Мутации и механизмы репарации ДНК Лекция 5

Мутации и механизмы репарации ДНК Лекция № 5 для студентов специальности «Микробиология»

План лекции: • • • Эволюция взглядов на изменчивость микроорганизмов. Модификационные и мутационные изменчивости микроорганизмов. Методы доказательства мутационной природы изменчивости бактерий. Классификация мутаций. Молекулярные механизмы возникновения мутаций. Механизм действия мутагенов (УФ, радиация, аналоги оснований, алкилирующие агенты, азотистая кислота, акридиновые красители и т. д. ). Мутации, возникающие в процессе репликации ДНК. Механизмы репарации ДНК. Репарационные системы. Прямая репарация. Эксцизионная репарация. Репарация ошибок репликации. Пострепликативная репарация. SOS-репарация.

Мутации • • Различные факторы могут нарушать последовательность нуклеотидов в ДНК и, следовательно, изменять генетическую информацию. Такие изменения первичной структуры ДНК не исправленные репарирующей системой, называются мутациями. Термин введен Г. де Фризом, но на бактерии распространен М. Бейеринком. Причинами мутаций могут быть: повреждение ДНК ультрафиолетом, ионизирующей радиацией, химическими соединениями окружающей среды и, кроме того, ошибки репликации. Генетические мутации ведут к синтезу измененного, дефектного белка. Мутации, затрагивающие регуляторную зону оперона, приводят к нарушению регуляции или прекращению синтеза белка.

Эволюция взглядов на изменчивость микроорганизмов • • Одни ученые полагали, что направленные изменения популяции, включая изменения, вызванные внешней средой во всех или только нескольких клетках популяции, представляют собой прямое приспособление (адаптацию) к действию внешней среды. Другие приписывали главную роль длительным модификациям — это возникающие под действием внешней среды адаптивные изменения, которые, не влияя на наследственные свойства организма, существуют в течение многих поколений уже после того, как вызвавший их фактор внешней среды перестал действовать. Третьи рассматривали изменения бактерий как регулярно повторяющиеся жизненные циклы – т. е. как правильную последовательность «фаз культуры» , где проявление каждой стадии зависит от условий среды. Лишь очень немногие исследователи признавали, что бактериальная изменчивость может заключаться в появлении спонтанных и ненаправленных изменений (мутаций) в одной или нескольких клетках, в дальнейшем подвергающихся отбору.

Модификационная и мутационная изменчивости микроорганизмов • Все наблюдаемые изменения можно разделить на два типа: • проявляющиеся у подавляющего большинства особей в популяции при изменении внешних условий и наблюдаются до тех пор, пока действует фактор, вызвавший эти изменения. Такой тип изменчивости получил название не наследственного, или модификационного, а само явление названо модификацией. Модификация есть результат пластичности клеточного метаболизма, приводящего к фенотипическому проявлению "молчащих" генов в конкретных условиях (например, синтез БТШ). • признаки, которые первоначально возникают как редкие события в популяции особей (с частотой 1 на 104— 1011 клеток). Если измененные особи имеют некоторое преимущество перед неизмененными, выражающееся в повышенной скорости роста или жизнеспособности, они постепенно накапливаются в популяции и вытесняют исходные особи. Такой тип изменчивости был назван наследственным.

Доказательство мутационной природы изменчивости Метод реплик (Дж. И Э. Ледерберг, 1952 г. )

Классификация мутаций

Хромосомные мутации делеция дупликация инверсия транслокация

Генные мутации • • • Значимость нуклеотидных мутаций внутри кодона неравнозначна: замена первого и второго нуклеотида всегда приводит к изменению аминокислоты, третий же обычно не приводит к замене белка. К примеру, «молчащая мутация"- изменение нуклеотидной последовательности, которая приводит к образованию схожего кодона, в результате аминокислотная последовательность белка не меняется. Замена нуклеотида в кодоне может привести к изменению смысла кодона — миссенс мутации, и появлению в белке новой аминокислоты. Если в результате замены нуклеотида кодон превращается в терминирующий — нонсенс мутации, то синтезируется незавершенный белок, так как его синтез прерывается на этом кодоне. Транзиция - состоит в замене одного пурина другим пурином или одного пиримидина другим пиримидином. Если пурин будет замещен пиримидином, или наоборот, такие замены называют трансверсиями.

