НАЦІОНАЛЬНИЙ ФАРМАЦЕВТИЧНИЙ УНІВЕРСИТЕТ Кафедра біотехнології СПЕЦІАЛЬНІСТЬ «ТФП» Дисципліна «Хімічна мікробіологія» Лекція Біосинтез первинних метаболітів: амінокислот, ліпідів, полісахаридів Харків, 2012
NB! Деление молекул на первичные и вторичные метаболиты условно! Первичные метаболиты – это низкомолекулярные соединения, необходимые для роста микроорганизмов. Одни из них являются строительными блоками макромолекул, другие участвуют в синтезе коферментов. Среди наиболее важных для промышленности метаболитов можно выделить аминокислоты, органические кислоты, пуриновые и пиримидиновые нуклеотиды, липиды, полисахариды.
Аминокислоты, используются в пищевой промышленности и как добавки к кормам сельскохозяйственных животных. Применяются они и при изготовлении ряда полимерных материалов, например, синтетической кожи, некоторых специальных волокон, пленок для упаковки пищевых продуктов и др. Ряд аминокислот или их производных обладают пестицидным действием. Метионин и γ-аминомасляная кислота широко применяются как лекарственные средства.
Удельный вес применения аминокислот в различных отраслях хозяйства может быть продемонстрирован на примере Японии, где на долю пищевой промышленности приходится 65% всех производимых в стране аминокислот, на животноводство – 18%, на медицинские цели – 15% и на прочие нужды – 2%. В наибольших количествах в мире вырабатываются Lглутаминовая кислота, L-лизин, DLметионин, L-аспарагиновая кислота, глицин.
Основные способы получения аминокислот : • экстракция из белковых растительного сырья; гидролизатов • химический синтез; • микробиологический синтез растущими клетками; • ферментативный синтез с использованием иммобилизованных микробных клеток или ферментов, выделенных из микроорганизмов.
Наиболее распространенные продуценты аминокислот – грамположительные бесспоровые бактерии, относимые к родам: q Согуnebacterium, q Micrococcus, q Arthrobacter, q Brevibacterium некоторым другим. Ферментативные реакции синтеза аминокислот протекают внутри клеток. Первоначально аминокислоты накапливаются внутри них в виде так называемых свободных аминокислот. и
На ранних этапах роста культуры свободные аминокислоты включаются в конструктивный обмен микроорганизма. Активное накопление аминокислот в среде в периодической культуре происходит обычно со средины экспоненциальной фазы роста, достигая максимума к ее концу.
Биосинтез глутаминовой кислоты При биосинтезе глутаминовой кислоты непосредственным метаболическим предшественником служит α-кетоглутаровая кислота, которая обычно образуется благодаря функционированию в клетках цикла трикарбоновых кислот (ЦТК) или его части. Одним из первых методов микробиологического синтеза глутаминовой кислоты был метод ферментативной трансформации α-кетоглутаровой кислоты, использующий высокую глутаматдегидрогеназную активность некоторых микроорганизмов, в частности Bacillus subtilis, Pseudomonas fluorescens и др.
При этом в реакционную систему вводятся: соль аммония, α-кетоглутаровая кислота (или ее соль), буфер, обеспечивающий оптимум р. Н ферментативной реакции, и суспензия клеток, обладающая глутаматдегидрогеназной активностью. Однако, метод не получил развития и был вытеснен экономически более выгодным с использованием растущих культур микроорганизмов. При получении глутаминовой кислоты этим способом в качестве источника углерода можно использовать глюкозу, крахмал, из технических продуктов – мелассу, гидрол (маточник, остающийся после кристаллизации глюкозы). В последние время наиболее активно в качестве углеводного компонента среды используются: углеводороды, этанол, метанол и уксусная кислота.
