек равн=58 lg. C 1/C 2=-90 м. В ЕNa равн=58 lg. C 1/C 2=+30 м. В 4. В клетке должен существовать механизм для поддержания постоянства концентрационных градиентов Na и K и постоянства ПП 0. !!!!! Выкачивание Na+ и закачивание K+

Mg 2+-зависимая, Na+-, K+-активируемая аденозинтрифосфатаза (Na+/K+-АТФаза) обеспечивает перенос ионов Na и К против электрохимического градиента Jens Christian Skou (1957) The influence of some cations on an adenosine triphosphatase from peripheral nerves // Biochim. et. Biophys. Acta, 23, 394 -401 ATP ADP • – каталитическая (10 ТМ-доменов M 1 - M 10), ~ 100 к. Да (4 изоформы) • – регуляторная, ~ 45 к. Да (3 изоформы) + -субъединица - регуляторная, ~ 10 к. Да, относится к группе FXYD-белков

Каталитическая активность Na/K–ATФазы высокоизбирательно ингибируется сердечными гликозидами В 1785 году Визеринг сообщил об использовании листьев наперстянки для лечения сердечной недостаточности. Действующим началом являлся дигитоксин, соединение, относящееся к сердечным гликозидам – группе стероидных О-гликозидов. Наиболее известным соединением этого ряда является оубаин.

Модель работы Na/K–ATФазы Последовательное шлюзование ионов Один катионный центр с разным сродством к Na и K при разных конформациях фермента (E 1 vs. E 2) E 1 + 3 Na+ + ATФ 3 Na+– E 1 ~ P+АДФ E 2 - P + 2 К+ 2 K+– E 2 + P 2 K+ + E 1

Электрогенная функция Na/K–ATФазы При стехиометрии переноса = 3/2 МNa/МK = 3/2 Работа насоса создает выходящий ток катионов (Na) Скорость работы насоса : ~150 - 600 Na+/сек ГИПЕРПОЛЯРИЗАЦИЯ МЕМБРАНЫ ( «электрогенность» ) Факторы, влияющие на величину дополнительной гиперполяризации (за счет электрогенной компоненты работы насоса): • Плотность молекул насоса на мембране • Интенсивность работы насоса (по сравнению с другими токами через мембрану) • Входное сопротивление мембраны клетки • Величина ПП 0 Рассчитывая число выносимых зарядов (+) каждой молекулой, среднюю плотность молекул насоса на мембране (нейрона или аксона), вычислили плотность электрического тока, создаваемого работой насоса ~1 мк. А/см 2

Если плотность тока (INaнасоса) =10 -6 А/см 2 то каков может быть сдвиг мембранного потенциала (ΔVм) за счет этого тока? I. Гигантский аксон кальмара Rуд = 1 к. Ом·см 2 , INa - известен , тогда по закону Ома, сдвиг потенциала, создаваемый проходящим по «электрической цепи» клетки током: ΔV=INа·Rуд=10 -6 А /см 2 · 103 Ом·см 2 =10 -3 в = 1 м. В II. Нейроны моллюсков большое входное сопротивление мембраны, Rуд = 20 к. Ом·см 2 Cдвиг мембранного потенциала, создаваемый работой насоса -ΔVм = 20 м. В !! • Фоторецепторы (палочки) ~25 -30 м. В • Тучные клетки ~20 м. В • Нейроны ~10 -25 м. В • Гладкомышечные клетки артерий ~35 -40 м. В (!!!) При генерации ПД активность насоса повышается в ~2, 5 – 25 раз – достаточно, чтобы укоротить ПД и создать следовую гиперполяризацию при его завершении

Наличие наряду с пассивными токами калия и натрия (РK и РNa) еще и активных потоков (за счет работы насоса) – вклад которых оценивается через стехиометрический коэффициент – реально влияет на конечную величину СУММАРНОГО потока калия и СУММАРНОГО потока натрия, а значит – и суммарной проницаемости - P’Na и P’K В таком случае наиболее полное и корректное математическое написание Vм должно включать коэффициент

ХЛОРНЫЕ ТРАНСПОРТЕРЫ И ИХ РОЛЬ В ПОДДЕРЖАНИЯ ХЛОРНЫХ ТРАНСМЕМБРАННЫХ ГРАДИЕНТОВ Сопряженный вторично активный транспорт ионов Cl. Цифрами показано количество молекул воды переносимых через мембрану на один такт работы транспортеров. Переносит хлор ВНУТРЬ клетки Переносит хлор ИЗ клетки НАРУЖУ В нейронах представлены две противоположно работающие транспортные системы ионов Cl – это 1 Na+/1 К+/2 Cl- -котранспортер - NKCC-1 и 1 К+/1 Cl–-котранспортер - КСС-2. Конечный трансмембранный градиент для ионов хлора зависит от баланса работы этих транспортеров

В зрелых нейронах преобладает выкачка хлора, высок градиент Cl так что EСl равн более электронегативен чем ПП ЕCl равн > ПП -75 m. V < -80 m. V ПП < Eравн. Cl ПП -75 m. V -80 m. V Гиперполяризационный ТПСП

Неонатальный нейрон – относительно высок уровень [Cl]вн Зрелый нейрон

Эквивалентная электрическая схема мембраны

Спасибо за внимание… Вопросы? ? ?