НАНОМАТЕРИАЛЫ НА ОСНОВЕ БЕЛКОВ И ПЕПТИДОВ Лекция 4

НАНОМАТЕРИАЛЫ НА ОСНОВЕ БЕЛКОВ И ПЕПТИДОВ Лекция 4 Гибридные наноматериалы с участием белков и пептидов. Биофункционализация наноматериалов. Капсулированные наночастицы; наночастицы с белк. /пепт. покрытием; белки/пептиды как модификаторы для направленной доставки. Возможности использования в медицине и технике. Природные гибридные нанокомпозитные системы на основе коллагена – костная ткань, хрящи. Синтетические нанокомпозиты, имитирующие биологические ткани, и их использование в тканевой инженерии.

Гибридные наноматериалы с участием белков/пептидов Синтез, капсулирование, стабилизация, функционализация, доставка, высвобождение: - контрастных агентов для EM, MRI и др. - магнитных частиц для MRI - флюоресцентных и др. меток покрытие - терапевтических средств доставка матрица/катализатор для синтеза капсулирование S функционализация нужная клетка

Гибридные материалы с участием белков/пептидов Небелковые наноматериалы с белковым/пептидным покрытием - стабилизация коллоидных растворов наночастиц - организация НЧ в более сложные наноструктуры - возможность направленной химической модификации - биосовместимость мед. материалов - повышение адгезии неорг. наноматериалов к биологическим объектам Примеры материалов, функционализируемых белками/пептидами: - наночастицы металлов (Au, Ag) - квантовые точки (Cd. Se/Zn. S) - оксиды металлов (Al 2 O 3, Fe 3 O 4 и т. д. ) - неметалл. наноструктуры (Si, C-нанотрубки) - органические, полимерные и т. п. НЧ (липосомы, дендримеры, ДНК и др. ) -Функционализация небелковых наноматериалов различные поверхности (керамические, полимерные, металлические, мечение целевых клеток (тканей) - Направленное Si и т. п. ) наночастицами - Направленное мечение индивидуальных антигенов - Иммобилизация биообъектов на неорг. наноматериалах

НЧ с белковым/пептидным покрытием 1. Суспендирование 2. Добавление HRP нанотрубки) Удаление холата диализом 3. SWNT (углеродные + солюбилизатор (холат натрия) Суспензия HRP/SWNT Стабильна в теч. 10 дней 1. Суспендирование 2. Удаление холата диализом Суспензия SWNT Разрушается за 2 дня Возможные области примен - medical treatment or imaging - biosensors

Белково/полимерно/другие гибридные наноматериалы Ge. Sb. Se стекло (наноколонны на Si подл 1. 2. 3. Нанесение слоя полимера (поли-п. -ксилилен, PPX) Нанесение линкера (гексаметилендиизоцианат, HMDI) Нанесение белкового слоя (GFP) Возможные области применения - сенсоры - ИК оптика - data storage

Белково/полимерные гидрогели © The Royal Society of Chemistry 2011 Chem. Commun. , 2011, 47, 526– 528

Polymer–protein conjugates: an enzymatic activity perspective Аспарагиназа из E. coli, модифицированная ПЭГами Polym. Chem. , 2010, 1, 1352– 1373 | 1353 DOI: 10. 1039/c 0 py 90001 j © The Royal Society of Chemistry 2010

Directed co-assembly of heme proteins with amphiphilic block copolymers toward functional biomolecular materials Soft Matter, 2011, 7, 172– 179 | 173 © The Royal Society of Chemistry 2011

