Національний технічний університет України Київський політехнічний інститут Курс

Національний технічний університет України “Київський політехнічний інститут” Курс лекцій з дисципліни “Прецизійні методи аналізу неорганічних речовин ” ЛЕКЦІЯ 11 Розробник: ст. викл. каф. ТНР та ЗХТ Обушенко Т. І.

ХРОМАТОГРАФИЯ Хроматография является физико химическим методом разделения, в процессе которого разделяемые компоненты распределяются между двумя фазами. Одна из этих фаз представляет собой стационарный слой с большой поверхностью (неподвижная фаза), а другая Хроматография является физико-химическим методом разделения, в процессе которого разделяемые компоненты подвижна и фильтруется через слой неподвижной фазы. распределяются между двумя фазами. Одна из этих фаз представляет собой стационарный слой с большой поверхностью Хроматографию можно определить как процесс, (неподвижная фаза), а другая подвижна и фильтруется через слой основанный на многократном повторении актов неподвижной фазы. сорбции и десорбции вещества при перемещении его в Хроматографию можно определить как процесс, потоке подвижной фазы вдоль неподвижного сорбента. основанный на многократном повторении актов сорбции и Вещество подвижной фазы непрерывно подвижной десорбции вещества при перемещении его в потокевступает в фазы вдоль с новыми участками сорбента и частью контакт неподвижного сорбента. Вещество подвижной фазы непрерывно вступает в контакт с новыми участками сорбента и сорбируется, а сорбированное вещество контактирует со частью сорбируется, а сорбированное вещество контактирует со свежими порциями подвижной фазы и частично десорбируется.

3 Подвижная фаза представляет собой поток жидкости или газа, проходящий через неподвижную фазу и переносящий вещество. Неподвижная фаза как правило твердое вещество с развитой поверхностью или, реже, жидкость, способные обратимо взаимодействовать с веществом. При этом чем лучше вещество сорбируется (поглощается) неподвижной фазой, тем меньше скорость его движения. Процесс разделения основывается на различном сродстве исследуемых соединений к подвижной и неподвижной фазам: вещества движутся к "финишу" с различными скоростями и, т. о. , разделяются.

Рождение хроматографии связано с именем русского ботаника Михаила Семеновича Цвета. С помощью хроматографии М. С. Цвет установил, что считавшийся однородным зеленый пигмент растений хлорофилл на самом деле состоит из нескольких веществ. 4

5 При пропускании экстракта зеленого листа через колонку, заполненную порошком мела, и промывании бензолом он получил несколько окрашенных зон, что с несомненностью говорило о наличии в экстракте нескольких веществ. Впоследствии это было подтверждено другими исследователями. Этот метод он назвал хроматографией, что по гречески означает запись цвета. Символично, что предложенное Цветом название метода, увековечило и фамилию самого изобретателя. Заметное развитие хроматографических методов началось в 30 е годы, когда возникла острая потребность в новом методе разделения смесей и очистки веществ, разлагающихся при нагревании. Хроматография продолжает бурно развиваться и в настоящее время является одним из наиболее перспективных методов анализа.

6 Различные методы хроматографии можно классифицировать по агрегатному состоянию фаз, способу их относительного перемещения, механизму разделения, аппаратурному оформлению процесса и т. д. Классификация по агрегатному состоянию фаз Различают газовую и жидкостную хроматографию. Газовая хроматография – подвижной фазой является газ (или пар). Варианты: газо адсорбционная и газожидкостная. Газоадсорбционная – неподвижная фаза – твердый адсорбент. Газожидкостная – неподвижная фаза – жидкость, а точнее пленка жидкости на поверхности частиц твердого сорбента. Жидкостная хроматография – подвижной фазой является

7

8

Сверхкритическая флюидная хроматография Сверхкритическим флюидом (СКФ) — называют состояние вещества, при котором исчезает различие между жидкой и газовой фазой. Любое вещество, находящееся при температуре и давлении выше критической точки является сверхкритическим флюидом. Свойства вещества в сверхкритическом состоянии промежуточные между его свойствами в газовой и жидкой фазе. Так, СКФ обладает высокой плотностью, близкой к жидкости, и низкой вязкостью, как и газы. Коэффициент диффузии при этом имеет промежуточное между жидкостью и газом значение. Вещества в сверхкритическом состоянии могут применяться в качестве заменителей органических растворителей в лабораторных и промышленных процессах. Наибольший интерес и распространение в связи с определенными свойствами получили сверхкритическая вода и сверхкритический диоксид углерода 9

