Направления инвагинации мембраны Формы мембранных структур, встречающиеся в

Направления инвагинации мембраны Формы мембранных структур, встречающиеся в клетке

Все встречающиеся в клетке формы и их изменения можно получить экспериментально на модельных липидных бислойных пузырьках (LUVs, large unilamellar vesicles) Давление; осмос; Электрическое поле; Градиент рН

изменения формы мембраны определяются их физико-химическими свойствами Формирование транспортных везикул может происходить и без участия белков

COPI и COPII –окаймления “клатриновые” окаймления: АР1, АР2, АР3, АР4 GGA1, GGA2, GGA3 ??? Окаймления (coats)

COP (Coat Proteins)-окаймления обслуживают биосинтетический путь: COPI: intraGolgi , Golgi > ER COPII: ER > Golgi (ERGIC ?)

COPI: Минимальная система in vitro: ARF1* + коутомер (coatomer) + липосома (из кислых липидов)

cyt Golgi

Грузы селектируются за счет взаимодействия со своими мембранными рецепторами, узнающими определенные последовательности в молекулах грузов (напр., KDEL, KKXX etc.) На роль мембранных рецепторов претендуют белки семейства р24:

В жизненном цикле COPI-везикулы присутствуют 2 GAP-активности Медленная – циклы гидролиза ГТФ на ARF1 под ее действием необходимы для накопления груза; Она создает временное окно, в течение которого пузырек заполняется грузом Быстрая - после полной сборки окаймления следует быстрый гидролиз ГТФ на ARF1, отделение пузырька и разборка окаймления; коутомер не является ARFGAP, тем не менее его ассоциация с везикулой значительно ускоряет гидролиз ГТФ.

COPI на эндосомах: 1. Нет - и -субъединиц 2. -COP посттрансляционно модифицирован (фосфорилирован?) 3. COPI на эндосомах мало по сравнению с мембранами АГ 4. Дефекты по  -COP препятствуют образованию мультивезикулярных тел 5. Ассоциация с мембраной зависит от Rab-белков , а не ARF1 ARF6-GTP - локализован на ПМ ARF6-GDP – локализован на рециклирующих эндосомах ARF 6 взаимодействует с Rac1 и участвует в реорганизации кортикального актинового цитоскелета COPI на других органеллах

COPII : ER > G (ERGIC) минимальная система in vitro: Sar1p - инициирующая малая ГТФаза; два белковых комплекса: р13/р31 и р23/р24 СOPII-везикулы

Sar1pGAP Sar1p GEF Emp24p-семейство

После добавления к р23/р24-комплексу комплекса р13/р31 происходит их стабилизация (полимеризация) и искривление мембраны. Таким образом, в случае COPII-окаймления движущей силой искривления является изменение конформации белков.

«Клатриновые» окаймления (Clathrin coats) АР (adaptor proteins) -1, -2, -3, -4 GGA (Golgi-localized adaptor, -ear containing, ARF- binding protein) 1,2, 3 HRS/SNX?

Клатриновые окаймления AP-комплексы состоят из адаптинов (adaptins)

Структура клатринового олигомера (трискелиона) и модель сборки плоской клатриновой решетки video Клатрин при определенных условиях (рН 6.7, Mg2+) обладает способностью к самосборке

Плоские решетки, по-всей видимости, играют роль сортирующих платформ в эндосомах и ассоциируются с мембраной через HRS/SNX Cемейство SNX (sorting nexins) сод. около 30 членов, способны взаимодействовать с клатрином и с определенными рецепторами HRS –взаимодействует с клатрином и с PI3-фосфатом на мембране, узнает ТК рецепторы Окаймленные ямки

TGN cytosol Сборка GGA- и AP1-зависимых окаймлений (на мембранах транс-Гольджи и эндосом) Инициирующая ГТФаза ARF1 (GTP) рекрутирует GGA или АР1 ARF1-GGA рекрутирует рецептор к маннозо-6-фосфату (MPR), что создает условия для сборки клатринового окаймления

AP3 - гомологичен другим АР-окаймлениям, но работает без клатрина Осуществляет непосредственный транспорт лизосомных белков из TGN в вакуоль (лизосомы). Эндосомы? ARF1 инициирует сборку Нуклеация – казеин-киназа1 (csk1) фосфорилирует 3-субъединицу АР3 Сборка окаймления, рекрутирование груза

Как инициируется сборка АР-2 окаймления? Сборку инициируют рецепторы-грузы Но: в одни и те же ямки могут попадать рецепторы различной природы (метаболические и сигнальные) 2. Сборка идет конститутивно Фибробласты : 2-3 тыс ОЯ/мин Оказалось, что на мембране существуют области, «разрешенные» для формирования окаймленных ямок, именно в пределах такой области и может инициироваться сборка новых окаймлений Большую роль в стабилизации «зон эндоцитоза» играет актиновый цитоскелет На роль инициаторов претендуют PI(4,5) P2 и синаптотагмин

AP180 имеет самое высокое сродство к клатрину Endophilin – LPA-ацилтрансфераза - добавляет к LPA остаток арахидоновой кислоты, у которой менее упорядоченная структура и больший диаметр > искривление мембраны Eps15/epsin – участвуют в сортировке груза, определении границ ОЯ и связи с кортикальным актином. В митозе фосфорилированы, что блокирует эндоцитоз На начальном этапе формирования ОЯ работают белки, определяющие границу будущей инвагинации

Механизмы сортировки рецепторов в окаймленные ямки АР2 узнает сигнальную последовательность в цитоплазматическом домене рецептора ( в основном метаболические рецепторы, которые постоянно локализуются в ОЯ) Сигнальные последовательности играют меньшую роль, заякоривание в ОЯ происходит через взаимодействие с сопутствующими белками (accesory proteins) Eps15/epsin. Существенно убиквитинирование груза. Этот механизм характерен для рецепторов, попадающих в ОЯ только в результате стимуляции (рецептор ЭФР) GPCR (G-protein coupled receptors) – связываются с АР2 через аррестин LL Y 1 2

Формирование окаймленной ямки (ОЯ)

Dynamin –атипичная ГТФаза (100 кДа) Обладает высокой скоростью гидролиза ГТФ Динамин способен взаимодействовать с множеством белков Поскольку концентрация ГТФ в клетке очень высока (1 mM), то динамин д.бы в основном находиться в ГТФ-св. форме. Но это не так , поскольку осуществляется регуляция обмена нуклеотидов на динамине.

Цепочки динамина способны формировать спирали вокруг липидных (и белковых) тубул, шаг спирали зависит от связанного нуклеотида GTPS GDP

Существует несколько изоформ динамина (Dyn 1, 2, 3), Dyn 1 /2 участвуют в работе окаймлений (клатриновых и кавеолиноых), Dyn 3 «занимается» тубуляцией (Т-система скелетных мышц)

Формирование и разборка АР-2 окаймления – процесс, в ходе которого взаимодействия разных элементов ОЯ друг с другом происходят в строгой очередности Как идет его «оркестровка»?

По-видимому, большинство белков в клетках выполняют более чем одну функцию (уже известную нам), другая (или другие) может оказаться весьма неожиданной