название лекции Общая вирусология Ф И О автора

название лекции: Общая вирусология Ф. И. О. автора: Базиков Игорь Александрович место работы: Ставропольский государственный медицинский университет должность: заведующий кафедрой микробиологии

Лекция 7 Общая вирусология План лекции: современные принципы классификации и номенклатуры вирусов, морфология и структура вириона, формы и этапы взаимодействия вируса с клеткой, репродукция вирусов. Диагностика.

История изучения вирусов: Ивановский Дмитрий Иосифович, 1882 • Возбудитель болезни табачной мозаики (фильтрующиеся бактерии): а) способность проходить через бактериальные фильтры б) отсутствие способности расти на питательных средах (внутриклеточный паразитизм) Это не было абсолютным: (бактерии гонококки – внутрикл. ), бактерии микоплазмы не растут на пит. средах. • Эра изучения вирусов – одних из самых мелких представителей органического мира, обладающих признаками как живой, так и не живой материи, расходящихся на границе жизни, ведет отсчет с 1892 года. • •

Критерии вирусов • 1. У вирусов имеется только одна из двух нуклеиновых кислот, то ли ДНК, то ли РНК, в то время как у всех микроорганизмов - обе нуклеиновые кислоты. • Отсутствие у вирусов собственных систем синтезирующих белки. Синтез вирусных белков осуществляется клеточными рибосомами (генетический паразитизм). • Способ размножения (нет бинарного деления). Вирусы не растут, а происходит синтез вирусных компонентов с последующей сборкой и формированием вирионов, дизъюнктивная, т. е. разобщенная репродукция.

История изучения вирусов: • С развитием исследований по молекулярной биологии вирусов стали накапливаться факты, противоречащие представлению о вирусах, как об организмах. • Плазмиды – внехромосомный генетический аппарат. В виде плазмид могут существовать вирус полиномы коров, обезьяний вирус. • К вирусам примыкают вироиды – возбудители некоторых опухолей растений. Это маленькие «голые» , т. е. лишенные белковой оболочки, свободные одноцепочечные молекулы РНК, замкнутые в кольцо, длина цепи в 360 нуклеотидов, в 10 раз меньше инфекционных РНК самых мелких вирусов. • Агент скрепи- возбудитель энцефалопатии овец. Белковой природы (прион): белковая оболочка вируса+геном клеточного происхождения - «взбесившийся ген» .

История изучения вирусов: Способностью взаимодействовать со всем живым на Земле с развитием патологического процесса обладают, по мнению многих исследователей, «взбесившиеся гены» , т. е. группа аминокислот цепи ДНК или РНК, отличающаяся от генов клетки Термин ВИРУС в переводе означает «яд» . Он был введен Луи Пастером для обозначения заразного начала неизвестного и не уловимого противника, невидимого в оптический микроскоп. Исследования последних 3 -х десятилетий показали наличие вирусов в организме человека и животных без клинических проявлений заболеваний и с клиническими проялениями болезни, что дало определение понятия «ВИРУС» .

Вирусы • – это особая форма жизни, автономные генетические структуры, способные функционировать и репродуцироваться в восприимчивых к ним клетках животных, растений, простейших, грибов и бактерий. • Внеклеточное существование вируса называется вирионом. • Строение и жизнедеятельность вирусов определены их генетическим материалом (нуклеиновыми кислотами). Этим занимается молекулярная генетика.

Структура вируса • По форме вирусы подразделяют на четыре группы: • 1). Сферические (вирус гриппа, кори и др. ). • 2). Палочковидные (ВМТ). • 3). Кубоидальные (вирус оспы, аденовирусы). • 4). Сперматозоидные (вирусы бактерий – фаги).

Биофизические свойства вирусов Характеризуются многими показателями – седиментацией, плотностью, вязкостью вирусных суспензий, диффузионными свойствами. Наиболее важными являются седиментационные и плотностные свойства. Они чаще всего измеряются при исследовании вирусов.

Устойчивость вирусов в окружающей среде • Наименее устойчивыми являются вирусы, имеющие липопротеидные оболочки. • Так, например, ортомиксовирусы и парамиксовирусы инактивируются на поверхности в течение нескольких часов, тогда как вирусы полиомиелита, аденовирусы, реовирусы сохраняют инфекционную активность в течение нескольких дней. • Чувствительность вирусов к ультрафиолетовому и рентгеновскому облучениям зависит от размеров генома

Основные критерии для классификации вирусов • • • В основу современной классификации вирусов положены следующие основные критерии: 1. Тип нуклеиновой кислоты. 2. Наличие липопротеидной оболочки. 3. Размер и морфология вириона, тип симметрии, число капсомеров. 4. Круг восприимчивых хозяев. 5. Патогенность. 6. Географическое распространение. 7. Способ передачи. 8. Антигенные свойства. Вирусы делятся на семейства, подсемейства, роды и типы. Семейство – viridae, подсемейство – virinae, род – virus. Современная классификация вирусов человека и животных распределяет на 19 семейств, из них 7 – ДНК содержащие и 12 – РНК содержащие вирусы.

