NHEJ негмологичное соединение концов ДНК HDR —

NHEJ – негмологичное соединение концов ДНК HDR - homology-directed repair – репарация, направляемая гомологией

Применения направленного изменения геномов в биологии, биотехнологии и медицине

Мегануклеазы Механизм хоуминга с участием мегануклеазы интронов группы I

Белок Zif 268 (EGR-1), используемый при конструировании специфической эндонуклеазы Zn 2+ 34 а. о. ДНК Пространственная структура комплекса белка Zif 268 с ДНК. Показаны три домена типа «цинковые пальцы» 5’-GCG-TGG-GCG-3’ Домен типа «цинковые пальцы» С 2 H 2. По два остатка цистеина (C) и гистидина (H) координируют ион Zn 2+. Розовые АКостатки – взаимодействие с ДНК.

Взаимодействие «цинковой» эндонуклеазы с ДНКмишенью Для специфического разрезания ДНК требуется гетеродимеризация двух независимо сконструированных рекомбинантных «цинковых» эндонуклеаз

Домены типа «цинковые пальцы»

Рестриктаза Foc. I: взаимодействие с ДНК-связывающий домен состоит из трех субдоменов D 1 -D 3 и нуклеазного домена, соединенные линкерным сегментом (красный) Каталитический домен – неспецифическая эндонуклеаза Сайт рестрикции и точки расщепления ДНК

Сравнение каталитического домена Fok. I с мономером Bam. HI Оба домена обладают похожими элементами вторичной структуры – β-слоями, фланкированными αспиралями. Активный центр Активные центры расположены на одном из концов β-слоя (выделены желтым цветом)

Распознавание ДНК TAL-эффекторами В повторах длиной 34 а. о. в положениях 12 и 13 имеются два вариабельных а. о. (repeatvariable di-residue (RVD)), которые участвуют в распознавании нуклеотидов ДНК N – Asn, D – Asp, G – Gly, I - Ile

Сайты первичного процессинга Cas 6 PAM – Protospacer Adjacent Motif tracr. RNA – trans-encoded CRISPR RNA

Кластеризованные, регулярно перемежающиеся короткие палиндромные повторы Сlustered regularly interspaced short palindromic repeat (CRISPR) loci Направляющая РНК

The cleavage cycle of Cas 9 RNAguided DNA endonucleases. PAM – Protospacer Adjacent Motif

d. Cas 9 - catalytically dead Cas 9

1. CRISPR targets Cas 9 to create a double stranded break 2. The Nickase system targets a mutant Cas 9 to create two adjacent single-strand breaks. 3. TALENs dimerize two Fok. I units to create a double strand break 4. Zink finger dimerize two Fok. I units to create DSB Из-за низкой эффективности при гомологичной рекомбинации часто модифицируется один аллель

Индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (i. PS) и их трансплантация в целях терапии

Принцип действия системы сайт-специфической рекомбинации Cre/lox lox. P/FRT Реакция обратима v. Димерные рекомбиназы Cre (фаг P 1) или Flp (дрожжи) взаимодействуют со специфическими сайтами lox. P или FRT (18 -звенные инвертированные повторы, разделенные 8 -звенной коровой последовательностью) v. Гомологичная рекомбинация происходит в 8 -звенной коровой последовательности v. Psp – тканеспецифический (или индуцируемый) промотор

Влияние взаимной ориентации lox. P-сайтов на результат действия рекомбиназы Cre Структура lox. P-сайта Однонаправленная ориентация – вырезание фрагмента Реакция обратима Разнонаправленная ориентация – инверсия фрагмента

OSKLN: Oct 4, Sox 2, Klf 4, Lin 8 and Nanog

Cystic fibrosis (CF) Gaucher's disease (GD)

sickle cell disease (SCD) – СЕРПОВИДНО-КЛЕТОЧНАЯ АНЕМИЯ

макака-крабоед – cynomolgus monkey (Macaca fascicularis)