Soft Matter, 2011, 7, 172– 179 | 173 © The Royal Society of Chemistry 2011

Мультимодальные НЧ с участием белков/ пептидов Fab http: //www. nanoprobes. com/

Гибридные материалы с участием белков/пептидов и НЧ Au (А) Гибридные НЧ белков/пептидов с “коллоидным Au” - доступны конъюгаты с Fab, Ig. G, поли-Lys, белком А и др. - доступны разные размеры частиц Au (1 -40 нм) - нековалентное связывание белков с Au (Б) Конъюгаты белков/пептидов с “нано-Au” - доступны конъюгаты с Fab, Ig. G, стрептавидином и др. - доступны разные размеры частиц Au - ковалентное связывание белков с Au - заданная стехиометрия белок: Au (напр. , 1: 1 или 2: 1) - высокая стабильность Применение меток с использованием Au-белковых конъюгатов: - мечение и прокраска для гибридизации in vitro - гибридизация in situ (ISH) → флюоресцентная → иммуногистохимическая - микроскопия → световая → электронная (SEM, TEM) - контрастные агенты для MRI

Способы конъюгации белков/пептидов и небелковых НЧ сорбция (А) + (Б) прочный комплекс + НЧ-связ. пептид (В) (Г) SH + МИ SH SH ковалентная сшивка + SH S S

Способы конъюгации белков/пептидов и небелковых НЧ

Способы конъюгации белков/пептидов и небелковых НЧ Малеимидо- Сульфo-N-оксисукцинимидо- Амино- Ni-NTA- БЕЛОК

Способы конъюгации белков/пептидов и наночастиц: примеры Функционализация наночастиц Au 11 http: //www. nanoprobes. com/

Способы конъюгации белков/пептидов и наночастиц: примеры Функционализация наночастиц Ag

Способы конъюгации белков/пептидов и наночастиц: примеры Cd. Se/Zn. S QD 1. 2. 3. Функционализация квантовых точек Меркаптоуксусная к-та этил-3 -(диметиламинопропил)карбодиимид трансферрин (A) Schematic of a Zn. S-capped Cd. Se QD that is covalently coupled to a protein by mercaptoacetic acid. (B) TEM of QD-transferrin (an iron-transport protein) conjugates. Scale bar, 100 nm. Chan et al. , Science 25 September 1998, Vol. 281. no. 5385, pp. 2016 - 2018 DOI: 10. 1126/science. 281. 5385. 2016

Способы конъюгации белков/пептидов и наночастиц: примеры Функционализация полимерных/ магнитных наночастиц

Функционализация полимерных НЧ

Конъюгаты белков с наночастицами: примеры использования http: //www. immunogold. com/ i. EM of antigen in the plasma membrane of bacteriai. EM of human PLP-binding protein in the parathyroide Cryo Spindle microtubules labeled with anti-tubulin primary antibody followed by (LEFT) goat anti-mouse colloidal gold or (RIGHT) goat Fab' anti-mouse. NanogoldЃ (Light micrograph courtesy of Dr. D. Vandré and Dr. R. Burry, Ohio State University. Original magnification = 1300 x) http: //www. nanoprobes. com/Nano. Ab. html

Конъюгаты белков с наночастицами: примеры использования anti-laminin primary antibody/ Qdot® 565 Ig. G. anti–PECAM-1 (platelet/endothelial cell adhesion molecule; CD 31) primary antibody/ Qdot® 655 Ig. G. Nuclei (Hoechst 33342. ) http: //www. invitrogen. com/

Применение гибридных белково/пептидно-других наносистем

Атеросклеротическая мышь Нормальная мышь

US-imaging AB к фибрину AB к TF фибрин-targeted липосомы

MRI с функционализированными парамагнитными НЧ

Применение гибридных белково/пептидно-других наносистем Bio-barcode assay for biosensorics

Функционализация НЧ антителами “pre-targeted” двухфазная терапия НЧ

Функционализация НЧ синтетическими пептидами Homing peptides RGD NGR F 3 CLT-1, CREKA Tissue penetration motiff: R/KXXR/K

Интегрины – мишень RGD-содержащих пептидов García A , Reyes C J DENT RES 2005;

Интегрины – мишень RGD-содержащих пептидов αVβ 3

Интегрины – мишень RGD-содержащих пептидов

RGD-4 C RGE-4 C (контроль)

HPMA-RGD-4 C HPMA-RGE-4 C (контроль)