Из источников азота – соли аммония или мочевина. Концентрация соединений углерода в средах при получении глутаминовой кислоты обычно довольно высокая, до 5 -10 %. Исходная концентрация источника азота – низкая (до 1%) При таком соотношении азота к углероду в среде неизбежно понижение уровня р. Н. Вместе с тем, с одной стороны, такое соотношение ведет к ограниченному росту биомассы продуцентов, а с другой - к накоплению метаболического предшественника глутаминовой кислоты – α-кетоглутаровой кислоты. Мочевина, используемая в качестве источника азота, разлагается уреазой продуцента с выделением аммиака, вступающего в реакцию с α -кетоглутаровой кислотой, образуя глутаминовую кислоту.
Введение раствора мочевины осуществляется автоматически, когда уровень р. Н в среде достигает некоторой контрольной величины. Накопление глутаминовой кислоты происходит только тогда, когда рост Corynebacterium glutamicum закончен. Некоторые продуценты глутаминовой кислоты, например С. glutamicum, способны при изменении условий культивирования накапливать в среде Lглутамин, который, вероятно, образуется из глутаминовой кислоты. Реакция происходит при участии глутаминсинтетазы. Слабокислая реакция, наличие невысоких концентраций биотина и относительно высокая концентрация аммония, а также присутствие ионов Zn 2+ способствует превращению глутаминовой кислоты в глутамин по ходу ферментации.
Получение аминокислот с помощью иммобилизованных клеток и ферментов В последние годы внимание исследователей привлекают методы получения аминокислот с использованием иммобилизованных клеток и иммобилизованных ферментов. Способ имеет ряд преимуществ, в частности, конечный продукт отличается высокой концентрацией и чистотой, нет опасности заражения в ходе реакции посторонними микроорганизмами, в результате синтеза образуются только природные изомеры, имеется возможность осуществления непрерывных технологических процессов.
Микроорганизмы являются основными источниками ферментов, переводимых в иммобилизованную форму. Имея в виду преимущества иммобилизованных ферментов, необходимо учитывать, что они всегда будут дороже растворимых, но их внедрение экономически оправдано при соблюдении даже одного из приводимых ниже преимуществ: - повышается стабильность фермента, обеспечивающая его многократное применение и тем самым сокращение расходов на препарат; - улучшается качество продукта благодаря отсутствию в нем следов фермента и предотвращению нежелательных побочных реакций.
Наиболее широкое распространение имеет ферментативный метод получения кислоты аспарагиновой из фумаровой и аммония благодаря активности фермента аспартазы, катализирующей эту реакцию: аспартаза LФумаровая аспарагиновая + NH 3 кислота Поскольку аспартаза, заключенная в полиакриламидный гель, относительно быстро теряет исходную активность, иммобилизации подвергают микробные клетки, обладающие аспартазной активностью. Хорошим продуцентом аспартазы признаны некоторые штаммы Escherichia coli, клетки которой фиксируются в полиакриламидном геле. Отмечено существенное повышение активности аспартазы клеток Escherichia coli после их иммобилизации.
Липиды – большая группа природных веществ, разнообразных по химической структуре и физико-химическим свойствам. Имеется несколько трактовок понятия липиды и различных схем их классификации, основанных на свойствах этих веществ. Продуценты липидов Из мицелиальных грибов значительные количества липидов образуют представители родов Penicillium, Rhizopus, Fusarium. К липидобразующим дрожжам относят некоторых представителей родов Lipomyces, Rhodotorula, Sporobolomyces и Cryptococcus.
Возможности промышленного получения липидов Вопросам промышленного получения липидов с помощью микроорганизмов уделяется пристальное внимание во всем мире. Микроорганизмы можно использовать для получения фосфолипидов, гликолипидов, незаменимых жирных кислот и препаратов на их основе, необходимых для использования в медицинской практике, сельском хозяйстве, пищевой и других отраслях промышленности. Ряд дрожжей и мицелиальных грибов рассматривается как потенциальные продуценты липидов, в том числе липидов – аналогов некоторым типам растительных масел.