10 Классификация по механизму разделения Адсорбционная хроматография – основана на различии в адсорбционном сродстве компонентов по отношению к активному твердому веществу. Распределительная хроматография – основана на различии в растворимости (абсорбции) компонентов в неподвижной фазе (газо жидкостная хроматография) или различием в растворимости (абсорбции, распределении) компонентов в подвижной и неподвижной фазах (жидкостная хроматография). Ионообменная хроматография – определяется различием в ионообменном сродстве к неподвижной фазе.

11 Эксклюзионная хроматография – основана на эффекте исключения, обусловленная различием в размере и форме молекул (например, в хроматографии на молекулярных ситах) или в заряде (например, в хроматографии с исключением ионов). Термин гелевая эксклюзионная (ситовая) хроматография широко применяется для наименования такого процесса, в котором неподвижной фазой является набухший гель. Хроматография, основанная на образовании соединения – основана на образовании (или диссоциации) молекулярных соединений в неподвижной фазе, например на образовании комплексов фермент субстрат, антиген антитело, олефин нитрат серебра и реакции с хелатными смолами. А также образование осадка – осадочная хроматография.

Адсорбционная хроматография В этом процессе неподвижная фаза представляет собой твердый сорбент. Равновесие процессов сорбции и десорбции в условиях, достаточно далеких от насыщения емкости сорбента, устанавливается независимо для каждого компонента смеси веществ. Различие в коэффициентах адсорбции обусловливает разницу в распределении этих компонентов между сорбентом и подвижной жидкой фазой. Соответственно чем большим сродством к сорбенту обладает данный компонент смеси, тем медленнее он будет мигрировать вслед за элюентом вдоль колонки или пластинки. 12

Аффинная хроматография Относительно слабое обратимое взаимодействие между молекулами биполимеров и сорбентом может осуществляться за счет сил биологического сродства. Такие силы действуют, например, между ферментом и его субстратом или ингибитором, антигеном и антителом, гормоном и рецептором и т. д. Для осуществления фракционирования по биологическому сродству, т. е. методом аффинной хроматографии, один из «партнеров» такой пары химически закрепляют на матрице «биоаффинного» сорбента, а сорбцией и элюцией второго «партнера» управляют путем изменения условий биологического взаимодействия в результате введения в элюент солей, мочевины, детергентов, конкурирующих молекул или изменения его р. Н (см. рисунок). 13

14

15 В большинстве случаев имеет место не хроматографический процесс фракционирования смеси веществ, а очистка одного из них путем избирательной сорбции, промывки и последующей десорбции. Впрочем, возможны варианты и истинной хроматографии, использующей явление аффинного взаимодействия. При этом фракционированию подвергается смесь близко родственных биологических макромолекул, различающихся по своему сродству к одному тому же аффинному сорбенту.

16 Аффинная хроматография отличается чрезвычайно высокой избирательностью, присущей биологическим взаимодействиям. Нередко одна хроматографическая процедура позволяет очистить нужный белок в тысячи раз. Это оправдывает затраты усилий на приготовление аффинного сорбента, что не всегда оказывается легкой задачей ввиду опасности утраты биологическими молекулами способности к специфическому взаимодействию в ходе их ковалентного присоединения к матрице. Очистку белков и нуклеиновых кислот на аффинных сорбентах часто ведут не на колонках, а в объеме — методами центрифугирования и декантации.

