мяу-мяу Аналитическая токсикология РХТУ 2013 Лекция

«мяу-мяу» Аналитическая токсикология РХТУ, 2013. Лекция № 2 Что ныне снадобьем слывет, то завтра станет ядом. И что ж? Лекарством этот яд опять сочтут больные Рудаки / 941 год/ N. K.

§ Токсикологическая химия. Аналитическая токсикология. Учебник для вузов/ Под ред. Р. У. Хабриева и Н. И. Калетиной— М. : ГЭОТАР-Медиа, 2010. — 752 с. + CD § Токсикологическая химия. Метаболизм и анализ токсикантов. Учебное пособие для вузов/ Под ред. вузов Н. И. Калетиной— М. : ГЭОТАР-Медиа, 2008. — 1016 с. + Н. И. Калетиной CD § Сборник ситуационных задач и упражнений по токсикологической химии. Учебное пособие для вузов / Под ред. Н. И. Калетиной— М. : ГЭОТАР-Медиа, 2007. — 352 с. Материал лекции- см. УЧЕБНИК, гл. 2 + CD N. K.

Этапы развития ТЭ после химического воздействия Шаг 4 – или восстановление ? ? ? N. K.

ТВ- химический фактор нарушения гомеостаза ШАГ 1 – ДОСТАВКА ТВ ОТ МЕСТА ВОЗДЕЙСТВИЯ К МИШЕНИ: ® интенсивность токсического эффекта зависит от концентрации и времени нахождения конечного токсиканта вблизи мишени ® Конечный токсикант - вещество, которое реагирует с эндогенной молекулоймишенью или критически повреждает биологическое окружение, инициируя структурные и/или функциональные нарушения N. K.

Конечным токсикантом может быть: ® индивидуальное вещество (исходное ТВ) ® Метаболит ТВ ® Активная форма кислорода или азота (ROS или RNS), генерированные при биотрансформации токсиканта или эндогенной молекулы-мишени N. K. НК

• Концентрация конечного токсиканта в мишени зависит от относительной эффективности процессов, которые увеличивают или уменьшают его содержание в целевом участке Накоплению токсиканта в мишени способствуют: • процессы абсорбции • диффузии к мишени • реабсорбции • токсикации Биотрансформация в ядовитые продукты называется токсикацией, или метаболической активацией Препятствуют накоплению токсиканта в мишени: • пресистемная элиминация • экскреция • детоксикация N. K.

Токсикация изменяет физико-химические свойства ТВ так, что они приобретают способность взаимодействовать с функциональными группами молекул других веществ, превращая их в: • свободные радикалы (супероксид-анион О 2¯, гидроксил-радикал НО˙) Два пути • нуклеофилы токсического • электрофилы действия • редокс-активные частицы супероксиданион-радикала О 2ˉ 1. Через нерадикальные продукты (ONOO¯ и H 2 O 2 ) 2. Через радикалы ·NO 2 , ·CO 3¯ N. K.

ПРИЗНАКИ МОЛЕКУЛМИШЕНЕЙ ® Наиболее распространенные и токсикологически значимые цели - нуклеиновые кислоты (особенно ДНК), белки и мембраны клеток ® Первой целью для активных метаболитов часто становится фермент, синтезирующий их, и смежные внутриклеточные структуры ® Фактически все эндогенные соединения - потенциальные цели для токсикантов N. K.

N. K.

ШАГ 2 – ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ КОНЕЧНОГО ТОКСИКАНТА С МОЛЕКУЛОЙ-МИШЕНЬЮ После связывания происходит ряд вторичных биохимических реакций, приводящих к: ® дисфункции или ® повреждению, которые проявляются на различных уровнях биологической организации – • молекулярном, • органелльном, • клеточном, • тканевом, • органном • организменном N. K.

ТИПЫ РЕАКЦИЙ 1. НЕКОВАЛЕНТНОЕ СВЯЗЫВАНИЕ обратимо из-за сравнительно низкой энергии связи ® Неполярные взаимодействия, образование водородных и ионных связей типичны для токсикантов, взаимодействующих с мембранными и внутриклеточными рецепторами, ионными каналами и некоторыми ферментами 2. КОВАЛЕНТНОЕ СВЯЗЫВАНИЕ необратимо и полностью повреждает эндогенные молекулы Образование ковалентного аддукта характерно для электрофильных токсикантов. Эти токсиканты реагируют с нуклеофильными атомами, которых много в биологических макромолекулах (белках и нуклеиновых кислотах) Свободные радикалы типа HO˙, NO 2˙, и CI 3 C˙ также могут ковалентно связываться с макромолекулами N. K.