Физические мутагены • • • К физическим мутагенам относятся: ионизирующее излучение (альфа–, бета–, гамма–, нейтронное и рентгеновское излучение), коротковолновое ультрафиолетовое излучение, СВЧ–излучение, действие экстремальных температур. Одним из наиболее важных физических мутагенов является ионизирующая радиация. Она приводит к образованию в клетке свободных радикалов (молекул с неспаренными электронами), которые исключительно реакционноспособны и могут повредить ДНК. Коротковолновый ультрафиолетовый свет (УФ) приводит к химическим изменениям - образованию тиминовых димеров, когда два соседних тиминовых оснований ковалентно связываются друг с другом. Это приводит к ошибкам при считывании ДНК во время репликации и транскрипции. Образование тиминовых димеров

• образование димеров (тиминовые и цитозиновые димеры –сшивки) • дезаминированного цитозина • сшивки ДНК-белок • двунитиевые и однонитиевые разрывы спирали ДНК двунитиевые разрывы однонитиевый разрыв Т-Т сшивка дезаминирование цитозина

Химические мутагены • К химическим мутагенам относятся самые разнообразные вещества нарушающие структуру и воспроизведение молекул ДНК • Некоторые мутагенные вещества (этилметансульфонат, гидроксиламин, азотистая кислота) — вызывают химическую модификацию ДНК, большей частью специфичную в отношении определенных оснований, изменяя их способность к спариванию с другими основаниями, что приводит к ошибкам репликации, такие мутагены влияют на точность репликации.

• • Этилметансульфонат этилирует преимущественно атом N-гуанина. Образовавшийся 7 -алкилгуанин отщепляется от цепи, в результате чего в ней образуется «пропуск» . При очередной репликации на этом месте часто оказывается «ошибочное» основание. Гидроксиламин. Избирательно аминирует цитозин, что также нарушает принцип комплементарности при репликации ДНК. В результате происходит замена ГЦ → АТ. Нитриты. Осуществляют окислительное дезаминирование гуанина, аденина, цитозина. Также нарушается принцип комплементарности при репликации ДНК. В результате происходит замена АТ → ГЦ. Азотистая кислота вызывает точковые мутации. Например, С превращается в U, который в следующем цикле репликации образует пару с А (вместо G). после чего изменение принимает необратимый характер. Дезаминирование цитозина

• Алкилирующие агенты вызывают алкилирование ДНК (например, метилирование, этилирование и т. д. ). В результате при репликации ДНК нарушается принцип комплементарности, и происходит замена нуклеотидных пар: ГЦ → АТ; ГЦ → ЦГ; ГЦ → ТА • Этил- и метилметансульфонат, • диметил- и диэтилсульфат, этиленимин, • зотистый или серный иприт, • N-метил-N'-нитро-N-нитрозогуанидин • Некоторые из алкилирующих агентов в природе не встречаются, их не распознают ферменты защитных систем. Такие вещества называются супермутагенами (например, N-метил-N-нитрозомочевина).

Аналоги оснований. Это вещества, сходные с «обычными» азотистыми основаниями. Однако они способны образовывать комплементарные пары с разными «нормальными» основаниями. Например, при репликации ДНК напротив гуанина вместо цитозина достраивается 5 -бромурацил (аналог тимина). В дальнейшем напротив 5 -бромурацила достраивается аденин, а напротив аденина – обычный тимин. Этот же процесс может идти и в противоположную сторону. В результате происходят замены: ГЦ → АТ или АТ → ГЦ.

Включение или утрата отдельных пар оснований: Мутагенное действие могут оказывать полициклические ароматические соединения - профлавин и другие акридиновые красители. Например, молекула акридина внедряется между соседними основаниями цепи ДНК и увеличивает расстояние между ними (интеркаляция). Мутация со «сдвигом рамки» :

Биологические мутагены • • • ДНК, Вирусы, Транспозоны способны «перепрыгивать» из одного участка генома в другой. В случае внедрения транспозона в какойлибо структурный ген хромосомы нуклеотидная последовательность этого гена будет нарушена и генетическая информация не сможет транслироваться в функционально полноценный полипептид. Возникнет инсерционный мутант.