Гель фильтрация В этом простейшем варианте хроматографии молекулы фракционируемых веществ не должны обладать никаким специальным сродством к неподвижной или подвижной фазам. Неподвижная фаза здесь представлена жидкостью, находящейся внутри пористых гранул, — точно такой же, как жидкость подвижной фазы, протекающей между ними. Благодаря силам сцепления с поверхностью пространственной сетки полимера или иного пористого материала, образующего гранулы, жидкость внутри них остается неподвижной и не увлекается течением подвижной фазы. В подавляющем большинстве случаев применения гель фильтрации для биологических целей рабочей жидкостью служат водно солевые растворы, а материалы гранул гидрофильны. 17

18 Гель фильтрационная, или молекулярно ситовая, хроматография. Принцип разделения в таких системах несколько иной, чем в предыдущих случаях. Неподвижной фазой являются материалы, обычно гели, со строго контролируемой пористостью, в результате чего одни компоненты смеси в соответствии с размером и формой молекул могут проникать между частицами геля, а другие не могут. Наиболее часто этот вид хроматографии используется для разделения высокомолекулярных соединений. Один из вариантов применения этого метода – определение молекулярных масс разделяемых веществ, часто необходимых для химических исследований (рис. 8).

19 Рис. 8. Схема разделения методом гель-хроматографии: а – начало разделения, б – разделение, в – конец разделения; большие кружки – частицы геля, большие точки – молекулы соединений с большой молекулярной массой, маленькие точки – молекулы соединений с меньшей молекулярной массой

Ионообменная хроматография Этот процесс сходен с адсорбционной хроматографией в следствии того, что задержание молекул вещества в неподвижной фазе обусловлено их связыванием с поверхностью твердого гидрофильного материала сплошных или пористых гранул, находящихся в контакте с жидким элюентом. Однако в этом варианте хроматографии задержание происходит не за счет молекулярной адсорбции, а в результате электростатического взаимодействия разноименно заряженных ионов. 20

21 Возможность фракционирования компонентов смеси веществ обусловлена различием в значениях их суммарных зарядов. Последние зависят как от числа и характера ионогенных групп в молекулах, так и от полноты их диссоциации, которую можно контролировать путем выбора р. Н и ионной силы элюента. Чем больше в данных условиях элюции суммарный заряд того или иного компонента смеси, тем сильнее его взаимодействие с ионообменником и тем медленнее он мигрирует вдоль колонки. Так, на рисунке представлен пример разделения аминокислот, имеющих разный заряд.

Рис. Разделение имеющих разный заряд аминокислот

Типичная установка ионообменной жидкостной хроматографии для очистки белков. После загрузки образца насос создает солевой градиент для элюции образца. 23

24 Распределительная хроматография Хроматографическии процесс, в котором неподвижная и подвижная фазы представлены двумя несмешивающимися или частично смешивающимися жидкостями. Если в системе двух контактирующих между собой жидкостей такого рода растворять какое либо вещество, то его концентрация в этих растворителях будет одинакова только в том случае, если оба они обладают одинаковой растворяющей способностью, т. е. одинаковым сродством к веществу. В противном случае молекулы вещества будут переходить из одной жидкости в другую до тех пор, пока не установится равновесие, которому будет отвечать более высокая концентрация этих молекул в той жидкости, растворяющая способность которой выше.

25 Жидкость неподвижной фазы, как и при гель фильтрации, может быть просто иммобилизована внутри пористых гранул, или, например, быть прочно связана с волокнами набухшей целлюлозы, или же покрывать тонкой пленкой гранулы из сплошного материала и поверхность пор внутри них. Покрытие может осуществляться за счет смачивания, сорбции или химическим путем. В последнем случае нередко «пленка» жидкости сводится к мономолекулярному слою вещества, способного удерживать близ своей поверхности молекулы компонентов фракционируемой смеси в соответствии со степенью их сродства к нему.

26 Очень часто одна из фаз обогащена органическим растворителем, в то время как другая является в основном водной. Естественно, что в этом случае фракционирование веществ идет по степени их гидрофобности. Исторически сложилось так, что «нормальным» расположением фаз называют такое, при котором неподвижной является водная фаза. За счет смачивания (набухания) она легко фиксируется на гидрофильных матрицах (целлюлозе, полиакриламидном или декстрановом гелях, диатомовых землях, силикагеле и др. ). В состав подвижной фазы в этом случае входят органические растворители.

27 При обратном расположении фаз, когда на твердой матрице фиксируют пленку органического растворителя, а подвижная фаза представляет собой водный раствор, распределительную хроматографию называют хроматографией в обращенных фазах (ХОФ). В английской литературе ее обозначают RPC (reversed phase chromatography). ХОФ при высоком давлении нередко осущест вляют таким образом, что еподвижная фаза вместо н пленки органи ческого растворителя представлена монослоем молекул жирного или ароматического ряда, химически закрепленных на поверхности твердой матрицы силикагеля. В качестве матриц для ХОФ с истинно жидкой неподвижной фазой часто используют предварительно силиконированные диатомовые земли типа кизельгуров.