Классификация вирусов • По количеству нитей ДНК или РНК: однонитчатые и двунитчатые. • По наличию или отсутствию липопротеидной оболочки (капсида): оболочечные и безоболочечные.

Деффектные вирусные геномы • Это любой вирусный геном, в котором одни или несколько генов утратили функцию необходимую для автономной репликации вируса в живой клетке хозяина и передаются при помощи другого вирусного генома или его генов. • Дефектные интегрирующие вирусы (частицы потерявшие существенный участок генома родительского вируса) • Интегрированные дефектные вирусные геномы. К ним относятся дефектные фаги и профаги, а также значительная часть онкогенных РНК- содержащих опухолеродных вирусов – дефектных провирусов с приобретенными клеточными онкогенами. • Псевдовирионы - представляющие частицы с капсидом вируса и нуклеиновой кислотой клетки хозяина, которая полностью заменила нуклеиновую кислоту вирусного генома. • Вирусы - сателиты представляют крайнюю форму паразитизма. Они паразитируют на генных продуктах образованных другими вирусами.

По антигенным свойствам • Манифестные острые вирусные инфекции протекающие с выраженными клиническими проявлениями (эпидемии гриппа, полиомиелит, болезнь Боткина, эпидемический паротит, бешенство, клещевой энцефалит, корь). • Персистирующие вирусные инфекции характеризующиеся поражением клеток интеграционным провирусом (медленные вирусные инфекции заканчивающиеся смертью человека : ВИЧ- инфекции, Т-клеточная лимфома, подострый герпетический энцефалит ). • Вирусы организма не вызывающие никаких изменений с поверхности слущивающегося эпидермиса, из испражнений, отделяемого слизистых, а также из окружающей среды.

Три типа взаимодействия вируса с клеткой • Продуктивный тип, при котором образуются новые вирионы, по различному выходящие из клетки при её лизисе, т. е. «взрывным» механизмом (безоболочечные вирусы); путем «почкования» через мембраны клеток (оболочечные вирусы), в результате экзоцитоза • Абортивный тип, характеризующийся прерыванием инфекционного процесса в клетке, поэтому новые вирионы не образуются • Интегративный тип, или вирогения, заключающийся в интеграции, т. е. в встраивании ДНК или РНК в виде провируса в хромосому клетки и их совместном существовании (совместная репликация)

Стадии размножения вирусов продуктивного типа • 1 стадия • 2 стадия • Адсорбция (распознавание и прикрепление) • Проникновение в клетку (инвагинация и образование вакуоли) • 3 стадия • «Раздевание» вирионов (удаление вирусных оболочек) • 4 стадия • Транскрипция и репликация (переписывание ДНК на информационную РНК) • 5 стадия • Сборка вириона (образование нуклеокапсидов: вирусных нуклеиновых кислот и белков) • 6 стадия • Выход из клетки (при её разрушении или почковании)

Фазы взаимодействия вируса с клеткой 1. Адсорбция обеспечивается электростатическим взаимодействием строго специфических прикрепительных белков вируса и мембран клетки. Специфические рецепторы обеспечивают внутриклеточный транспорт и доставку вируса в определенные участки клетки (цитоплазма, ядро), где произойдет запуск инфекционного процесса.

Фазы взаимодействия вируса с клеткой • 2. Проникновение вируса в клетку может происходить двумя путями - путем виропексиса или путем слияния вирусной и клеточной мембран. Виропексис происходит путем инвагинации участка плазматической мембраны, покрытые рецепторами снаружи, на которых адсорбируется вирус. Затем происходит образование вакуоли вокруг вируса в цитоплазме клетки. Вакуоли сливаются с вакуолью цитоплазмы, а затем сливаются с лизосомами, где и происходит их распад на аминокислоты. Рецепторный эндоцитоз – наиболее частый способ проникновения вируса в клетку.

Фазы взаимодействия вируса с клеткой • 3. Раздевание вируса – удаление вирусных защитных оболочек для дальнейшей экспрессии генома. Конечный продукт раздевания – или нуклеокапсид или нуклеиновая кислота, связанная с внутренним вирусным белком.

Фазы взаимодействия вируса с клеткой • 4. Транскрипция - это переписывание ДНК на РНК по законам генетического кода с помощью РНК-полимеразы на спаренные комплиментарно основания (аденин - тимин, урацил - аденин; гуанин - цитазин, цитазин - гуанин). Такая связь возможна в присутствии ДНК матрицы. Продукт транскрипции – образование информационной РНК – РНК-посредника.