Устройство систем репарации • В клетках имеются разнообразные "ремонтные бригады", которые следят за сохранностью информации, хранящейся на ДНК. Такие клеточные системы, исправляющие повреждения ДНК, называют системами репарации. • Каждая из систем репарации включает следующие компоненты: фермент, "узнающий" химически измененные участки в цепи ДНК и осуществляющий разрыв цепи вблизи от повреждения, фермент, удаляющий поврежденный участок, фермент (ДНК-полимераза), синтезирующий соответствующий участок цепи ДНК взамен удалённого, Фермент (ДНК-лигаза), замыкающий последнюю связь в полимерной цепи и тем самым восстанавливающий её непрерывность. • •

Прямая репарация • - наиболее простой путь устранения повреждений в ДНК, в котором обычно задействованы специфические ферменты, способные быстро (как правило, в одну стадию) устранять соответствующее повреждение, восстанавливая исходную структуру нуклеотидов.

Фотореактивация (1949) • • • Тиминовые димеры "расшиваются" путем прямой репарации при участии фотолиаз, осуществляющих соответствующее фотохимическое превращение. ДНК-фотолиазы представляют собой группу ферментов, активируемых светом, с длиной волны 300 - 600 нм (видимая область), для чего в их структуре имеется особый светочувствительный центр. Они широко распространены в природе и обнаружены у бактерий, дрожжей, насекомых, рептилий, земноводных и человека. Эти ферменты нуждаются в разнообразных кофакторах (FADH, тетрагидрофолиевая кислота и др. ), участвующих в фотохимической активации фермента.

Выделяют 3 этапа: 1. Фотолиаза распознает и присоединяется к последовательности содержащей пиримидиновый димер. 2. Образование комплекса фотолиаза-ДНК. Комплекс сохраняется до момента освещения видимым светом. 3. 3. Поглощение фотона. Разрыв ковалентных связей между пиримидиновыми кольцами

Репарация алкилирующими агентами (дезалкилирование) • Важную роль в защите от алкилирующих факторов играет фермент О 6 -метилгуанин-ДНКметилтрансфераза (или О 6 -алкилгуанинтрансферазf (AGT, фермент – самоубийца), которая снимает метильную группу с азотистого основания (O 6 -m. G) на один из собственных остатков цистеина

Репарация АР-сайтов • • Голландский ученый Т. Линдал в 1979 году нашел, что при некоторых типах повреждений пуриновых оснований ковалентная связь между основанием и сахаром (гликозидная связь) может рваться. Тогда в молекуле ДНК на месте этих оснований образуется брешь, названная АР-сайтом. Термин приложим также к случаям, когда из ДНК выпадают пиримидиновые основания (термин АР-сайт, таким образом, объединяет все случаи выщепления оснований с образованием и апуриновых и апиримидиновых сайтов). АР-сайты могут репарироваться путем прямой вставки пуринов при участии ферментов, называемых ДНКинсертазами (от англ. insert- вставлять).

Репарация однонитевых разрывов ДНК • • • Еще один тип реакций прямой репарации был обнаружен для однонитевых разрывов ДНК, индуцируемых, например, ионизирующим излучением. При этом с помощью фермента ДНК полинуклеотидлигазы (от англ. ligase – соединять, связывать) происходит прямое воссоединение разорванных концов в молекуле ДНК. У большинства организмов лигазы используют энергию АТФ, и лишь у эубактерий – энергию НАД(+). Интересно, что несмотря на различия в аминокислотных последовательностях и биохимических реакциях между этими двумя классами лигаз, структура аденилирующего домена у них совершенно одинакова. Полинуклеотидлигаза является основным ферментом у E. coli, а высшие организмы производят несколько различных лигаз, имеющих специфические мишени и функции.

Эксцизионная репарация (1964) • • • Существуют более сложные реакции восстановления, напоминающие хирургические вмешательства в структуру ДНК, когда поврежденные участки вырезаются из цепи ДНК (отсюда происходит и термин "эксцизионная репарация", от excision – вырезание), а затем образовавшиеся бреши заполняются неповрежденным материалом. Для эксцизионной репарации необходима вторая (комплементарная) цепь ДНК. Все типы эксцизионной репарации имеют общие этапы: • Распознавание повреждения. • Надрезание нити ДНК (сахарофосфатного остова). • Эксцизия участка, содержащего повреждение. • Репаративный синтез на неповрежденной матрице и лигирование.

• Три основных типа эксцизионной репарации получили свои названия в зависимости от того, какие именно повреждения будут исправляться. Эти типы репарации, несмотря на лежащий в их основе общий процесс вырезания участка ДНК с повреждением, принципиально различаются между собой. • Эксцизионная репарация оснований (BER). • Эксцизионная репарация нуклеотидов (NER). • Мисмэтч репарация(MMR).