Энергия различных типов химических связей вещества с рецептором

3. Отщепление протонов 4. Перераспределение электронов (ОВР) 5. Энзиматические реакции РЕЗЮМЕ: ® действие большинства конечных токсикантов на эндогенные молекулы зависит от их реакционной способности

Воздействие токсикантов на молекулы-мишени • Химические агенты ингибируют функции молекул-мишеней, блокируя рецепторы, ионные каналы или ферменты • Функция белка нарушается при изменении его конформации. Последняя существенно меняется при взаимодействии с токсикантом Ковалентное связывание и/или окисление субъединиц белков ксенобиотиками может привести к нарушениям: • передачи сигнала • энергетического обеспечения клеток • метаболического гомеостаза • Токсиканты могут нарушать матричную функцию ДНК • Ковалентное связывание химических агентов с ДНК вызывает ошибки при репликации N. K.

Первичная клеточная дисфункция, вызванная токсикантом, не обязательно окончательный результат, всё зависит от функции молекулы-мишени: ® Если молекула-мишень участвует в клеточной регуляции (передаче сигналов), то происходит дисрегуляция экспрессии генов и/или дисрегуляция выполняемой клеткой функции ® Если молекула-мишень вовлечена в процессы клеточного жизнеобеспечения, её повреждение может привести к гибели клетки Воздействие токсиканта на внутриклеточные структуры, обеспечивающие выполнение внешних функций клетки, может изменить активность других клеток и тканей N. K.

Разрушение молекул-мишеней Кроме образования аддуктов токсиканты изменяют первичную структуру эндогенных молекул поперечным сшиванием и фрагментацией ® Сшивки изменяют пространственную подвижность и функциональность молекул • Другие молекулы-мишени восприимчивы к спонтанной деградации после химической атаки • Свободные радикалы C 13 CCOO˙ и HO˙ могут инициировать пероксидное разрушение липидов путём отщепления от них протонов • Это приводит к деградации липидов в клеточных мембранах и образованию свободных радикалов жирных кислот и электрофилов, нарушающих структуру ДНК • Ковалентное связывание ТВ или их метаболитов с белками может приводить к образованию антигенов и развитию иммунного ответа ® N. K.

ШАГ 3 – КЛЕТОЧНАЯ ДИСФУНКЦИЯ И ПОСЛЕДСТВИЯ ТОКСИЧНОСТИ ® Деятельность клеток регулируется сигнальными молекулами, которые активируют определенные клеточные рецепторы Активация рецептора может вести к изменению экспрессии гена и/или химической модификации определенных белков (обычно путём фосфорилирования) ® Рецепторы передают сигнал к регуляторным областям генов и/или к функциональным белкам • Программы, управляющие жизнью клеток, прежде всего, затрагивают экспрессию генов • Программы, контролирующие функции клеток, влияют на деятельность функциональных белков ® Однако один сигнал часто вызывает оба ответа из-за переходов и взаимосвязи сетей N. K. передачи сигналов

СПРАВКА: ® В многоклеточном организме взаимодействие между клетками происходит не только механически, но и коммуникационно ® Существуют многочисленные механизмы передачи и обмена инфомацией между клетками ® Сигнальные молекулы - первичные мессенджеры - пересекают плазмолемму несколькими путями, в том числе, путем изменения ионных каналов N. K.

ССТ - система сигнальной трансдукции - ансамбль ССТ взаимодействующих между собой макромолекул, осуществляющий передачу сигналов по пути, опосредованному G-белками* *Г ТФ-связывающий белок - G-белок ®

Различают три больших класса рецепторов клеточной поверхности: рецепторы, содержащие 4 трансмембранные домена рецепторы, содержащие 1 трансмембранный домен рецепторы, содержащие 7 трансмембранных доменов N. K.