Фазы взаимодействия вируса с клеткой • 5 стадия – сборка вириона. Образование нуклеокапсидов: • Синтез вирусных нуклеиновых кислот и белков происходит в разных структурах клетки. Они должны собраться в одно место. При этом вирусные белки и нуклеиновые кислоты обладают способностью узнавать и самопроизвольно соединяться друг с другом.

Фазы взаимодействия вируса с клеткой • 6 стадия – выход вирусных частиц из клетки. Происходит двумя путями. Простые вирусы вызывают деструкцию клетки и попадают во внеклеточное пространство. Другие вирусы, сложные, выходят из клетки почкованием, в результате клетка остается живой. Это характерно для вируса гриппа.

Вирусы отличаются от микроорганизмов следующими особенностями: • 1). Они содержат нуклеиновую кислоту только одного типа – или ДНК, или РНК. • 2). Для их репродукции необходима только нуклеиновая кислота. • 3). Они не способны размножаться вне живой клетки, и продукция вирусов происходит в клетке-хозяине. Вне клетки вирус существует в виде вирусной частицы – вириона, который состоит из нуклеиновой кислоты и белковой оболочки – капсида. Поэтому вирусную частицу называют также нуклеокапсидом. Такая единица (капсид + нуклеиновая кислота) может быть «голой» , а в других случаях окружена оболочкой.

Культивирование вирусов. 1. Накопление вируса в организме животных. 2. Использование куриных эмбрионов. 3. Метод культуры клеток.

Культивирование вирусов. • 1. Накопление вируса в организме животных. Вирусы могут накапливаться в слизистой ротовой полости скота, вирус бешенства - в мозге собак. Поэтому в зависимости от вида вируса заражение животных производят: интраназально, интрацеребрально, в кожу, энтерально и т. д. • Однако, несмотря на многие достоинства, использования мелких лабораторных животных учёных не совсем удовлетворяло, т. к. для многих вирусов отсутствует биологическая модель.

Культивирование вирусов. • Использование куриных эмбрионов. • в 1931 г. Вудрафом и Гудпасчером стали первые использовать куриные эмбрионы. Но только после блестящих исследований австралийского вирусолога и иммунолога Ф. Бернета куриные эмбрионы получили широкое распространение в вирусологии. • Для культивирования вирусов используются 8 -12 дневные куриные эмбрионы. Вирусы репродуцируются в амнионе (грипп), хорионаллантоисной оболочке (грипп, оспа, герпес), в желточном мешке (бешенство, герпес). Чаще всего вирус вводят в аллантоисную и амниотическую полости и на хорионаллантоисную оболочку.

Культивирование вирусов. В 1949 г. была открыта методика культивирования клеток в искусственных условиях. Авторы этого открытия - американские вирусологи Дж. Эндерс, Т. Уэллер, Ф. Роббинс, которые в 1952 г. получили Нобелевскую премию за разработку метода культуры клеток. Использования культуры клеток в вирусологии явилось подлинно революционным событием, послужившим основой для выделения новых вирусов, их идентификации, клонирования, изучения их взаимодействия с клеткой. Наибольшее распространение получили трипсинизированные культуры эпителиальной и соединительной тканей (фибробласты), клетки которых в виде монослоя прикрепляются к стенкам стеклянной лабораторной посуды.

Материал и методы исследования • В качестве материала использовали куриные эмбрионы 9 -11 дневной инкубации. • Извлекали эмбрион и измельчали ножницами отмывали • Заливали 0, 15%-ным раствором трипсина и ставили на магнитную мешалку. • Трипсинизацию проводили дробно - (3 -5) раз до полного истощения ткани. • Суспензию центрифугировали при 1000 об/мин - 10 мин, надосадочную жидкость сливали, а осадок клеток фильтровали. • Определяли число клеток в 1 мл суспензии в камере Горяева и засевали на питательную среду.

Культивирование вирусов

Три типа культуры клеток используемых в вирусологической практике : • а) К первичным относятся культура клеток, способные выдерживать до 5 -10 пассажей. Их готовят из эмбриональной ткани, почечной ткани куриного эмбриона, эмбриона мыши. • б) Перевиваемые культуры получают преимущественно из опухолевых клеток одного типа, которые могут размножаться ин витро в течение неограниченного срока. К таким клеткам относятся линии, ведущие своё начало от карцином человека (клетки Хела). Впервые они были получены от женщины - полячки, погибшей от рака шейки матки. • В) К полуперививаемым культурам относят культуры диплоидных клеток, которые получают из фибробластов человеческого эмбриона. Эти клетки выдерживают до 100 генераций, сохраняя диплоидный набор хромосом.

