Муратова Евгения Ивановна Лекция 4 Биотехнология ферментов

Муратова Евгения Ивановна

Лекция 4 «Биотехнология ферментов» 1. 2. 3. 4. 5. 6. Классификация и номенклатура ферментов Поверхностный способ получения ферментов Глубинный способ получения ферментов Методы выделения и очистки ферментов Иммобилизованные ферменты Применение ферментов в пищевых производствах

ОКСИДОРЕДУКТАЗЫ СИНТЕТАЗЫ ИЗОМЕРАЗЫ ТРАНСФЕРАЗЫ Ферменты ГИДРОЛАЗЫ ЛИАЗЫ

ИСТОЧНИКИ ФЕРМЕНТОВ Ткани растений (ананас, папайя, соевые бобы, корни хрена, солод…) Органы и ткани животных (слизистая оболочка желудка, кишечника, поджелудочная железа…) Микроорганизмы (микроскопические грибы, дрожжи, бактерии)

Использование ферментов в промышленности

Номенклатура ферментовых препаратов Амилоризин I II III Г 10 Х IV V I – название основного фермента II – название микроорганизма-продуцента III – окончание IV – способ культивирования: «П» – поверхностный, «Г» – глубинный V – степень очистки концентрирования «Х» – поверхностная культура или культуральная жидкость « 2 Х» – концентрированные растворы ферментов, освобожденные от биомассы « 3 Х» – высушенные препараты « 2 Х» « 10 Х» – осажденные органическими растворителями или солями « 15 Х» – « 30 Х» – очищенные от балластных веществ и других ферментов с использованием различных методов очистки и фракционирования

Ферментативная активность Стандартная единица ферментативной активности – количество фермента, которое катализирует превращение 1 микромоля субстрата за 1 минуту при заданных стандартных условиях. Методы определения ферментативной активности Химические Хроматографические Вискозиметрические Спектроскопические Поляриметрические

Поверхностный способ производства ферментов Продуценты Микроскопические грибы родов Aspergillus, Rhizopus, Penicillium, Trichoderma, Mucor, Fusarium Компоненты питательной среды Пшеничные отруби, зерновая шелуха, солодовые ростки, свекловичный жом, пивная дробина, опилки W =58 -60% Температура культивирования От 30 -32 0 С до 28 -30 0 С Режим аэрации Кондиционированный воздух (влажность от 98 -99% до 92 -94%, температура от 3032 0 С до 28 -30 0 С, расход 0, 1 -0, 2 м 3/ч кг) Продолжительность культивирования От 36 до 52 ч в зависимости от продуцента Содержание ферментов 0, 006 -0, 007% от массы СВ

Глубинный способ производства ферментов Продуценты Компоненты питательной среды Микроскопические грибы родов Aspergillus, Rhizopus, Penicillium, Trichoderma, Mucor, Fusarium, бактерии родов Baccillus, Clostridium Кукурузная мука, крахмал, свекловичный жом, патока, гидролизаты казеина, дрожжей, древесины, липиды, минеральные соли. (содержание СВ от 1, 5 до 15, 5%, p. H от 3, 5 до 8, 5) Температура культивирования 32 -37 0 С для бактерий Режим аэрации 50 -60 м 3/ч м 3 Продолжительнос ть культивирования 26 -320 С для грибов от 24 до 54 ч

Принципиальная технологическая схема глубинного культивирования микроорганизмов 1 – смеситель питательной среды; 2 – стерилизатор в непрерывном режиме потока питательной среды; 3, 4 – теплообменники; 5 – посевные аппараты; 6, 10, 12 – фильтры для очистки воздуха; 7 – ферментер; 8, 9 – насосы; 11 – компрессор.

СХЕМА ПОЛУЧЕНИЯ ПРЕПАРАТОВ С ИНДЕКСОМ П 2 Х, Г 2 Х, П 3 Х, Г 3 Х Культуральная жидкость Поверхностная культура Отделение биомассы Дезинтеграция Вода Экстракция Биошрот Отделение биошрота Хлорид натрия Пар Сушильный агент Выпаривание до 50% СВ Конденсат Препараты Г 2 Х, П 2 Х Сушка Препараты Г 3 Х, П 3 Х Отработанный сушильный агент Биомасса

ДИФФУЗИОННАЯ БАТАРЕЯ

СХЕМА ПОЛУЧЕНИЯ ПРЕПАРАТА С ИНДЕКСОМ П 10 Х Вытяжка фермента Раствор аммиака Уксусная кислота Хладоагент Органические растворители Сепарирование (центрифугирование) Осадок балластных веществ Отработанный хладоагент Сепарирование (центрифугирование) Органические растворители Осаждение Фугат Промывка осадка Сепарирование (центрифугирование) Сушильный агент Сушка Препарат П 10 Х Фугат Отработанный сушильный агент