В зависимости от механизма передачи сигнала рецепторы клеточной поверхности подразделяются на 4 класса: ®рецепторы, каталитические рецепторы, проявляющие ферментативную активность рецепторы, регулирующие только ионные каналы сопряженные с G- белками, которые активируют или ингибируют специфические вторичные мессенджеры рецепторы, ассоциированные с цитозольными тирозиновыми протеинкиназами N. K.

ПОВРЕЖДЕНИЕ ПРОЦЕССОВ ВНУТРИКЛЕТОЧНОГО ЖИЗНЕОБЕСПЕЧЕНИЯ: МЕХАНИЗМЫ ТОКСИЧЕСКОЙ КЛЕТОЧНОЙ СМЕРТИ Для выживания все клетки должны: ® синтезировать эндогенные молекулы ® собирать макромолекулярные комплексы, мембраны, клеточные органеллы ® поддерживать постоянство внутренней среды ® производить энергию Агенты, повреждающие эти процессы, ставят под угрозу само существование клетки N. K.

Существуют 3 механизма инициирования клеточной смерти : ® истощение запасов АТФ ® устойчивое повышение концентрации ионов кальция ® избыточная продукция АФК (ROS) и АФА (RNS) N. K.

Некроз Приток ионов Са 2+ в митохондрии вызывает генерацию ROS Са 2+ и RNS, разобщение метаболических процессов, регресс и RNS синтеза АТФ. Эти факторы приводят к увеличению проницаемости внутренней мембраны митохондрий (до размеров частиц в 1500 Д), что позволяет свободный переход протонов в матрикс митохондрии, полностью устраняя мембранный потенциал. Некротизирующие клетки раздуваются и лопаются (лизируются). Другой результат повреждения митохондрий: Другой результат апоптоз Пренеопластические клетки (то есть мутировавшие) обладают большей, чем нормальные клетки, способностью к апоптозу. Облегчение процессов апоптоза препятствует развитию опухоли и наоборот N. K.

• АПОПТОЗ, или ® запрограммированная клеточная смерть, — жестко контролируемый процесс фрагментации и фагоцитоза клеток макрофагами без развития воспалительной реакции • АПОПТИЗИРУЮЩАЯ клетка АПОПТИЗИРУЮЩАЯ сжимается, уплотняется, ядерные и цитоплазматические структуры конденсируются и фрагментируются, образуя апоптотические тельца, которые фаголизируются АПОПТОЗ ЯВЛЯЕТСЯ ПРИРОДНЫМ МЕХАНИЗМОМ ЗАЩИТЫ АПОПТОЗ реализуется АПОПТОЗ разными путями, во всех участвуют каспазы - цистеиновые протеазы N. K.

Шаг 4 – повреждение или восстановление? ? ? Восстановление молекул 1. Некоторые химические изменения (окисление тиоловых белков или метилирование ДНК) могут быть полностью устранены 2. После химического повреждения ДНК и перекисного окисления жиров клетка гидролитически удаляет повреждённую часть и присоединяет новую 3. В некоторых случаях, поврежденная молекула полностью деградирует и необходим повторный синтез Когда восстановление не происходит. . N. K.

Отсутствие или неэффективность процессов регенерации может встречаться на всех уровнях: Некроз происходит при неэффективности механизмов ® молекулярном, восстановления клеток, при ® клеточном, отсутствии апоптоза и митоза. ® тканевом Канцерогенез Фиброз – патологический Химические канцерогены процесс, характеризующийся нарушают: чрезмерным образованием • процессы репарации ДНК, межклеточного матрикса • регуляцию апоптоза ненормального состава. • клеточную пролиферацию Непропорционально Сбой апоптоза: увеличено количество коллагенов и ламинина усиление мутации и клональный рост N. K.

Первое секвенирование генома человека стало триумфальным событием 2000 года, многообещающим в плане расширения и детализации наших знаний в областях биологии человека, медицины и эволюции Куда дальше будет направлено беспрецедентное исследование «Геном человека» ? Мир не просто удивительнее, чем мы себе представляем, — он удивительнее, чем мы можем себе представить Джон Бердон Холдейн Фрэнсис Коллинз, руководитель общественного международного проекта по секвенированию генома N. K.