Эксцизионная репарация оснований • Бракованное основание удаляется в одиночку или вместе с окружением - участками цепи в 2 -10 нуклеотидов. Так вырезаются модифицированные и поврежденные основания, апуриновые сайты и места с одноцепочечными разрывами.

Ферменты BER • • • Вырезание аномальных азотистых оснований ДНК-N-гликозилазой; Образование АР-сайта, взаимодействует с ферментом АРэндонуклеазой; Экзонуклеаза отщепляет нуклеотиды от поврежденного участка; ДНК-полимераза комплементарно второй цепи заполняет свободное место; ДНК-лигаза сшивает участки.

Эксцизионная репарация нуклеотидов • Даже если ошибка в одном нуклеотиде, удаляется сразу множество нуклеотидов (около 30) в районе повреждения (например, возникновения пиримидиновых димеров или других объемных образований в ДНК, нарушающих структуру спирали).

Ферменты NER • NER-репарацию в клетках E. coli выполняет мультиферментный комплекс, содержащий эндонуклеазы, кодируемые тремя генами: uvr. A, uvr. B и uvr. C (названия генов даны по первым буквам слов ultra violet repair). Комплекс получил название "эксинуклеаза". • Повреждение распознается и выщепляется эксинуклеазой (Uvr. ABCэндонуклеазой). ДНК раскручивается в месте повреждения. Разрез ДНК происходит с 3‘-стороны на 4 нуклеотида и на 8 с 5'-конца от повреждения. Новая цепь ДНК достраивается по матрице неповрежденной цепи ДНКполимеразой. Лигаза сшивает вновь синтезированный конец цепи. • • •

Репарация ошибок репликации • • • ДНК полимеразы обладают следующим свойством: после подстановки очередного нуклеотида в растущую нить ДНК (полимеразный комплекс движется в направлении от 5'-конца синтезируемой нити к 3'OH-концу) делать шаг назад (в направлении от 3' к 5') и вырезать последний нуклеотид, если он некомплементарен нуклеотиду в матричной нити ДНК. Этот процесс исправления ошибок спаривания, или коррекции, иногда не срабатывает, и тогда в ДНК по окончании репликации остаются невырезанными некоторые неправильные пары, остаются мисмэтчи. Ошибки спаривания азотистых оснований во время репликации ДНК происходят достаточно часто (у бактерий один раз на 10 тыс. нуклеотидов). Вскоре после окончания репликации специальные ферменты - метилазы присоединяют метильные группы к аденинам в последовательностях ГАТЦ. Пока они остаются неметилированными, клетки должны успеть отрепарировать мисмэтчи. Мисмэтч-репарация исправляет ошибочно встроенные неповрежденные основания за исключением C–C. Кроме того, эта система репарирует небольшие вставки в одну из цепей ДНК, образующиеся в результате ошибок репликации, длина которых не превышает четырех нуклеотидов. В мисмэтч репарации участвуют ферменты вовлеченные как в BER, так и в NER репарацию, так и специализированные ферменты.

Ферменты мисмэтч-репарации • • • В кишечной палочке этот процесс идет под контролем продуктов четырех генов: Mut. H, Mut. L, Mut. S и Mut. U (Mut. U=Uvr. D=хеликаза II). Процесс начинается с того, что к некомплементарной паре мисмэтча присоединяется белок mut. S. Каждый из белков mut. H распознает участок ГАТЦ и обладает эндонуклеазной активностью, с помощью которой ДНК в этой последовательности может быть надрезана вблизи аденина в неметилированной нити. Надрезы могут быть внесены как в 5'-, так и в 3'-положение относительно аденина. Фрагмент ДНК протягивается через комплекс до тех пор, пока два участка ГАТЦ, расположенные по обе стороны от мисмэтча, удерживаемого белком mut. S, не окажутся захваченными молекулами белков mut. H. Иногда расстояние между участками ГАТЦ может превышать несколько тысяч нуклеотидов. Каждый из белков mut. H распознает участок ГАТЦ и разрывает дочернюю нить около неметилированных аденинов. Белок экзонуклеаза разрушит всю дочернюю нить ДНК до места неправильного спаривания и даже пройдет несколько дальше. Затем бреши должны быть застроены ДНК-полимеразой, а концы воссоединены с помощью лигаз. Разумеется, для высвобождения концов нитей после внесения первичных разрезов молекула ДНК должна быть расплетена (требуется белок хеликаза), нужны также источники энергии в виде АТФ, а для застройки брешей требуются дезоксирибонуклеотидтрифосфаты.