28 Препаративная хроматография вид хроматографии, проводимый с целью выделения индивидуальных соединений из смеси в чистом виде. В отличие от аналитической хроматографии, препаративные разделения проводят на колонках большого диаметра и используют специальные устройства для сбора отдельных компонентов (фракций). В лабораторной практике используют колонки диаметром 8 15 мм и выделяют обычно от 100 мг до 10 г индивидуального вещества; в промышленности созданы колонны диаметром до 0. 5 метра, на которых возможно проводить разделение нескольких тонн вещества. Эффективность препаративных колонок меньше по сравнению с используемыми в аналитической хроматографии.

29 Классификация по аппаратурному оформлению Колоночная – отличается тем, что процесс проводят в насадочной или капиллярной колонке. Насадочную колонку заполняют сорбентом (насадкой). Внутреннюю стенку капиллярной колонки покрывают слоем жидкости или пылью адсорбента (либо пылью адсорбента или носителя, пропитанной жидкостью). Плоскостная – осуществляется на плоскости. В хроматографии на бумаге – колонка заменена узкой полоской фильтровальной бумаги. В тонкослойной хроматографии на узкую стеклянную пластинку наносится тонкий слой тонко раздробленного адсорбента.

30

31 Типичный прибор для проведения ТСХ анализа

Классификация по способу относительного перемещения фаз Различают фронтальную, вытеснительную и проявительную (или элюэнтную) хроматографию. Схематическое изображение протекания процесса при различных способах хроматографического разделения: 32 а – кривые распределения концентрации разделяемых веществ на слое сорбента в колонке в зависимости от длины слоя; б – кривые распределения концентрации С на выходе из колонки в зависимости от объема V, пропущенного через колонку элюента (хроматограммы); А и В – разделяемые вещества; Е – растворитель; Д – вытеснитель

33 Различия разделения смесей по способу элюции. 3 а хроматографическая элюция; 3 б фронтальный анализ; 3 в вытеснительная хроматография.

34 Стационарный нагрев (изотермическая хроматография). В этом случае перед началом анализов колонка разогревается до необходимой температуры, которая поддерживается строго постоянной как во время проведения анализа, так и при всех других операциях, требующих сравнимых результатов. Здесь следует особо подчеркнуть важность поддержания постоянной температуры, так как удерживаемые сорбентом объемы чрезвычайно чувствительны к температурным колебаниям.

35 Нестационарный нагрев (хроматография с программированием температуры). Нагрев осуществляется обычно следующим образом: начало анализа проводится при низкой температуры, что дает возможность пройти через разделительную колонку тем компонентам, которые плохо адсорбируются. Затем в определенный момент времени начинается обогрев колонки. По мере продвижения по колонке компонентов, обладающих возрастающими адсорбционными способностями, температура колонки повышается, что дает возможность на одном сорбенте разделять сложные смеси, компоненты которых по своим физикохимическим свойствам резко отличаются друг от друга.

36 а — при повышении температуры от 50 до 250°; б — при постоянной температуре 168°. 1 — н пентан; 2 — н гексан; 3 — н гептан; 4 н октан; 5 — н декан; 6 — н додекан; 7 — н тетрадекан.

37 Неравномерный нагрев по длине колонки (хроматермография). В этом случае нагретая до определенной температуры печь движется вдоль разделительной колонки, что способствует распределению различных компонентов по зонам и их лучшему разделению. 1 — ввод пробы; 2 — движущаяся электропечь с градиентом температуры по длине; 3 — адсорбционная колонка; 4 — детектор; Т=f(L) — распределение температуры вдоль печи: T 1. . . Т 5 — выходные температуры компонентов разделяемой многокомпонентной смеси (черточки на колонке обозначают расположение зон их вдоль колонки)

38 Хроматографические процессы часто удобно рассматривать как серии экстракционных процессов, при этом могут быть разделены вещества с очень близкими свойствами, т. к. в ходе хроматографических процессов быстро и одновременно происходят сотни и даже тысячи циклов экстракции. Для оценки эффективности хроматографических процессов, исходя из теоретического представления о дистилляции (по аналогии с разделением нефти на ректификационных колоннах, где теоретическая тарелка соответствует части ректификационной колонны, в которой пар и жидкость находятся в равновесии), вводят понятие «высота, эквивалентная теоретической тарелке» (ВЭТТ). Хроматографическая колонка, таким образом, рассматривается как набор гипотетических слоев (тарелок).