Автоматизированная линия подготовки образцов ДНК для секвенирования в Центре Геномных исследований института Уайтхеда ГЕН — это отрезок молекулы ДНК ГЕН ® ГЕН — инструкция для выработки ГЕН определенного признака ® С гена делается отпечаток, называемый РНК, РНК которая участвует в синтезе белка ® Белок, являясь структурным элементом тканей организма, обеспечивает обмен веществ, снабжая N. K. человека энергией, питанием ®

® ® ® 1. 2. Понятие ГЕНОМ определяется как совокупность генов, характерных для гаплоидного (одинарного) набора хромосом данного вида организмов Такая формулировка неточна в современном понимании этого слова Основу генома составляет ДНК содержит два вида информации: кодированная информация о структуре молекул –посредников (РНК) кодированная информация о структуре белка (эта информация содержится в генах). Язык генетических записей четырехбуквенный, и если нуклеиновое основание - его "буква", то "слова" - это порядок аминокислот в кодируемых генами белках N. K.

Также в геноме содержатся «инструкции» , которые определяют время и место проявления этой информации при развитии и дальнейшей жизнедеятельности организма (эта информация в основном расположена в межгенных участках, хотя частично и в самих генах) ® Любое нарушение этих инструкций ведет к мутациям, и если они случаются в половых клетках (сперматозоидах или яйцеклетках), мутации передаются следующим поколениям, угрожая существованию данного вида Генная мутация – изменение последовательности нуклеотидов в определенном учаске молекулы ДНК ® Хромосомная мутация- любое нарушение структуры хромосом (делеция, дупликация, инверсия, транслокация) ® N. K.

® Гены занимают очень небольшую часть генома, но при этом составляют его основу. Информация, записанная в генах, – это своего рода «инструкция» для синтеза белков. Гены управляют нашей жизнью - работой каждой клетки и организма в целом ® Для полной характеристики генома недостаточно заложенной в нем информации о структуре белков. Нужны данные об элементах генетического аппарата, которые принимают участие в работе (ЭКСПРЕССИИ) генов, регулируют их проявление на (ЭКСПРЕССИИ) разных этапах развития и в разных жизненных ситуациях ® ЭКСПРЕССИЯ ГЕНА- АКТИВИЗАЦИЯ ТРАНСКРИПЦИИ ГЕНА, В ПРОЦЕССЕ КОТОРОЙ НА СМЫСЛОВОЙ НИТИ ДНК СИНТЕЗИРУЕТСЯ м РНК ® В геноме присутствуют элементы, способствующие его самовоспроизведению (РЕПЛИКАЦИИ), компактной упаковке ДНК в ядре и еще какие–то непонятные пока N. K. еще участки

Итак, ГЕНОМ - совокупность последовательностей ГЕНОМ - ДНК, представленных В ХРОМОСОМАХ ЯДЕР КЛЕТОК определенного вида организмов, включая, конечно, и ГЕНЫ ® В некоторых других структурах (органеллах) клетки также присутствует генетическая информация, необходимая для функционирования организмов. В частности, у всех животных организмов, в том числе и у человека, имеется еще и МИТОХОНДРИАЛЬНЫЙ ГЕНОМ, то есть молекулы ДНК, присутствующие в митохондриях, и содержащие митохондриальные гены ® ® МИТОХОНДРИАЛЬНЫЙ ГЕНОМ человека очень небольшой по МИТОХОНДРИАЛЬНЫЙ ГЕНОМ сравнению с ЯДЕРНЫМ ГЕНОМОМ, РАСПОЛОЖЕННЫМ В ХРОМОСОМАХ, но его вклад в клеточный метаболизм весьма ХРОМОСОМАХ N. K. существенен

Малая часть последовательности ДНК копируется в протеинкодируемую РНК. N. K.