Targeting различных НЧ RGD-содержащими пептидами

Функционализация поверхностей García A , Reyes C J DENT RES 2005; 84: 407 -413

Функционализация поверхностей с исп. RGD-пептидов García A , Reyes C J DENT RES 2005;

Биоадгезивные поверхности: 1 поколения 2 поколения - увеличение селективности - специфичные к разным интегринам - не-RGD-связывающие интегрины García A , Reyes C J DENT RES 2005; 84: 407 -413 Copyright © by International & American Associations for Dental Research

Тканевая инженерия Клетка ткани или клетка-прогенитор Наращивание клеток in vitro на 3 D матрице, формирование квази-нативной структуры Имплантация in vivo Примеры тканей, получаемых искусственно: - костная - мышечная (скелетные, сердечная) - сухожилия - кожа - нервная - кровеносные сосуды

Тканевая инженерия Строение межклеточного матрикса эпителиальные клетки ламинин базальная мембрана гепаран сульфат/Белок коллаген эндотелий стенки капилляра соед. ткань и интерстиц. матрикс фибробласт хондроитин сульфат/Белок

Коллаген J. Voss-Andreae, "Unraveling Collagen", 2005, stainless steel, height: 11'3' (3. 40 m).

Структура хряща d ~ 30 -80 нм Вода (w/w) Протеогликаны Коллаген Хондроциты 60 -80% 15 -20% 3 -5% → → поры ~ 2 нм поры ~ 100 нм L. Han, Ph. D Thesis, MIT © Massachusetts Institute of Technology, 2007

Структура хряща Гиалиновый (бар 250 мкм) Волокнистый (бар 100 мкм) Эластический (бар 250 мкм)

Структура кожи Metcalfe A D , Ferguson M W J. R. Soc. Interface 2007;

1 фибрилла Кристаллы апати

Тканевая инженерия 1. Матрица + культуральная среда 2. Нанесение клеток 1. Клетки мигрируют вглубь матрицы 2. Клетки колонизировали матрицу и производят свой межклеточный матрикс

Необходимые компоненты для создания тканевого заместителя

Тканевая инженерия Требования к матрице: - доступность воды и орг. в-в для роста и размножения клеток - биосовместимость - легкость деградации - механические требования - возможность регуляции ( «умные» матрицы) Примеры используемых матриц: Белковые - коллаген - фибрин - пептидные гидрогели Полимерные - полигликолевая к-та - полимолочная к-та - поликапролактон Неорганические - гидроксиапатит - Al 2 O 3/Si Минусы: - иммунный ответ - сложность формования - возможность заражения от биоисточника - закисление ткани - низкая биосовместимость - трудно контролировать размер и форму пор - нерегулируемые - остатки орг. р-телей - механические ограничения

Получение 3 D матриц на основе белков коллаген (р-р или дисперсия) 1. 2. 3. Заморозка Высушивание Сшивка (УФ или химическая) коллагеновая 3 D-матрица с заданным размером пор желатин + порошок (волокна) полимера + гидроксиапатит 1. 2. 3. Плавление Заполнение формы (Вымывание желатина) композитный материал полимер/ (желатин)/ гидроксиапатит Фибриноген (р-р) 1. 2. 3. Заполнение формы Добавление тромбина и полимеризация Добавление трансамидаз и сшивка Фибриновая матрица с заданным размером пор

Получение 3 D матриц на основе коллагена Коллагеновая матрица Композитная матрица коллаген/гидроксиапатит

Получение матриц из волокнистых материалов методом «электроспиннинг» Варианты распределения компонентов композитных волокон: Int J Nanomedicine. 2007 December; 2(4): 623– 638 Copyright © 2007 Dove Medical Press Limited Примеры матриц на основе композитных волокон: - Желатин/поликапролактон (кожа) - Коллаген/поликапролактон (кожа, нервная ткань) - эластин/PDO (кр. сосуды)