СХЕМА ПОЛУЧЕНИЯ ПРЕПАРАТА С ИНДЕКСОМ Г 10 Х Фильтрат культуральной жидкости Пар Упаривание до 10 -15% СВ Конденсат Сепарирование (центрифугирование) Органические растворители Осадок балластных веществ Осаждение Отработанный хладоагент Хладоагент Сепарирование (центрифугирование) Вода Бентонит Желатин Сушильный агент Фугат Растворение и стандартизация Сушка Препарат Г 10 Х Отработанный сушильный агент

СХЕМА ПОЛУЧЕНИЯ КРИСТАЛЛИЧЕСКИХ ФЕРМЕНТНЫХ ПРЕПАРАТОВ Г 15 Х, Г 20 Х, П 15 Х, П 20 Х Вода Активированный уголь Растворение I Центрифугирование I Осадок балластных веществ Ацетат кальция Сульфат аммония Высаливание I Фугат Центрифугирование II Вода Растворение II 1

1 Центрифугирование III Диализ Риванол Примеси Осаждение I Центрифугирование IV Риванол Осадок Осаждение II Центрифугирование V 2 Фугат

2 Бентонит Ацетатный буфер Растворение и осветление Фильтрация I Ацетон Хладоагент Осаждение III Центрифугирование VI Раствор ацетата кальция Растворение 3 Осадок Отработанный хладоагент Фугат

3 Фильтрация II Хладоагент Ацетон Осаждение IV Центрифугирование VII Сушильный агент Сушка Кристаллы α - амилазы Осадок Отработанный хладоагент Фугат Отработанный сушильный агент

Схема очистки глюкоамилазы Стадия очистки Общее кол-во белка, мг Глюкоамилазная активность Общая, ед. (Е) Исходная культуральная жидкость Отделение биомассы, концентрирование, отделение балласта Осаждение ацетоном, растворение в воде Ультрафильтрация 13600 28500 Удельная Е/мг 2, 1 11100 25600 2040 Выход Степень % очистки 100, 0 1, 0 2, 3 90, 0 1, 1 19800 9, 7 69, 5 4, 6 1610 18200 11, 3 64, 0 5, 4 Хроматография на ДЭАЭ-целлюлозе Ультрафильтрация 298 15000 50, 4 52, 5 24, 5 250 13450 54, 0 47, 2 25, 7 Гель-фильтрирование через акрилекс П-100 Обессоливание, лиофилизация 140 11400 76, 5 40, 5 36, 5 92 7150 77, 0 25, 0 37, 0

ВИДЫ ИММОБИЛИЗИРОВАННЫХ ФЕРМЕНТОВ Иммобилизованные ферменты Связывание Включение в капсулирующий материал Включение в матрицу Е Е Ковалентное связывание Адсорбция Микрокапсулирование с носителем Е Е Е с другими ферментами Е Е Е решетка Е Е мембрана носитель Е Е Е

Схема иммобилизации фермента химическим методом + + Носитель Вставка Фермент Иммобилизованный фермент

Носители для иммобилизованных ферментов Требования к носителям n n n n Высокая химическая и биологическая стойкость Высокая механическая прочность Возможность формования в виде гранул, пластин, мембран, трубочек и др. Высокая гидрофильность Легкость активации фермента, связанного с носителем Способность носителя к максимальной нагрузке Низкая стоимость Природные и синтетические носители n n Природные: целлюлоза, декстран, агароза, каррагинин, альгинаты, хитозан, липосомы, силикагель, глины и др. Синтетические: полиуретан, полиакриламид, дивинилбензол, ПАВ, керамика, оксиды металлов и др.

Применение ферментных препаратов в пищевой промышленности Ферменты Продуценты Назначение Амилазы Aspergillus oryzae, Bacillus subtilis, Bacillus mesentericus Протеазы Липазы Aspergillus terricola, Bacillus subtilis Снижение вязкости теста, осахаривание заторов Тендеризация мяса, получение рыбных гидролизатов Пектиназы Aspergillus awamori, Aspergillus foetidus, Clostidium pectinfermentans Глюкоизомераз ы Aspergillus awamori Целлюлазы Trichoderma viride Осветление вин, соков Получение глюкозофруктозных сиропов из крахмала Осахаривание заторов, биодеградация отходов пищевых продуктов

Ферменты в производстве пива Солод α–амилаза глюкоамилаза β-глюканаза пуллуланаза протеаза Помол Затор Несоложеные добавки Фильтрация затора Варка сусла Комплекс α–амилазных ферментов Осветление и охлаждение сусла Глюкоамилаза пуллуланаза грибковая α–амилаза β-глюканаза Брожение Фильтрация Пастеризация и розлив Папаин протеазы