Номер соглашения Оценка нейропротективных свойств соединений с известной

<Номер соглашения> Оценка нейропротективных свойств соединений с известной нейропротекторной активностью на культурах дифференцированных ИПСК, полученных от здорового донора и пациентов с БП Федеральная целевая программа «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2014— 2020 годы» Приоритетное направление: Науки о жизни Программное мероприятие: <Номер и название программного мероприятия> Соглашение № 14. 604. 21. 0115 от 22 августа 2014 г. на период 2014 - 2016 гг. Тема: Разработка экспериментальной модели in vitro и in vivo для изучения патогенеза спорадической формы болезни Паркинсона, поиска биомаркеров заболевания и скрининга обладающих нейропротективными свойствами биологически активных соединений на основе природных регуляторных нейропептидов Руководитель проекта: заведующий лабораторией, д. б. н. Сломинский П. А. Получатель субсидии Цели и задачи проекта Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт молекулярной генетики РАН Индустриальный партнер ЗАО «Инновационный научно-производственный центр «Пептоген» осуществляет производство пептидных лекарственных средств. За счет собственных средств участвует в разработке, синтезе, наработке и очистке пептидных нейропротекторных препаратов, разрабатываемых в рамках данного проекта. Ожидаемые результаты проекта В результате выполнения работ по проекту будет создана комплексная экспериментальная модель для скрининга и анализа веществ, обладающих нейропротекторной активностью. Возможности данной системы, сочетающей анализ ИПС клеток in vitro и грызунов с токсической моделью патологического процесса на грызунах in vivo, будут продемонстрированы на примере анализа нейропротекторной активности нового семейства потенциальных пептидных лекарственных средств , созданных на основе препропептида нейропептида глиальных клеток GDNF. Данная модель также будет использована для поиска и анализа новых транскрипционных биомаркеров болезни Паркинсона и формирования панели таких биомаркеров для проведения ранней и доклинической диагностики болезни Паркинсона на основании анализа транскрипционного профиля клеток периферической крови. Текущие результаты проекта Цель проекта – разработка комплексной экспериментальной модели болезни Паркинсона с сочетанием моделирования in vitro (на ИПС клетках и их производных) и in vivo (токсическая модель с введением крысам 6 гидроксидофамина) для тестирования потенциальных лекарственных средств, создание и тестирование на разрабатываемой модели серии пептидных препаратов с предполагаемой нейропротекторной активностью, выявление потенциальных биомаркеров для спорадической формы заболевания. Возможности данной системы, сочетающей анализ ИПС клеток in vitro и грызунов с токсической моделью патологического процесса на грызунах in vivo, будут продемонстрированы на примере анализа нейропротекторной активности нового семейства потенциальных пептидных лекарственных средств , созданных на основе препропептида нейропептида глиальных клеток GDNF. Данная модель также будет использована для поиска и анализа новых транскрипционных биомаркеров болезни Паркинсона и формирования панели таких биомаркеров для проведения ранней и доклинической диагностики болезни Паркинсона. Перспективы практического использования Область применения - скрининг соединений различной химической природы для выявления потенциальных нейропротекторов и оценки уровня их нейропротекторной активности в системе in vitro на основе ИПС клеток и в системе in vivo на основе токсической модели нейродегенеративного заболевания. На основании этого скрининга может быть сформирована панель нейропротекторов для дальнейшего анализа возможности их клинического применения при лечении нейродегенеративных заболеваний и могут быть разработаны методы массового производства этих нейропротекторов для проведения клинических исследований данных соединений и отбора наиболее клинически эффективных нейропротекторов. В конечном итоге могут быть разработаны принципиально новые лекарственные средства для лечения пациентов с болезнью