Нанотехнологии доставки лекарств, биоактивных молекул, генов НКТБМ, Тема 12. Каф. гистологии
Нанотехнологии доставки генов Генная терапия - лечение наследственных, онкологических и других заболеваний путём внесения в клетки пациента необходимого генетического материала с целью направленного изменения генных дефектов или придания клеткам новых функций. • • • Этапы: 1) упаковка генов в вектор; 2) доставка векторов к клеткам мишеням; 3) введение генов в клетки; 4) введение генов в клеточное ядро. Простейшим вектором для гена является плазмида — кольцевая ДНК из нескольких тысяч пар нуклеотидов, созданная методами генной инженерии. В генной терапии плазмидную ДНК часто называют «голой ДНК» (naked DNA), имея в виду, что ген не помещен в защитный наноконтейнер. Эффективность переноса генов посредством «голой ДНК» невысока, однако при этом в организм не вносятся наноконтейнеры, биологические эффекты которых не всегда предсказуемы. Используют вирусные векторы (аденовирусные, лентивирусные и др. ), и невирусные векторы (липосомы, дендримеры, ДНК липидные комплексы и др. ). Адресная доставка определяется наличием на поверхности векторов специальных молекул, узнаваемых рецепторами на клетках мишенях. (Белки вирусного капсида, узнаваемые рецепторами клеточной мембраны, антитела к поверхностным клеточным антигенам, встроенные в мембрану липосом, молекулы фолиевой кислоты, которые усиленно захватываются опухолевыми клетками).
Нанотехнологии доставки генов • • Ключевой проблемой генотерапии является до ставка терапевтических нуклеотидов в клетки мишени. Практическое использование генотерапии развивается в направлении создания высокоспецифичных систем доставки и стабилизации терапевтических нуклеотидов и увеличения эффектив ности трансфекции. Использование вирусных векторов, несмотря на высокую эффективность, сопряжено с риском патогенности и иммуногенности, в связи с чем примене ние курьеров на основе наночастиц наиболее перспективно. Так, осуществлена трансфекция плазмидной ДНК, конъюгированной с наночастицами, которая в последующем успешно экспрессировалась, при этом связь с наночастицей защищала ДНК от действия нуклеаз и рестриктаз. Широко разрабатываются подходы к генотерапии онкологических заболеваний.
Недостатки метода на основе вирусных векторов • малая ёмкость переносимого генетического материала • свойственная вирусам собственная клеточная специфичность. • возможность вирусов возвращения к дикому типу в результате рекомбинации, • белки вирусных частиц обладают высокой иммуногенностью, в результате чего повторное их введение вызывает иммунный ответ. • массовое производство вирусных векторов достаточно проблематично и требует больших затрат.
Альтернативные методы • В настоящее время активно разрабатываются различные варианты невирусных носителей на основе катионных липидов и катионных полимеров. Эти катионные молекулы способны спонтанно формировать самособирающиеся нанокомплексы с отрицательно заряженной молекулой ДНК за счёт электростатических взаимодействий. Самособирающиеся комплексы, состоящие из катионных липидов и ДНК, называют липоплексами, состоящие из катионных полимеров и ДНК – полиплексами.
Полиплексы Схема образования полиплексов из катионных полимеров и кольцевой молекулой ДНК (плазмидой) [Pack et al. , 2005]. . Изображение полиплексов на подложке, полученное с помощью трансмиссионной электронной микроскопии (деление шкалы 200 нм), [Pack et al. , 2005].
Нанотехнологии доставки лекарств Идея целевой доставки терапевтических агентов (таких как олигонуклеотиды, белки, лекарственные препараты) использованием магнитного нацеливания была предложен Widder в 1978 г. Применение данного подхода в химиотерапии опухолей позволяет значительно снизить дозу препарата, побочные эффекты и нивелировать неспецифическое негативное его воздействие на организм. При связывании противоопухолевого препарата с магнитной частицей можно направлять его в опухоль, используя силу внешнего магнитного поля. Проведен ряд исследований возможности доставки доксорубицина, закрепленного на поверхности наноразмерных частиц, в экспериментальных опухолях животных.