Матрицы для ТИ на основе пептидных волокон Пептидные нанотрубки как основа для инженерной костной ткани

Матрицы для ТИ на основе пептидных гидрогелей Гидрогель на основе пептида KLDLKLDL: Рост хондроцитов в пептидном гидрогеле через (C) 3 дня и (D) 7 дней

Матрицы для ТИ на основе пептидных гидрогелей Домен самосборки Сайт протеолиза Мотив клеточной адгезии Сайт связывания гепарина (и факторов роста) Дополнительные бонусы: - контролируемое гелеобразование - самосборка - возможность функциональных добавок (факторов роста и т. п. ) - возможность направленого дизайна → контроль формы и размеров пор - размеры, сопоставимые с размерами компонентов натурального матрикса

Матрицы для ТИ на основе пептидных гидрогелей Гидрогель на основе пептида RADARADA: Поверхность матрицы (а) без клеток и (b) с растущими остеобластами

Матрицы для ТИ на основе пептидных гидрогелей Примеры типов клеток, выращенных на пептидных гидрогелях

Формование сложных 3 D структур для ТИ Технология CAD/CAM (Computer Assisted Design and Manufacturing) 1. Создание компьютерной модели нужной формы 2. Виртуальное сечение модели на тонкие слои 3. Получение слоев в-ва матрицы нужной формы 4. Адгезия слоев в 3 D-структуру Негативный молдинг: 1. создание негативной реплики виртуальной модели 2. послойное заполнение ее жидким в-вом матрицы 3. солидификация FDM (Fused Deposition Modeling): 1. Получение р-ра, вязкого р-ра или пасты вещества матрицы 2. Экструзия (или нанесение др. способом) в-ва матрицы послойно на подложку 3. Солидификация в-ва матрицы 4. Удаление подложки Вариант: экструзия р-ра мономера в среду, содержащую полимеризующий агент Вариант: экструзия жидкого в-ва матрицы в среду в условиях солидификации Вариант: 3 D-экструзия в вязкую среду, например, желатин 3 D печать: 1. Получение порошка в-ва матрицы 2. Послойная печать чернилами, содержащими связующий агент 3. Удаление несвязанного порошка 4. Удаление связующего агента Вариант: печать чернилами, содержащими полимеризующий агент Стерео(фото)литография: «печать» УФ лазером по слою жидкого в-ва фотоактивной матрицы

Наиболее частые проблемы современной тканевой инженерии: 1. 2. 3. 4. 5. Недостаточная васкуларизация → нечувствительность Недостаток сложности системы (однотипность клеток) Шрамообразование Невозможность контролировать развитие системы Недостатки матрицы (все материалы несовершенны)

Гибридные материалы с участием белков/пептидов и наночастиц Au S клетка S +

Функционализация полимерных НЧ 2/9/2018 Published in: Hao Wang; Kan Liu; Kuan-Ju Chen; Yujie Lu; Shutao Wang; Wei-Yu Lin; Feng Guo; Ken-ichiro Kamei; Yi-Chun Chen; Minori Ohashi; Mingwei Wang; Mitch Andre Garcia; Xing-Zhong Zhao; Clifton K. -F. Shen; Hsian-Rong Tseng; CS Nano A 2010, 4, 6235 -6243. DOI: 10. 1021/nn 101908 e Copyright © 2010 American Chemical Society

Функционализация полимерных НЧ 2/9/2018 Published in: Forrest M. Kievit; Omid Veiseh; Chen Fang; Narayan Bhattarai; Donghoon Lee; Richard G. Ellenbogen; Miqin Zhang; ACS Nano 2010, 4, 4587 -4594. DOI: 10. 1021/nn 1008512 Copyright © 2010 American Chemical Society

фибрин-targeted перфторуглеродные НЧ

Мультимодальные НЧ с участием белкоов/ пептидов

Мультимодальные НЧ с участием белков/ пептидов

Функционализация антителами

Функционализация синтетическими пептидами

Пептид-targeted НЧ Fe 3 O 4 (CLIO)