39 Под ВЭТТ обычно подразумевают такую толщину слоя, которая необходима для того, чтобы смесь, поступившая из предыдущего слоя, пришла в равновесие со средней концентрацией вещества в подвижной фазе этого слоя. Ее можно описать следующей формулой: ВЭТТ = L/N, где L – длина колонки, N – число теоретических тарелок. ВЭТТ является суммарной характеристикой разделения веществ. Однако разделить компоненты смеси важно, но недостаточно. Необходимо идентифицировать каждый компонент и определить его количество в пробе. Обычно это осуществляют с помощью обработки хроматограмм – зависимости интенсивности сигнала, пропорционального концентрации вещества, от времени разделения. Некоторые примеры хроматограмм показаны на рис. 10, 11.

40

41 Время от момента ввода пробы в колонку до момента регистрации максимума пика называется временем удерживания (t. R). В оптимальных условиях оно не зависит от количества введенной пробы и с учетом геометрических параметров колонки определяется строением того или иного соединения, т. е. является качественной характеристикой компонентов. Количественное содержание компонента характеризуется величиной пика, точнее его площадью. Подсчет площади пика обычно осуществляют автоматически с помощью прибора интегратора, который фиксирует и время удерживания, и площадь пика. Современная аппаратура позволяет сразу получать компьютерную распечатку с указанием содержания всех компонентов разделяемой смеси.

42

43 В хроматографии чаще всего используют методику проявительного (элюентного) анализа, при которой газ или раствор, выходящий из колонки, анализируется непрерывно. Типичная выходная кривая (хроматограмма) проявительного анализа приведена на рисунке:

44 Кривая проявительного анализа (хроматографический пик)

45 Высотой пика считают либо величину h, либо h (см. рис. ). Последняя равна расстоянию от нулевой линии до точки пересечения касательных к кривой в точках перегиба. Шириной пика называют расстояние между точками контура на половине его высоты (СЕ) или на какой то другой отметке по высоте, либо расстояние между точками перегиба или между точками пересечения нулевой линии с касательными к кривой в точках перегиба (В F ).

Определение степени разделения 46

47 Значение тех или иных элюционных характеристик меняется в зависимости от цели анализа. В качественном анализе основное внимание уделяется определению характеристик удерживания и устранению искажений этих величин за счет второго компонента. В количественном анализе важно, чтобы четкость разделения обеспечивала достаточную точность определения площади или высоты хроматографического пика.

48 Важной хроматографической характеристикой системы является время удерживания или пропорциональный ему удерживаемый объем. На рис. приведенному удерживаемому объему соответствует отрезок AG, а общий удерживаемый объем характеризуется отрезком A G. Если длину отрезка A G обозначить t, то время удерживания tr будет равно: , где w – скорость движения ленты самописца. Удерживаемый объем Vr пропорционален времени удерживания tr: Vr = tr r , где объемная скорость газа носителя.

Общие черты различных видов хроматографии: Проведение хроматографического анализа включает cтадии: • Введение разделяемой смеси в систему; • Разделение смеси одним из вида хроматографии; • Сбор фракций; • Анализ фракций. Разделяемые вещества имеют хроматографическую характеристику - время удержания TR (время, нахождения соединения в колонке от его загрузки до выхода (когда достигается максимальная концентрация в анализируемых фракциях)) или Rf (отношение пути, пройденного веществом, к пути, пройденного растворителем) для бумажной или тонкослойной хроматографии. 49

http: //www. forenschemist. narod. ru/Metodes/Intro/Gc-ms/GC-MS. html http: //www. chromatogramma. ru/book/export/html/9 http: //him. 1 september. ru/articlef. php? ID=199903201