Нанокапсулы для дистанционной магнитно – инициируемой доставки лекарств • Магнитные нанокапсулы со структурой ядро / оболочка давно рассматриваются в качестве носителей лекарств для их адресной доставки. Тайванские ученые вновь предложили один из вариантов создания таких капсул. В качестве сердцевины капсулы они взяли наночастицы оксида железа и термочувствительный блоксополимер плюроник F 68, представляющий собой цепочку чередующихся полиэтиленоксида и полипропиленоксида. Роль оболочки играет ультратонкая пленка оксида кремния, регулирующая выход лекарств из капсулы до и после воздействия магнитного поля. При воздействии магнитного поля наночастицы оксида железа нагреваются, и таким образом можно осуществить быстрый выброс лекарств при минимальном воздействии температуры на живые клетки.
Изображения колонии клеток в растворе с исследуемыми капсулами, полученные с помощью конфокального микроскопа, после (а) четырех часов; (b) суток. Капсулы изображены зелеными точками. (d) Магнитная томография мозга крысы до введения капсул и после.
Магнитные липосомы для управляемой доставки лекарств • Под действием переменного магнитного поля мембрана липосомы становится проницаемой для доставляемого вещества.
Вывод • От систем доставки лекарств в живые клетки требуется, чтобы они эффективно связывали эти лекарства, умели проникать сквозь клеточную мембрану, а затем высвобождать лекарство в цитоплазму. Многие системы проваливают задание на последнем шаге: попадая в лизосомы, они подвергаются действию пищеварительных ферментов и разрушаются вместе со своим ценным грузом. Поэтому разработка новых систем доставки не теряет своей актуальности.
НАНОМАГНЕТИКИ, ПЕРСПЕКТИВЫ ПРИМЕНЕНИЯ В МЕДИЦИНЕ.
Что такое наномагнетики Наночастицы, обладающие магнитными свойствами, представляют значительный интерес для медицины, что связано с возможностью дистантного управления ими и конструкциями на их основе при наложении внешнего маг нитного оля. п В настоящее время синтезирован широкий спектр магнитных наночастиц: на основе металлов Co, Fe, Ni, оксидов железа, ферритов Mg. Fe 2 O 4, Сo. Fe 2 O 4, Mn. Fe 2 O 4, Li. Fe 5 O 8, а также Сo. Pt, Fe. Pt, Mn. Al, Sm. Co 5, Fe 14 Nd 2 B. Оксидные частицы обладают более слабыми магнитными свойствами, чем наночастицы на основе металлов, однако они более устойчивы к окислению.
Основные области биомедицинского прило жения агнитных наночастиц: м • 1. Диагностика и инструменты исследований (биосенсо ры , MRI, маркеры биомолекул, биосепарация и пробоподго товка , исследования молекулярного взаимодействия). • 2. Адресное терапевтическое воздействие (целевая до ставка ерапевтических т молекул, управляемая локальная • гипертермия опухолей). • 3. Разработка биологических тканей.
Жидкие наномагнетики
Перспективы применения нанобиотиков в медицине
Наномагнетики для определения путей миграции и судьбы трансплантированных клеток • Наиболее эффективными метками молекул-мишеней стволовых клеток (СК) явились получившие распространение в последние годы магнитодендримеры (МД), в частности МД 100. Они представляют собой комплексы наночастиц окиси железа, присоединенные к карбоксилированным дендримерам (4 5 й генерации). Известна способность дендримеров обеспечивать надежную трансфекцию олигонуклеотидов в клетку. Высокая насыщаемость полимерами участков клеточной мембраны в месте их присоединения инициирует мембранный биндинг ("bending") – ее выпячивание внутрь клетки и развитие механизма эндоцитоза. СК взятые от мыши, крысы и человека могут сравнительно просто быть помечены простым прибавлением к среде МД 100 с концентрацией окиси железа 10 25 мг Fе/мл. Причем перечень различных клеточных линий включает: фибробласты, прогениторные мышечные клетки и стволовые клетки у мышей, олигодендроглиальные прогенеторные клетки у крыс, кардиомиоцитоподобные и эмбриональные СК у человека. Все выше перечисленные линии клеток отличаются достаточно высокой степенью накопления магнитнорезонансных контрастных наночастиц в пределах эндосом, демонстрируя неселективную природу ретенции в них МД 100.