В настоящее время в небольших обьемах получают липиды только с помощью дрожжей, причем липиды являются побочным продуктом основного производства (при получении белково-витаминных концентратов на углеводородах нефти). Получение липидов из мицелиальных грибов, а также бактерий, водорослей и простейших пока не вышло за рамки лабораторных исследований. Одной из причин медленного решения вопросов получения бактериальных липидов следует признать наличие в их составе соединений, токсичных для макроорганизма. С помощью дрожжей возможно получение липидов на различных субстратах: гидролизатах растительного сырья, сульфитных щелоках, углеводородах нефти и др.
Эффективность производства дрожжевого жира во многом связана с количеством основного сырья, необходимого для получения определенной единицы массы дрожжей, и его стоимостью. Кроме того, сырье, на базе которого готовится питательный субстрат для выращивания дрожжей, должно обеспечивать получение липидов, отвечающих требованиям, предьявляемым промышленностью, перерабатывающей липиды в различные другие продукты. Наиболее отработаны технологические схемы получения липидов с помощью дрожжей на гидролизатах верхового торфа малой степени разложения и углеводородах нефти.
Эти схемы различаются тем, что при получении липидов на гидролизатах торфа дрожжевой жир является основным продуктом, а при использовании углеводородов дрожжевой жир – побочный продукт, появляющийся в результате очистки дрожжевой биомассы от остаточных углеводородов. В связи с этим и фракционный состав получаемых этими путями липидов весьма различен: доминирующая фракция углеводородных дрожжей – фосфолипиды, основная фракция при получении липидов на гидролизатах торфа – триацилглицерины.
Процесс получения липидов на гидролизатах верхового торфа малой степени разложения включает несколько основных операций: üПолучение гидролизата торфа; üОтдувка фурфурола и нейтрализация гидролизата до р. Н 5, 5 -6, 0; üВведение в гидролизат минеральных источников питания; üВыращивание дрожжей – продуцентов липидов; üОтделение биомассы и экстракция из нее липидов. Оставшаяся после экстракции липидов биомасса «биошрот» может быть использована в кормлении сельскохозяйственных животных.
Продуцентами липидов на гидролизатах торфа являются штаммы Lipomyces lipoferus, биомасса которых содержит до 40% липидов и более. Из одной тонны абсолютно сухого торфа можно получить 50 -70 кг дрожжевых липидов, содержащих до 70 -75% триацилглицеринов. Кроме гидролизатов торфа для культивирования липидообразующих дрожжей и получения липидов могут быть использованы другие гидролизные среды, например, гидролизаты древесины, или смешанные субстраты древесины и торфа.
Полисахариды (или гликаны) – полимеры, построенные не менее чем из 11 моносахаридных единиц. Они могут состоять из одного или нескольких типов моносахаров. Соответственно различают гомополисахариды и гетерополисахариды. В настоящее время полисахариды микроорганизмов достаточно широко используются в практике. Они находят применение в самых различных сферах человеческой деятельности: в медицине, фармацевтической, пищевой, химической, текстильной промышленности, гидрометаллургии, при добыче нефти и в ряде других областей народного хозяйства.
Полисахариды микроорганизмов в соответствии с локализацией делятся на внутриклеточные и внеклеточные. К внутриклеточным относят обычно полисахариды цитоплазмы, мембран и клеточных стенок, а к внеклеточным – полисахариды капсул, чехлов (пристеночные структуры) и свободной слизи, не прилегающей к клеточной стенке. Иногда к внеклеточным относят также полисахариды, локализованные снаружи от цитоплазматической мембраны. В этом случае в группу внеклеточных попадают и полисахариды клеточных стенок.
В настоящее время биотехнологическая промышленность многих стран выпускает ряд ценных экзогликанов: декстран (Россия и др. ), ксантан (США, Франция), пуллулан (Япония), склероглюкан или «политран» (США), занфло (США), курдлан (Япония). Производство различных полисахаридов не универсально. Для каждого гликана оно имеет свои особенности, определяемые физиологией продуцента, локализацией и физикохимическими свойствами полимера, областью его применения. Получение экзополисахаридов имеет преимущества перед получением внутриклеточных, так как экзогликаны образуются, как правило, в значительно большем количестве, легче отделяются от биомассы и очищаются от примесей.
