НАДЕЖДЫ И ОПАСНОСТИ ГЕННОЙ ТЕРАПИИ Выполнила Дзуцева Элина

НАДЕЖДЫ И ОПАСНОСТИ ГЕННОЙ ТЕРАПИИ Выполнила: Дзуцева Элина 202 группа Педиатрический факультет

Генная терапия (ГТ) – совокупность генно-инженерных и медицинских методов, направленных на внесение изменений в генетический аппарат соматических клеток человека путем введения в организм рекомбинантных генетических конструкций с лечебной целью

Стратегии ГТ IN VIVO EX VIVO

Классификация ГТ По типу векторной системы I. Вирусная 1. РНК – содержащие вирусы : • ретровирусы (онкоретровирусы, лентивирусы и др. ) II. Невирусная 1. Прямая инъекция ДНК в клетку, ткань, орган 2. Липофекция 3. Электропорация 2. ДНК – содержащие вирусы : • аденовирусы • вирус герпеса • аденоассоциированные вирусы 4. «Генное ружье» 5. Рецептор-опосредованный эндоцитоз

I. Вирусные векторы Преимущества + трансдукция большого числа клеток + тропизм + устойчивость к деградации лизосомами Недостатки – иммуногенность (аденовирусы, герпесвирусы) – потенциальная канцерогенность (ретровирусы)

I. Вирусные векторы (на примере ретровируса) • gag кодирует большой белок-предшественник всех основных структурных белков вирусной сердцевины • pol кодирует каталитические белки (ревертаза, протеаза, интеграза) • env кодирует гликопротеины вирусной оболочки • Ψ участок, необходимый для упаковки РНК в нуклеокапсид

I. Вирусные векторы Схема получения рекомбинантной ГТ-конструкции на основе ретровирусного вектора в клетке «упаковочной» линии ψ • Транскрипция «терапевтического» гена в ядре под контролем промотора в 5’-LTR и трансляция в цитоплазме белков Gag, Pol, Env, кодируемых соответствующими генами вируса в разных хромосомах • Образование вирусного капсида и упаковка двух цепей РНК и ревертазы • Высвобождение из клетки вирионов с «терапевтическим» геном

I. Вирусные векторы 1. Векторы на основе ретровирусов РНК-геном Преимущества • не иммуногенны • постоянная экспрессия трансгенов (в геноме) Недостатки • • • инфицирование только делящихся клеток случайное включение в геном потенциальная канцерогенность низкий титр вирионов, выделяемых из упаковочных линий небольшая клонирующая емкость (до 8 - 10 т. п. н. )

I. Вирусные векторы 2. Векторы на основе аденовирусов Преимущества дн. ДНК-геном • способны инфицировать неделящиеся клетки • большая клонирующая емкость (в настоящее время до 28 т. п. н. ) • высокий титр вирионов, выделяемых из упаковочных линий • не встраиваются в геном Недостатки • иммуногенность (иммунный ответ развивается через 2 -3 инъекции) • кратковременная экспрессия трансгена (не интегрирован в геном)

I. Вирусные векторы 3. Векторы на основе аденоассоциированных вирусов Преимущества он. ДНК-геном • не иммуногенны • встраиваются в специфический сайт в хромосоме 19 • не патогенны • способны инфицировать неделящиеся клетки • длительная экспрессия трансгена Недостатки • небольшой размер клонируемой ДНК (до 4. 5 т. п. н. )

II. Невирусные системы доставки Прямая инъекция ДНК Липофекция Электропорация «Генное ружье» Рецептор-опосредованный эндоцитоз

II. Невирусные системы доставки Преимущества + относительная безопасность + отсутствие иммунного ответа + простота применения Недостатки - низкая эффективность трансфекции - низкий уровень экспрессии трансгена

II. Невирусные системы доставки • Внутримышечная инъекция ДНК-вакцины • Подкожное введение «генным ружьем» Недостаток • Низкий уровень экспрессии трансгена

II. Невирусные системы доставки • Липофекция с помощью катионных липосом Недостаток • Возможность деградации в лизосомах

II. Невирусные системы доставки • Рецептор-опосредованный эндоцитоз а) ДНК ковалентно связывается с поликатионом (поли-Lлизин) и лигандом (моносахарид, дисахарид или гликопротеин), образуя ДНК-комплекс (in vitro)

II. Невирусные системы доставки • Рецептор-опосредованный эндоцитоз б) ДНК-комплекс взаимодействует со специфическим рецептором на поверхности клетки и путем эндоцитоза попадает внутрь клетки, а затем в ядро (in vivo) Недостаток • возможность деградации в лизосомах

Частота современного использования разных типов векторных систем в ГТ

Новейшие подходы в ГТ РНК-интерференция (непрямая коррекция генетических нарушений) Прямая коррекция генетических нарушений → гомологическое замещение малым фрагментом (SFHR)

РНК-интерференция • непрямая коррекция генетических нарушений

Области применения ГТ в настоящее время

Лечение наследственных заболеваний с помощью ГТ Первое применение ГТ – лечение тяжелого комбинированного иммунодефицита, связанного с мутацией гена аденозиндезаминазы (ADA) (20 сентября 1990 года)

Фазы клинических испытаний генотерапевтических препаратов Фаза I → оценка токсичности генной конструкции Фаза II → ограниченные испытания на небольшом контингенте больных Фаза III → широкомасштабные клинические испытания Современное состояние протоколов по ГТ