Культура клеток • Ту или иную культуру клеток заражают вирусом, вводя взвесь его частиц во флаконы, которые затем ставят в термостат для размножения и накопления вируса. Большинство вирусов, размножаясь в клетках, постепенно разрушают их, и клетки дегенерируют.

Способы обнаружения вирусов в исследуемом материале. • Реакция гемагглютинации (РГА), основанная на способности некоторых вирусов, вызывать агглютинацию (склеивание) эритроцитов различных видов животных и человека. При этом одни вирусы лучше агглютинируют эритроциты человека или морской свинки, другие - эритроциты кур, гусей

Реакция гемадсорбции • основана на том, что клетки, пораженные вирусом, приобретают способность адсорбировать эритроциты, т. к. вирусы после репродукции выходят на поверхность клеток

Цитопатическое действие • В заражённых культурах клеток большинство вирусов при внутриклеточной репродукции вызывают цитопатическое действие (ЦПД). Цитопатический эффект выражается в различных изменениях морфологии клеток: пикнозе ядер, формировании многоядерных клеток, так называемых симсластов, или синцитиев, образующиеся в результате слияния клеток, а финалом нерёдко бывает полная деструкция монослоя.

Цветная проба • Цветная проба основана на том факте, что обычно клетки культуры ткани, при своём росте изменяют р. Н питательной среды за счёт выделения кислых продуктов метаболизма. Это определяется по изменению р. Н питательной среды с помощью индикатора, фенолового красного, который в кислой среде меняет свой цвет на жёлтый

Бактериофаги – пожиратели бактерий

БАКТЕРИОФАГИ • Бактериофаги (фаги) - группа вирусов, паразитирующих на бактериях. Б. , как и всем вирусам, присущи 3 стадии существования: вирион, вегетативный вирус и провирус. Б. делят на вирулентные и умеренные. Вирулентные Б. дают литическую продуктивную инфекцию, в результате чего образуется новая генерация фагов. Умеренные Б. вызывают, как правило, абортивную лизогенную инфекцию, которая состоит в интеграции геномов бактерии и лизогенного фага.

ФОРМА И УЛЬТРАСТРУКТУРА ФАГОВ КЛАССИФИКАЦИЯ ФАГОВ ПО ФОРМЕ 1 НИТЕВИДНЫЕ 2 С АНАЛОГ ОМ ОТРОСТ КА 3 4 5 6 БЕЗ ОТРОС ТКА С КОРОТ -ИМ ОТРОСТ КОМ С ДЛИН -НЫМ ОТРОС ТКОМ С ДЛИННЫМ ОТРОСТКОМ И СОКРАЩАЮЩИМСЯ ЧЕХЛОМ

Структура фага

ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ БАКТЕРИОФАГА С БАКТЕРИАЛЬНОЙ КЛЕТКОЙ Адсорбция частиц фага на поверхности клеток

ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ С БАКТЕРИАЛЬНОЙ КЛЕТКОЙ ВИРУЛЕНТНЫХ (ЛИТИЧЕСКИЙ ПУТЬ) И УМЕРЕННЫХ ФАГОВ (ИНТЕГРАТИВНЫЙ ПУТЬ)

ВЫДЕЛЕНИЕ ФАГА Исследуемый материал E. coli МПБ S. dysenteriae Бактериальная S. aureus Посев на плотную питательную среду с дальнейшей идентификацией вида бактерий Наличие соответствующего фага – лизис бактерий в пробирке и отсутствие роста на плотных питательных средах

Список источников основного содержания презентации: 1. Manconi, M. , Sinico, С, Valenti, D. , Lai, F. and Fadda, A. M. (2006). Niosomes as carriers for tretinoin: III. A study into the in vitro cutaneous delivery of vesicleincorporated tretinoin. Int. J. Pharm. , 311, pp. 11 -19 2. International Journal of Pharmaceutical Sciences Review and Research 3. Manconi, M. , Sinico, C, Valenti, D. , Loy, G. and Fadda, A. M. (2002). Niosomes as carriers for tretinoin. I. Preparation and properties. Int. J. Pharm. , 234, pp. 237 -248. 4. Manconi, M. , Valenti, D. , Sinico, C, Lai, F. , Loy, G. and Fadda, A. M. (2003). Niosomes as carriers for tretinoin. II. Influence of vesicular incorporation on tretinoin photostability. . Int. J. Pharm. , 260, pp. 261 -272. 5. Tabbakhian, M. , Tavakoli, N. , Jaafari, M. R. and Daneshamouz, S. (2006). Enhancement of follicular delivery of finasteride by liposomes and niosomes: 1. In vitro permeation and in vivo deposition studies using hamster flank and ear models. Int. J. Pharm. , 323, pp. 1 -10.