• G g • • - – метилированный аденин G - Материнская цепь с правильными основаниями g - Новая цепь с неправильным основанием • 1 — белок Mut. S распознает неспаренный участок и присоединяется к нему; 2— образование репарационного комплекса- присоединение Mut. H и Mut. L к белку Mut. S; для реакции используется одна молекула АТФ; 3— разрезание ДНК в участке ГАТЦ, расположенных перед и позади сайта мисмэтча; 4—участок ДНК между двумя надрезами и несущий мисмэтч, отсоединен и возникает длинная однонитевая брешь; в расплетании двунитевой д. НК принимают участие хеликазы и расходуются несколько молекул АТФ; 5 - застройка длинной бреши ДНКполимеразой при участии дезоксирибонуклеотидтрифосфатов (d. NTP); 6 — соединение однонитевых разрывов ДНК лигазой. Участок мисмэтча заменяется правильной (комплементарной) парой.

Рекомбинантная репарация • • Существовать с молекулами ДНК, несущими бреши, клетка долго не может. Перед делением клетки в ней образуются две двунитевые молекулы ДНК. Если одна из них несет в какой-либо точке повреждение в одной нити и брешь в противоположной нити, то в другой двунитевой молекуле ДНК обе нити в данной точке будут нормальными. В этом случае может произойти обмен участками ДНК - рекомбинация - неповрежденный участок будет вырезан из нормальной молекулы ДНК и вставлен на место поврежденного участка в другой молекуле, благодаря чему поврежденный генетический материал будет заменен нормальным. Вслед за этим спец. ферменты (ДНК-полимеразы) заделают «бреши» (теперь они смогут это сделать, т. к. в обеих молекулах в данном месте повреждения будут отсутствовать), вновь синтезированные и старые нити будут соединены друг с другом, и исходная структура ДНК будет в результате этого полностью восстановлена.

Если до начала репликации ДНК из нее не были устранены все дефекты, то одна из нитей материнской молекулы будет нести повреждение (красным цветом выделен димер тимина), а комплементарная ей нить будет свободна от повреждений (нити материнской молекулы показаны черным цветом). На поврежденной нити репликация завершится тем, что напротив димера тимина в заново синтезированной нити (зеленого цвета) окажется брешь, в то время как сестринская двойная спираль не будет нести повреждения. После этого может пройти пострепликативная репарация поврежденного участка: 1 - молекулы Rec. A-белка присоединяются к зоне бреши, 2 – под их контролем происходит рекомбинация – участок комплементарной сестринской цепи переносится в район бреши, 3 -бреш застраивается и концы сшиваются лигазой.

SOS-репарация (1974) • Данный механизм занимает особое место среди клеточных репарирующих систем, ее еще называют "ошибочной" репарацией. У бактерии Е. coli ферменты этой системы синтезируются только в ответ на действие на клетку ДНК-повреждающих агентов, например УФизлучения • Основная задача такой системы - модифицировать ДНК-полимеразу и поврежденный участок ДНК таким образом, чтобы не блокировалось действие ДНК-полимеразы. SOS-ответ представляет собой индуцируемую реакцию клетки на критическое состояние, приближающее ее к гибели. При наличии повреждений в клетке перед репликацией индуцируется синтез белков, которые присоединяются к ДНК-полимеразному комплексу и делают возможным строить дочернюю ДНК напротив дефектных звеньев матричной цепи. ДНК оказывается удвоенной, но с ошибкой. Сигналом к запуску служит накопление однонитевых разрывов, индуцирующих активность белка Rec. A, который специфически взаимодействует с белком Lex. A – репрессором для генов репарации. В результате работы репарационных систем происходит уменьшение одноцепочечных разрывов, белок Rec. A теряет активность и механизм SOS-репарации выключается. • •

• • Активируется синтез ко-протеазы гес. А белка Rес А ко-протеаза может узнать и разрезать белок — кодируемый геном Lех. А Lex. A-репрессор почти 20 генов, в том числе оперона Umu. DС. Разрушение Lех. А белков начинает транскрипцию многих оперонов: РНК полимераза связывается с промотором оперона Umu. DС Начинается транскрипция генов Umu. С и Umu. D + комплекс “ДНК полимераза III – гес. А белок” Cинтез дочерней нити ДНК