Геном человека — это геном биологического вида Homo sapiens Каждая хромосома содержит сотни генов, разделённых межгенным пространством. Межгенное пространство содержит регуляторные участки и ничего не кодирующую ДНК ® В любой соматической клетке человека 23 пары хромосом , т. е. 46 хромосом : 44 из них не зависят от пола (аутосомные хромосомы), а две — X-хромосома и Y-хромосома — определяют пол (XY — у мужчин или ХХ — у женщин) N. K. ®

Графическое представление нормального человеческого кариотипа Хромосомы в общей сложности содержат приблизительно 3, 2 миллиарда пар оснований нуклеотидов ДНК, в которых по оценкам содержится 20000 -25000 генов

® ® ® Гены неравномерно распределены по хромосомам Каждая хромосома содержит богатые и бедные генами участки Кроме кодирующих белок генов человеческий геном содержит тысячи РНК-генов, включая транспортную РНК (t. RNA), рибосомную РНК, микро. РНК (micro. RNA) и прочие не кодирующие белок РНК последовательности В человеческом геноме найдено множество различных последовательностей, отвечающих за регуляцию гена ПОД РЕГУЛЯЦИЕЙ понимается контроль ПОД РЕГУЛЯЦИЕЙ ЭКСПРЕССИИ ГЕНА (процесс построения матричной ЭКСПРЕССИИ ГЕНА РНК по участку молекулы ДНК). Обычно это короткие последовательности, находящиеся либо рядом с геном, либо внутри гена N. K.

ВЗАИМОСВЯЗЬ ГЕНОМИКИ И ПРОТЕОМИКИ

ПОЛИМОРФИЗМ – варианты последовательностей ДНК, которые распространены в общей популяции с частотой не менее 1% Любые изменения в структуре ДНК ( в хромосомах или митохондриях) ведут к генному полиморфизму На хромосомном уровне генные нарушения выражаются как изменения в числе или структуре хромосом N. K.

Фенотип - признаки, проявляющиеся в результате действия генов в определенных условиях среды , т. е. структурно-функциональные особенности организма Фенотип может быть определен несколькими путями, включающими: ® клинические исследования ® функциональные тесты ® измерения компонентов сыворотки крови ® гистологическую оценку Связывание генной экспрессии с подобными изменениями – ключ к поиску биометок неблагоприятных конечных точек и формирование возможной гипотезы механизма действия N. K.

® Геном определяет возможную структуру метаболома, а метаболом воздействует (положительно или отрицательно) на экспрессию генов

® Развитие токсического эффекта Связывающий рецептор ® ® ® Генная экспрессия Раннее детектирование Модификация протеина Развитие повреждения Аномальная функция органа Стадия заболевания Позднее детектиование ТВ вызывают последовательность событий, которые начинаются с рецептора, сдерживающего или активизирующего движение к генной и протеиновой экспрессии ® м. РНК – предшественники ферментов, измерение их относительного содержания в образцах ткани или клеток, подверженных действию ТВ, показывает потенциальное вовлечение генов в этиологию токсичности N. K. ®

Высокоточные ИЗМЕРЕНИЯ ГЕННОЙ ЭКСПРЕССИИ позволяют распознать механизмы токсичности Это дает возможность: ® содействовать выявлению более эффективных биомаркеров определить частично совпадающие или индивидуальные характеристики генного ответа на введение ТВ ® использовать эти знания для определения срока отравления и оценки риска ® Новая технология ответит на вопросы: насколько различаются клетки в РАЗЛИЧНЫХ тканях в результате ЧРЕЗВЫЧАЙНО РАЗЛИЧНЫХ ответных реакций на введенный токсикант N. K.

Надежды, первоначально возлагавшиеся на секвенирование генома как на начало новой эры в молекулярной медицине, подразумевавшей создание эффективных способов профилактики, диагностики и лечения многих заболеваний, оправдались пока лишь частично…. И ВСЕ-ТАКИ…. . ОПЯТЬ НАДЕЖДА ® Программа «Геном человека» не прекратила своё существование, она лишь меняет ориентацию: от структурной геномики осуществляется переход к геномике функциональной, предназначенной установить, как управляются и работают гены ® Не только отдельные основания в последовательностях генов двух разных людей могут отличаться, но и количество копий крупных фрагментов ДНК, порой включающих в себя несколько генов, может сильно варьировать ® ® Поэтому уже сейчас на передний план выходят работы по сравнению геномов представителей различных человеческих популяций, этнических групп, и, конечно же, здоровых и больных людей N. K.

Геном человека: десять лет спустя ® Геном, вопреки ожиданиям, оказался не простой программой человеческого существа, а гораздо более сложным объектом, и его секвенирование принесло больше вопросов, чем ответов, усложнив биологию N. K. на порядки