Паркинсона и профилактики данного заболевания. Оценка нейропротективных свойств соединений с известной нейропротекторной активностью на крысах с токсической моделью болезни Паркинсона Оценка нейропротективных свойств соединений с известной нейропротекторной активностью на культурах дифференцированных ИПСК, полученных от здорового донора и пациентов с болезнью Вводимое вещество До Паркинсона (БП) операции Анализируемые вещества и контроли (% от контроля) Линии клеток Альфа. Семакс PGP АКТГ 6 АКТГ ААДА генетицин МСГ -9 4 -10 Здоровый донор 10, 6+1, 2 11, 8+1, 0 10, 2+0, 8 3, 3+ 1, 1 4, 1+ 0, 9 36, 5+1, 9 0 Пациент с БП 8+0, 5 7, 5+0, 9 4, 3+1, 0 9, 6+0, 8 1, 0+0, 3 29, 7+2, 0 0 № 1 Пациент с БП 2, 7+0, 4 4, 7+0, 4 1, 5+0, 3 4, 9+0, 8 3, 1+0, 2 16, 3+1, 3 0 № 2 Оценку нейропротективных свойств соединений пептида семакс, альфа-меланоцит стимулирующего гормона (альфа-МСГ), пептида PGP, фрагментов адренокортикотропного гормона АКТГ(6 -9) и АКТГ(4 -10) [1 -9], Nарахидоноил дофамина (AADA) проводили на дифференцированных в нейрональном направлении клетках, полученных из ИПС клеток здоровых о доноров и пациентов с БП. Для индукции повреждений культивируемых in vitro использовали окислительный стресс, который вызывали добавлением в культуральную среду 150 мк. М Н 2 О 2. Защитное действие пептидов оценивали по количеству жизнеспособных клеток с применением колориметрического теста (МТТ) для оценки количества живых клеток Получаемая с использованием различных пептидов нейропротекторная защита культивируемых клеток в условиях оксидантного стресса зависит как от структуры пептида (так, пептид семакс обладает более высокой нейропротекторной активностью, чем высокого ему гомологичный пептид АКТГ(6 -9)), так и от природы клеток. Нейропротекторный эффект наблюдается при низкой концентрации пептидов (10 -9 М), что позволяет использовать данную систему на основе нейронально дифференцированных ИПСК в качестве информативной тест-системы для оценки нейропротективных свойств соединений различной природы в условиях окислительного стресса, вызванного перекисью водорода. Это дает возможность на следующем этапе провести с использованием данной тест-системы скрининг обладающих нейропротекторной активность in vitro соединений и на качественно новом уровне подойти к поиску эффективных средств для предупреждения гибели нейрональных клеток при болезни Паркинсона. Номер соглашения 14. 604. 21. 0115 7 дней 14 дней 28 дней после операции Физиологический раствор 66± 11 45± 7 16± 4 6± 2 Альфа-МСГ 67± 13 44± 11 25± 5 20± 5 Семакс 69± 12 47± 8 27± 4 22± 5 PGP 66± 9 46± 7 24± 5 23± 4 АКТГ (6 -9) 67± 10 44± 8 20± 4 8± 3 АКТГ(4 -10) 68± 11 46± 6 22± 3 Уровень моторной активности крыс до введения им 6 -ГДА и через 7, 14 и 28 дней после начала введения. Результаты тестирования в эксперименте «открытое поле» , приведены среднее число пересекаемых квадратов и ошибка среднего 8± 2 L-DOPA 69± 8 55± 6 40± 6 35± 5 Для валидации модели БП in vivo на основании стереотаксического введения токсина 6 -ГДА в компактную часть черной субстанции мозга крыс-самцов были использованы пептидные соединения, тестированные на нейропротекторную активность в системе in vitro на нейрональных клетках, полученных на основе ИПС клеток. В качестве положительного контроля был использован препарат L-DOPA, широко используемый для лечения болезни Паркинсона. Токсическое повреждение в сочетании с интраназальным введением физиологического раствора приводит к резкому снижению моторной активности животных - к 14 дню число пересекаемых квадратов снижается в 4 раза, что связано с нарушением структуры черной субстанции при введении 6 -ГДА. Введение L-DOPA оказывает выраженное протективное действие. Среди проанализированных пептидов можно выделить две группы. Первая группа пептидов (Семакс, PGP, альфа-МСГ) оказывает нейропротективное действие как через 14, так и через 28 дней после проведения операции - хотя их эффект выражен слабее, чем эффект LDOPA. Два пептида - фрагменты АКТГ - оказывают кратковременное нейропротективное действие, которое выражено только через 2 недели после введения токсина.