ГТ-протоколы, проходящие II/III фазы клинических испытаний • Тяжелый комбинированный иммунодефицит (аденозиндезаминаза) • Семейная гиперхолестеринемия (рецептор липопротеинов низкой плотности) • Гемофилия В (фактор IX) • Болезнь Гоше-сфинголипидоз (глюкоцереброзидаза) • Муковисцидоз (СF-трасмембранный фактор) Основной подход • заместительная терапия

Генотерапия рака 3 основных подхода: 1. Иммунотерапия рака 2. Подавление роста раковых клеток введением генетических конструкций 3. Вирусный онколизис Частота использования различных подходов к ГТ рака:

I. Иммунотерапия рака Использование ГТ- конструкций, стимулирующих иммунный (в основном клеточный) противоопухолевый ответ Для создания рекомбинантных генетических конструкций используют гены: • Антигенов • Эпитопов • Комплекса MHCI; фактора B 7 • Цитокинов • Рецепторов Т-клеток

Стратегии антиопухолевой иммунотерапии «Генетическая коррекция» иммуногенности клеток опухоли – ДНК-вакцинация (презентация чужеродного антигена); – Введение генов комплекса гистосовместимости (MHCI); – Введение гена костимулирующего фактора T-клеток (B 7) Ex vivo In vivo

Стратегии антиопухолевой иммунотерапии • Генетическая модификация клеток иммунной системы

II. Подавление роста раковых клеток введением в них генетических конструкций (ДНК и ингибиторные РНК) (или в нормальные клетки для защиты от противоопухолевой терапии) Гены-супрессоры опухоли Суицидные гены Ингибиторы онкогенов Факторы антиангиогенеза Ингибиторы циклинов Гены, повышающие чувствительность клеток опухоли к лекарственным соединениям Гены транспортеров лекарственных соединений (введение, например, в клетки костного мозга)

Гены-супрессоры опухоли До 80 % видов онкологических заболеваний связано с нарушением активности гена р53 Функции гена р53 в клетке гены-мишени АПОПТОЗ p 53 АРЕСТ КЛЕТОЧНОГО ЦИКЛА • bax • fas • KILLER/DR 5 • NOXA • p 53 AIP • PUMA • 14 -3 -3σ • p 21/waf 1 циклины

Ингибиторы онкогенов Мутация в гене Ras может привести к конститутивной работе сигнальной системы запуска деления, а, следовательно, к стимуляции пролиферации клеток и ингибированию апоптоза Основные подходы к блокированию онкогенного Ras-зависимого сигнального пути: • ингибирование экспрессии белка Ras с помощью рибозимов, антисмысловых РНК и ДНК-олигонуклеотидов • ингибирование экспрессии генов, стоящих ниже в сигнальном пути • препятствование встраиванию белка Ras в клеточную мембрану

Факторы антиангиогенеза Ангиогенез – процесс формирования новых кровеносных сосудов; играет существенную роль в канцерогенезе: питание раковых клеток и снабжение их кислородом Клетки опухоли характеризуются состоянием гипоксии и повышенной экспрессией ангиогенных факторов (хемокинов) ГТ-подходы к антиангиогенезу : • подавление экспрессии генов, кодирующих хемокины • активация естественных ингибиторов ангиогенеза • введение мутантного гена рецептора хемокинов в клетки эндотелия сосудов, окружающих опухоль

Гены транспортеров лекарственных соединений Одним из подходов в ГТ рака является защита нормальных тканей от цитотоксического действия лекарственных препаратов, применяющихся при химиотерапии

Основные способы повышения специфичности и эффективности ГТ онкологических заболеваний • Использование специфичных и/или индуцибельных промоторов для экспрессии терапевтических генов → опухолеспецифичные промоторы → тканеспецифичные → промоторы, индуцируемые радиоактивным облучением → промоторы, индуцируемые в условиях гипоксии • Использование «bystander» эффекта

Проблемы ГТ • Небезопасность генно-инженерных конструкций • Невысокая эффективность векторных систем • Кратковременная экспрессия «терапевтического гена» • Инактивация ГТ-конструкций защитными системами клетки

Актуальные задачи ГТ • Разработка индивидуальных алгоритмов ГТ наследственных и ненаследственных заболеваний • Повышение эффективности векторных систем, используемых в ГТ • Регуляция места, уровня и времени экспрессии трансгенов • Разработка систем переноса ГТ-конструкций в митохондрии • Повышение эффективности ДНК-вакцин для лечения инфекционных и онкологических заболеваний

ГТ человека (примененные протоколы) в 1989 -2008 г. г.

Распространение протоколов клинических испытаний по ГТ (на всех стадиях) По континентам По странам

ГТ в России • В России 5 -10 лабораторий, где ведутся экспериментальные исследования • Основные проекты по ГТ в России: → ГТ опухолей (противоопухолевые вакцины) → ГТ СПИДа (блокирование экспрессии генов ВИЧ) → ГТ ишемических болезней сердца (индукция ангиогенеза) → ГТ мышечной дистрофии Дюшена (заместительная терапия)

Заключение ГТ пригодна для лечения широкого спектра заболеваний Эффективность ГТ нуждается в повышении Дальнейшее развитие и широкое использование ГТ неизбежно

СПАСИБО ЗА ВНИМАНИЕ