Однако, при производстве экзогликанов имеются свои технологические трудности. Накопление полисахарида в среде приводит к ограничению доступа кислорода к клеткам. У аэробных микроорганизмов это снижает энергетический баланс и тормозит синтез полисахарида. Повышенная вязкость среды делает невозможным отделение полисахарида от клеток продуцента из нативной культуральной жидкости. Ее приходится разбавлять в десятки раз, а после удаления клеток концентрировать до первоначального или меньшего обьема. Решение этих проблем связано с дополнительными затратами.
Производство наиболее широко применяемого полисахарида – декстрана. Плазмозаменители из декстранов выпускают под разными названиями: клинический декстран, полиглюкин, синкол, макродекс, плазмодекс, хемодекс и др. Для получения декстранов используют штаммы Leuconostoc mesenteroides. Ферментацию ведут на среде с 10 -30% сахарозы, декстраном – «затравкой» , дрожжевым экстрактом, минеральными солями.
Создают условия, способствующие синтезу той формы декстрана, которая используется в качестве плазмозаменителя: линейного глюкана, имеющего более 90% α-1, 6 -связей, с молекулярной массой 60 -80 тыс. Для этого ограничивают содержание в среде Mg 2+, стимулирующего синтез разветвленных декстранов, вносят «затравку» в виде декстрана, имеющего молекулярную массу 20 -30 тыс. Такой акцептор обеспечивает преимущественное образование необходимого полимера. Синтезу биологически активных декстранов способствует, кроме магния, замена сахарозы мелассой. Оптимальное значение р. Н для роста продуцента лежит в пределах 6, 5 -8, 0, а для накопления декстрансахаразы – около 7, 0 (обычно значение р. Н среды задают в интервале 7, 0 -8, 0).
Бактерии расщепляют сахарозу на глюкозу и фруктозу. Фруктоза сбраживается по типу гетероферментативного молочнокислого брожения с образованием молочной и уксусной кислот, маннита и СО 2. Глюкоза полимеризуется в декстран. Процесс идет быстро и продукт можно выделить уже через 24 ч. Декстран выделяют из культуральной жидкости, например, метанолом. Можно, используя определенные приемы, осаждать фракции клинического декстрана с молекулярной массой 60 -80 тыс. даже из смеси декстранов разной молекулярной массы.
Можно осадить весь продукт, растворить его в воде и изолировать требуемый декстран фракционированием. При необходимости выделенный декстран деполимеризуют (ферментативно, термической обработкой, ультразвуком). Для очистки декстран неоднократно растворяют в воде, переосаждают метанолом и фракционируют. Поскольку декстрансахараза в значительной степени выделяется в среду и синтез полимера идет вне клетки, декстраны получают и ферментативным путем. Для этого продуцент выращивается в условиях, обеспечивающих наиболее высокую активность внеклеточного ферментного комплекса. В период максимальной активности декстрансахаразы культуральную жидкость отделяют от клеток и консервируют, снижая р. Н до 5, 0 -5, 2.
При такой кислотности и температуре около 15 0 С декстрансахараза, содержащаяся в культуральной жидкости, сохраняет активность не менее месяца. Ферментационная среда должна содержать сахарозу и декстран – «затравку» . Процесс синтеза продолжается около 8 часов. Ферментативный способ удобнее микробиологического, так как он поддается более надежному контролю и регулированию, позволяет одним только варьированием исходных концентраций сахарозы, фермента и температуры процесса сразу получать декстран необходимой молекулярной массы. Это значительно упрощает и удешевляет последующие технологические операции. Широкое применение в промышленности может найти использование иммобилизованных декстрансахараз.
БЛАГОДАРЮ ЗА ВНИМАНИЕ!
Скачать презентацию НАЦІОНАЛЬНИЙ ФАРМАЦЕВТИЧНИЙ УНІВЕРСИТЕТ Кафедра біотехнології СПЕЦІАЛЬНІСТЬ ТФП Дисципліна
Perv_metabolity.ppt