Визуализации процесса миграции стволовых клеток • В целом, данные литературы по магнитнорезонансной контрастной визуализации процесса миграции мезенхимальных и кардиомиоцитоподобных СК крайне ограничены, а материалы по применению других методов (компьютерной томографии, ультразвуковой диагностики, ОКТ) контраст ассоциированной визуализации дистанцирования СК не выявлены. Кроме того, результаты полученные в единичных центрах, пока слабо воспроизводятся другими последовательными лабораториями. К тому же имеют место различные технологические и методические ограничения метода применения магнитнорезонансных контрастах наночастиц окиси железа для молекулярной и клеточной визуализации.
Визуализации процесса миграции стволовых клеток • Японские ученые из Nagoya. Universityдля анализа поведения СК после трансплантации использовали метод мечения по множеству точек (quantumdotslabeling, QDs) окта аргинин пептидом (R 8), чтобы получить in vivo флуоресцирующее изображение при помощи IVIS(®) Spectrumanalysis.
Выводы • Молекулярная визуализация в медицине — интенсивно развивающаяся область знаний, которая может повысить интерес практических врачей к молекулярным основам патогенеза многих заболеваний человека. Существенный интерес следует ожидать в создании мультимодальных наночастиц, усиливающих контрастность изображения, а также технических средств и алгоритмов оптимизации методов визуализации молекулярных процессов, что позволит повысить эффективность методов молекулярной терапии.
Нанотехнологи визуализации объектов • Электронная микроскопия • Просвечивающий (трансмиссионный) электронный микроскоп (ПЭМ) — это устройство, в котором изображение от ультратонкого образца (толщиной порядка 0, 1 мкм) формируется в результате взаимодействия пучка электронов с веществом образца с последующим увеличением магнитными линзами (объектив) и регистрацией на флуоресцентном экране, фотоплёнке или сенсорном приборе с зарядовой связью (ПЗС матрице). Первый ПЭМ создан немецкими инженерами электронщиками Максом Кноллем и Эрнстом Руской 9 марта 1931 года. Первый практический просвечивающий (трансмиссионный) электронный микроскоп был построен Альбертом Пребусом и Дж. Хиллиером в университете Торонто (Канада) в 1938 году на основе принципов, открытых ранее Кноллем и Руской. Эрнсту Руске за его открытие в 1986 году присуждена Нобелевская премия по физике.
Визуализация наночастиц с помощью электронной микроскопии
Конфокальная микроскопия
Визуализация наночастиц с помощью конфокальной микроскопии Микроскопическое изображение наночастиц (зеленые) на поверхности кожи.
Растровый электронный микроскоп предназначенный для получения изображения поверхности объекта с высоким (до 0, 4 нанометра) пространственным разрешением, также информации о составе, строении и некоторых других свойствах приповерхностных слоёв. Основан на принципе взаимодействия электронного пучка с исследуемым веществом
Магнитно резонансная томография
Позитронно эмсиссионный томограф (ПЭТ) Позитронно- эмиссионный томограф. В настоящее время металлоксидные наночастицы применяются в большом количестве приложений, включая диагностику и биомедицину. Однако эти наночастицы крайне сложно обнаружить и выяснить, как они распределяются в биологической системе, например – организме человека. Нуклид 18 O в составе металлооксидных наночастиц может быть конвертирован в радиоактивный 18 F, который можно наблюдать in vivo. Испанские исследователи продемонстрировали на примере лабораторных крыс, что новый метод позволяет следить за распределением наночастиц по организму. Метод позволяет узнать судьбу меченых нанообъектов в течение 8 часов после ведения их в организм.
Исследование наночастиц внутри клеток Принцип визуализации наночастиц во внутриклеточной жидкости при помощи ультразвуковой голографии • • Сигнальный модуль обеспечивает текущее положение отраженного лазерного луча, которое контролируется позиционно чувствительным детектором. Динамика кантилевера передается на вход синхронного усилителя (lock in amplifier). По разности частот fc fs контролируется локальное возмущение системы кантилевер – клетка. По картированию силы связывания в сканируемой области клетки выводится фазовый образ, содержащий информацию о погруженных наночастицах SWCNH
Скачать презентацию Нанотехнологии доставки лекарств биоактивных молекул генов НКТБМ Тема
НКТБМ Тема 12 Доставка Наномагнетики Архипова.ppt